D-阿洛酮糖3-差向异构酶的功能表征及其高活性突变体的高通量筛选

作     者：高鑫 杨锋 毛淑红 路福平 秦慧民 

作者机构：工业发酵微生物教育部重点实验室 天津科技大学生物工程学院 工业酶国家工程实验室 

出 版 物：《微生物学通报》 (Microbiology China)

年 卷 期：2025年

核心收录：

学科分类：081704[工学-应用化学] 081705[工学-工业催化] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 080502[工学-材料学] 070303[理学-有机化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 0703[理学-化学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

基　　金：国家重点研发计划(2022YFC2104901) 国家自然科学基金(32372279) 天津科技大学优秀博士学位论文创新资助项目(YB2023005) 

主　　题：D-阿洛酮糖 D-阿洛酮糖3-差向异构酶 定向进化 超高通量筛选 

摘      要：【背景】稀少糖D-阿洛酮糖(D-allulose)是一种理想的低能量甜味剂替代品，其在食品加工和医疗健康领域具有广泛的应用前景。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-allulose 3-epimerase， DAEase)是生物法催化D-果糖异构化生成D-阿洛酮糖的关键酶。【目的】基于酶数据库进行新酶基因的挖掘，拓宽DAEase的酶库资源，并结合理性设计筛选获得催化性能优良的新型DAEase酶分子。【方法】将来源于氧化微杆菌(Microbacterium oxydans) 的新酶基因 (MoDAEase)构建重组表达系统，研究该酶的酶学性质，通过分子结构模型预测，理性设计突变热点氨基酸，结合高通量筛选平台筛选潜在的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体。【结果】重组目标蛋白实现可溶性表达，酶最适反应条件为60 ℃，pH 8.0，且在40-60 ℃及pH 6.5-8.5条件下具有较好稳定性。筛选获得催化效率提高5.35倍的优势突变体M110S/P249G，且用于转化100、300、及500 g/L的D-果糖时，均展示出优良的催化性能。【结论】本研究从氧化微杆菌中挖掘得到了一种DAEase的新酶，并筛选得到催化活性显著提高的优势突变体，为酶法合成D-阿洛酮糖提供了理论及实践依据。