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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：孟庆文许曼黄立平邵玉乐曾为俊王辉鲁国涛刘长明陈洪岩中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室150069哈尔滨

猪圆环病毒2型(PCV2)为环状单链DNA病毒，是引起PMWS的主要病原，导致严重的免疫抑制，给猪业生产造成重大的经济损失.RIG-Ⅰ是细胞质RNA传感器，除识别病毒RNA外，还能检测DNA病毒的入侵.为探究RIG-Ⅰ在PCV2感染诱导的RIG-Ⅰ信号通路... 详细信息

猪圆环病毒2型(PCV2)为环状单链DNA病毒，是引起PMWS的主要病原，导致严重的免疫抑制，给猪业生产造成重大的经济损失.RIG-Ⅰ是细胞质RNA传感器，除识别病毒RNA外，还能检测DNA病毒的入侵.为探究RIG-Ⅰ在PCV2感染诱导的RIG-Ⅰ信号通路、Ⅰ型干扰素及炎性细胞因子中的作用，本研究分别将30只8周龄野生型(WT)ICR雌鼠与30只RIG-Ⅰ-/-小鼠各随机分成两组(感染组和对照组)，腹腔接种PCV2a/LG株，在接种后第3、7、14、21和28 d分别测量小鼠体重，采集小鼠肺、脾组织.

关键词： RIG-Ⅰ PCV2 基因敲除小鼠天然免疫

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利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴定

利用CRISPR/Cpf1技术构建HEK293细胞DDX21基因稳定敲除株及功能鉴...

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛王辉曾为俊邵玉乐许曼陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能.设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western印迹、细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定... 详细信息

利用CRISPR/Cpf1基因编辑技术构建DDX21基因稳定敲除的细胞株,并检测其生物学功能.设计、构建靶向DDX21基因向导RNA表达载体,与Cpf1表达载体共转染HEK293细胞,通过流式筛选、基因测序、Western印迹、细胞增殖能力检测鉴定细胞株;荧光定量PCR检测病毒感染后模式识别受体(TLR-3、TLR-7、MDA-5)、Ⅰ型干扰素、IL-6以及抗病毒蛋白OAS mRNA水平表达情况.结果显示：成功筛选到两株DDX21基因敲除的细胞株,蛋白免疫印迹显示DDX21蛋白不表达;与野生型(Wildtype,WT)相比形成细胞单层的时间明显延长(P＜0.01);H9N2亚型禽流感病毒感染实验表明：模式识别受体TLR-3、MDA-5的mRNA表达水平上调,TLR-7表达水平无明显差异,IfN-α、IfN-β、IL-6及抗病毒蛋白OAS的mRNA表达水平下调,表明DDX21基因敲除阻断了DDX21-TRIf-MyD88信号通路;TCID50测定结果显示,差异最高可达到WT的3.01倍,表明DDX21基因敲除后流感病毒复制增加.本研究利用CRISPR/Cpf1系统获得两株DDX21基因稳定敲除的HEK293细胞株,为深入研究DDX21基因功能、病毒感染的天然免疫应答和调控研究奠定了基础.

关键词： DDX21基因 H9N2亚型禽流感病毒 CRISPR/Cpf1 HEK293细胞基因敲除

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疱疹病毒逃避宿主递呈抗原性多肽的几种策略

疱疹病毒逃避宿主递呈抗原性多肽的几种策略

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：佟相慧陈洪岩韩凌霞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

疱疹病毒是个古老而庞大的家族，为了对抗宿主的抵御进化出了独特的针对抗原递呈途径的免疫逃避机制，主要靶向抗原处理相关转运体(TAP)和MHCⅠ类分子。不同疱疹病毒可能采取相同的策略，而同一疱疹病毒也可能有多种方式。本文就目前已... 详细信息

疱疹病毒是个古老而庞大的家族，为了对抗宿主的抵御进化出了独特的针对抗原递呈途径的免疫逃避机制，主要靶向抗原处理相关转运体(TAP)和MHCⅠ类分子。不同疱疹病毒可能采取相同的策略，而同一疱疹病毒也可能有多种方式。本文就目前已报道的疱疹病毒针对TAP介导的病毒肽转运过程和MHC Ⅰ类分子介导的病毒肽递呈过程的干扰，做一简单综述，希望对其他尚未阐明免疫逃避机制的疱疹病毒的研究有所帮助。

关键词：疱疹病毒抗原处理相关转运体(TAP) 主要组织相容复合体(MHC)Ⅰ类分子免疫逃避

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STAT3在猪流行性腹泻病毒感染的作用及机制初步探索撤回

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中国预防兽医学报 2018年

作者：杨丽君郭龙军张健许嘉宇张璐冯力陈洪岩王玉娥中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物与比较医学团队/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

为探究信号传导及转录激活因子3（STAT3）在猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染过程中的作用,本研究采用STAT3特异性si RNA处理HEK293和IPEC细胞,作用24 h后,通过荧光定量PCR和western blot检测结果显示其能够明显降低STAT3的m RNA水平和蛋... 详细信息

为探究信号传导及转录激活因子3（STAT3）在猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染过程中的作用,本研究采用STAT3特异性si RNA处理HEK293和IPEC细胞,作用24 h后,通过荧光定量PCR和western blot检测结果显示其能够明显降低STAT3的m RNA水平和蛋白水平;在此条件下接种PEDV,通过荧光定量PCR检测,显示当STAT3的m RNA水平降低时能够显著抑制PEDV的RNA水平,western blot实验结果也显示抑制STAT3内源性表达能够显著抑制PEDV复制。为进一步研究STAT3的作用机制,采用STAT3特异性si RNA处理这两种细胞,24 h后经过荧光定量PCR检测发现敲低STAT3后,干扰素刺激基因Mx A、ISG15以及IfN-β,IfN-λ的m RNA水平均显著升高。本研究对于进一步阐明STAT3参与PEDV感染引发的IfN抗病毒反应提供了实验依据。

关键词： STAT3 PEDV IfN

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CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛张子博田璐李昂陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的Df-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋... 详细信息

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的Df-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋白的阳性细胞,T7E1酶切法选择高效的敲除载体,TA克隆测序法评估其介导DDX21基因敲除的效率.结果：结果表明4个gRNA序列正确插入表达载体中;T7E1酶切结果显示Cpf1/gRNA1基因靶向敲除活性最高,TA测序分析发现其敲除活性为33.3％.结论：本研究初步建立了CRISPR/Cpf1系统介导的基因编辑技术,结果表明CRISPR/Cpf1能够稳定介导鸡Df-1细胞上的基因组编辑,这为进一步揭示DDX21基因功能、建立DDX21基因敲除的细胞系和鸡体模型提供了理论基础和科学依据.

关键词： CRISPR/Cpf1 基因敲除 Df-1细胞 DDX21

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我国传染性法氏囊病病毒新型变异株分析研究

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中国预防兽医学报 2019年第11期41卷 1164-1169页

作者：范林进王雨龙吴甜甜李凯姜楠高玉龙高立刘长军崔红玉潘青张艳萍刘玉凤孙先本刘俊启王笑梅祁小乐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150069 世界动物卫生组织传染性法氏囊病参考实验室黑龙江哈尔滨150069 法国诗华动物保健公司北京100102 江苏高校动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心江苏扬州225009

近期非典型传染性法氏囊病(IBD)给养禽业带来了新的威胁,本研究团队率先鉴定发现其病原为IBDV新型变异株。为了解该IBDV新型变异株流行规律和致病特点,本研究对2018年9月~2019年6月分离自黑龙江、辽宁、河北、山东、江苏、浙江、云南7... 详细信息

近期非典型传染性法氏囊病(IBD)给养禽业带来了新的威胁,本研究团队率先鉴定发现其病原为IBDV新型变异株。为了解该IBDV新型变异株流行规律和致病特点,本研究对2018年9月~2019年6月分离自黑龙江、辽宁、河北、山东、江苏、浙江、云南7个省的32个IBDV代表株的VP2基因高变区进行了遗传演化分析,结果显示,IBDV新型变异株虽然属于变异株分支,但却不同于美国早期变异株,其形成了一个独立的亚群。动物回归试验结果显示,IBDV新型变异株不致死鸡,但造成其中枢免疫器官法氏囊严重萎缩,B淋巴细胞崩解坏死,复制出了非典型IBD的症状。本研究测定了IBDV新型变异株的最低致病剂量,并依据病毒自身特殊性状,首次提出用法氏囊半数萎缩量(BAD50)作为IBDV新型变异株的病毒效价单位。本研究为IBDV新型变异株的流行规律监测和综合防控提供了数据支撑。

关键词：非典型传染性法氏囊病传染性法氏囊病病毒新型变异株法氏囊半数萎缩量

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利用重组慢病毒载体共表达Cas9-sgRNA构建TLR4基因敲除Df1细胞系

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中国兽医科学 2018年第8期48卷 958-964页

作者：庞中兵王伟刘赛宝王辉陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR... 详细信息

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染禽Df1细胞。流式细胞仪分选、测序验证了在家禽Df1细胞系成功敲除了TLR4基因。然后利用GV393慢病毒表达载体,构建了CAG启动子启动Cas9的共表达载体Lv-CAG-Cas9-U6-sg RNA。通过转染、流式分选、培养单细胞克隆、靶基因组测序以及Western-blot检测,筛选获得1株TLR4基因敲除的Df1细胞系。结果表明,TLR4基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。本研究验证了共表达Cas9和sg RNA可以在禽源细胞系实现基因编辑,为利用重组慢病毒共表达Cas9和sg RNA策略探索构建敲除鸡模型研究奠定了理论基础和科学依据,也为研究禽TLR4基因功能、家禽天然免疫应答机制提供了细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9 Df1细胞系 TLR4 慢病毒表达载体基因敲除

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鸡OV启动子表达HA对禽流感病毒攻击提供完全保护

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中国生物工程杂志 2018年第7期38卷 67-74页

作者：李亚芳赵颖慧刘赛宝王伟曾为俊王金泉陈洪岩孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGfP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽... 详细信息

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGfP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体pOV_（1.1k）-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及HA试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPf鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以10~6EID_（50）H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPf鸡,免疫组100%存活,无排毒现象,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPf鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护;为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白奠定了基础。

关键词：鸡卵清蛋白启动子 HA 禽流感病毒免疫保护输卵管生物反应器

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天津地区猪链球菌9型分离株致病性的研究

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中国兽医科学 2019年第11期49卷 1397-1405页

作者：董志民李秀丽田向学杨春蕾燕晓翠谭世旭张万江刘思国鄢明华天津市畜牧兽医研究所天津300381 农业部兽用药物与诊断技术天津科学观测实验站天津300381 天津市畜禽健康养殖技术工程中心天津300381 天津市宁河区芦台第一中学天津301500 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室黑龙江哈尔滨150069

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌... 详细信息

猪链球菌是引起人和动物发生猪链球菌病的主要病原,给养猪业带来巨大的经济损失,并严重危害人类公共卫生安全。本实验室从天津地区212个养猪场送检的470份临床病料中分离鉴定出8株9型猪链球菌,通过昆明小鼠LD50测定试验、PCR方法分析菌株携带的主要毒力基因、黏附力试验和溶血性试验等,对分离株的致病能力、基因特性、黏附能力和溶血能力等进行了研究。结果显示,8株9型猪链球菌分离株对昆明小鼠的LD50差异较大,最小值6.4×10^6 CfU/mL,最大值为5.7×10^8 CfU/mL;受试菌株中gdh、cps9J、gapdh、fbps、orf2、mrp、sly和ef基因的检出率依次为100.0%、100.0%、62.5%、50.0%、37.5%、0.0%、0.0%和0.0%,分为5种毒力基因型,毒力基因型与菌株对昆明鼠的致病能力无直接关系。8株9型猪链球菌对PK-15细胞均具有黏附作用,黏附能力为1.2×10^3~3.9×10^4CfU/mL,其中CHTJS55菌株最强,CHTJS9-ZL次之,CHTJS72S最弱。溶血性试验结果表明,随着孵育时间的增长,各菌株的溶血能力均增强,且孵育3 h时,CHTJS41菌株的溶血能力最强,CHTJS70菌株最弱。上述研究结果为临床制定合理、有效的猪链球菌病防控措施以及候选疫苗株的筛选提供了参考依据。

关键词：猪链球菌9型致病性黏附能力溶血性毒力基因

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我国职业人群对布鲁菌病防控的认知情况及影响因素分析

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中华地方病学杂志 2018年第9期37卷 716-720页

作者：刘平曾恒刘春国王靖飞高璐徐全刚李娟康京丽孙向东中国动物卫生与流行病学中心青岛266032 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

目的掌握我国羊养殖人员和基层兽医对布鲁菌病（简称布病）防控相关的知识、态度和行为（知信行）情况，分析影响知信行水平的关键因素。方法 2017年3 - 9月，在我国7个省份选取1 067名羊养殖人员和401名基层兽医作为研究对象，进行问... 详细信息

目的掌握我国羊养殖人员和基层兽医对布鲁菌病（简称布病）防控相关的知识、态度和行为（知信行）情况，分析影响知信行水平的关键因素。方法 2017年3 - 9月，在我国7个省份选取1 067名羊养殖人员和401名基层兽医作为研究对象，进行问卷调查。用百分比描述知信行的每个条目，将每个调查对象的知信行总分转化成百分制，采用两独立样本的非参数检验比较不同群体的知信行水平差异。结果羊养殖人员和基层兽医中，对布病防控相关的知信行整体认知率分别为64.2%和80.1%。另有17.3%（185／1 067）羊养殖人员和12.2%（49／401）基层兽医未听说过或不了解布病。两类从业人员对布病防控相关知识的知晓率分别为62.6%和79.0%，其中75.8%的羊养殖人员和83.8%基层兽医对布病防控持积极态度，54.1%和77.6%对布病防控有较好的行为习惯。未来希望获取布病防控相关信息的途径中，电视的占比上升幅度最大，其次是网络和广播。在羊养殖人员中，来自于一类地区，年龄≤45岁，文化程度在初中及以上，养殖年限〈 5年及家中羊群感染过布病者，具有更高的知信行水平（U = 4.85、3.08、3.29、2.20、6.62，P 〈 0.05或〈 0.01）。在基层兽医中，文化程度为大专及以上者具有更高的知信行水平（U = 4.29，P 〈 0.01）。结论我国羊养殖人员和基层兽医对布病防控相关知识和行为仍需提高和加强，在宣传方式改进，宣传内容和形式优化，新媒体运用等方面有待进一步改进。

关键词：布鲁杆菌病职业人群认知影响因素

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