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中国动物传染病学报 2024年

作者：王菁李思雨谭磊孙英杰仇旭升廖瑛丁铲宋翠萍广西大学动物科学技术学院中国农业科学院上海兽医研究所上海交通大学农业与生物学院

PTEN（10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）是一种具有特异磷酸酶活性的抑癌基因，可控制多种细胞过程，其功能异常与肿瘤发生发展密切相关，包括细胞增殖、迁移和入侵、维持基因组稳定性、代谢等。为探究鸡源PTEN在鸡马立克氏... 详细信息

PTEN（10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物）是一种具有特异磷酸酶活性的抑癌基因，可控制多种细胞过程，其功能异常与肿瘤发生发展密切相关，包括细胞增殖、迁移和入侵、维持基因组稳定性、代谢等。为探究鸡源PTEN在鸡马立克氏病毒（MDV）致瘤机制中的作用，本研究通过构建带有Flag标签的过表达鸡源PTEN的慢病毒质粒，利用三质粒系统转染HEK-293T包装慢病毒，感染DF1细胞，通过嘌呤霉素筛选，获得PTEN蛋白的DF-1稳转细胞系(PTEN+/+)，蛋白免疫印迹（western blot，WB）验证了PTEN蛋白表达，细胞流式试验和CCK8细胞活力试验结果证实稳定表达PTEN可以减缓DF1细胞周期进程，从而抑制细胞增殖。此外，研究发现MDV 强毒株Md5在该细胞系中病毒复制受到抑制。上述结果表明鸡源PTEN基因成功整合入DF1细胞基因组并能稳定表达，为后续研究PTEN在MDV致瘤机制中的作用提供了重要工具。

关键词： PTEN MDV 稳转细胞系细胞周期

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白介素15蛋白的抗体制备及其在猪繁殖与呼吸综合征病毒活载体中的表达

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中国动物传染病学报 2024年

作者：郭子强李佳乐罗梦唐银保帅文娜李丽薇周艳君童武姜一峰童光志高飞中国农业科学院上海兽医研究所广西大学动物科学技术学院南京农业大学动物医学院扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心上海市兽医生物技术重点实验室

本研究旨在制备IL15多克隆抗体，并使用质粒pCDNA3.1-IL15和重组病毒rPRRSV-IL15进行验证。首先构建原核表达质粒pET-IL15，经IPTG诱导后，利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析，利用纯化后得到的IL15重组蛋白三次免疫兔... 详细信息

本研究旨在制备IL15多克隆抗体，并使用质粒pCDNA3.1-IL15和重组病毒rPRRSV-IL15进行验证。首先构建原核表达质粒pET-IL15，经IPTG诱导后，利用SDS-PAGE对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析，利用纯化后得到的IL15重组蛋白三次免疫兔后制备多克隆抗体。同时，利用反向遗传操作技术将IL15基因插入高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株vHuN4-F112的感染性克隆中，拯救获得能够稳定表达IL15蛋白的重组病毒rPRRSV-IL15。接着，将表达IL15蛋白的质粒pCDNA3.1-IL15转染HEK 293T细胞，rPRRSV-IL15感染MARC-145细胞和PAMs后，用上述制备的抗体进行验证。结果显示，制备的IL15多克隆抗体具有良好的反应性和特异性，能够识别和结合转染了pCDNA3.1-IL15质粒和感染了rPRRSV-IL15重组病毒的细胞中的IL15蛋白，为进一步研究IL15蛋白的生物学功能以及其在免疫调节中的作用奠定了重要基础，重组病毒rPRRSV-IL15也是新型免疫增强型PRRSV弱毒疫苗研制的一种尝试。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒活载体 IL15蛋白多克隆抗体

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猪细小病毒NS1基因编码蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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中国兽医科学 2025年第3期55卷 314-320页

作者：帅文娜郭子强李佳乐罗梦李丽薇周艳君姜一峰童武童光志李兆龙高飞中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 上海市兽医生物技术重点实验室上海200240 福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013

本研究旨在制备PPV-NS1的多克隆抗体,并用猪细小病毒(PPV)和真核质粒pcDNA3.1(+)-NS1-3×Flag进行双重验证。首先将PPV的非结构蛋白编码基因NS1克隆至原核表达载体pETDuet,构建原核质粒pET-PPV-NS1。接着,将原核质粒pET-PPV-NS1转... 详细信息

本研究旨在制备PPV-NS1的多克隆抗体,并用猪细小病毒(PPV)和真核质粒pcDNA3.1(+)-NS1-3×Flag进行双重验证。首先将PPV的非结构蛋白编码基因NS1克隆至原核表达载体pETDuet,构建原核质粒pET-PPV-NS1。接着,将原核质粒pET-PPV-NS1转化至感受态*** BL21细胞中,经由1 mmol/LIPTG诱导以后,通过SDS-PAGE和Western-blot对NS1表达进行检测,结果表明,NS1基因在感受态细胞中得到了良好的表达。其次,将纯化后获得的NS1蛋白采用多点注射的方式对大白兔进行免疫,制备获得针对重组NS1蛋白的多克隆抗体。然后,将真核质粒pcDNA3.1(+)-NS1-3×Flag转染HEK 293T细胞;同时PPV感染ST细胞后收取蛋白样品,用上述制备的NS1多克隆抗体进行验证。结果显示,制备的NS1多克隆抗体具有良好的反应性和特异性。

关键词：猪细小病毒 NS1蛋白多克隆抗体原核表达

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猪细小病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立与应用

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中国兽医科学 2025年第1期55卷 80-85页

本研究通过对猪细小病毒(PPV)1型非结构蛋白NS1基因保守序列进行设计,建立了PPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,实现了对PPV1的快速检测。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品质粒在1.0×10^(10)copies/μL~1.0×10^(4)copies/μL... 详细信息

本研究通过对猪细小病毒(PPV)1型非结构蛋白NS1基因保守序列进行设计,建立了PPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,实现了对PPV1的快速检测。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品质粒在1.0×10^(10)copies/μL~1.0×10^(4)copies/μL范围内具有良好的线性关系,曲线回归方程为y=-3.6186x+42.01,R^(2)=0.99,扩增效率为189%;重复性好,组内与组间变异系数均低于1.0898%;敏感性好,最低检测限为1.0×10^(1)copies/μL;特异性强,不与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、非洲猪瘟病毒发生交叉反应,并用该方法对临床样品与病毒拷贝数进行了检测。表明本研究建立的方法重复性好、敏感性高、特异性强,适用于对PPV进行临床检测与诊断。

关键词：猪细小病毒 NS1蛋白 TaqMan实时荧光定量PCR

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A型塞内卡病毒VP1蛋白的抗体制备及鉴定

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中国兽医科学 2024年第12期54卷 1643-1650页

作者：李佳乐郭子强罗梦唐银保帅文娜李丽薇周艳君姜一峰童武童光志丛雁方高飞中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 南京农业大学动物医学院江苏南京210095 青岛动保国家工程技术研究中心有限公司山东青岛266000

本研究旨在制备A型塞内卡病毒(SVA)VP1的多克隆抗体,并用重组病毒rPRRSV-SVA-VP1和真核质粒pcDNA3.1-VP1-Myc进行验证。首先对VP1序列进行优化分析,合成序列后插入克隆载体中,构建原核表达质粒p ET-VP1,并转化至感受态*** BL21(DE3)细胞... 详细信息

本研究旨在制备A型塞内卡病毒(SVA)VP1的多克隆抗体,并用重组病毒rPRRSV-SVA-VP1和真核质粒pcDNA3.1-VP1-Myc进行验证。首先对VP1序列进行优化分析,合成序列后插入克隆载体中,构建原核表达质粒p ET-VP1,并转化至感受态*** BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导后,获得重组VP1蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备获得重组VP1蛋白的多克隆抗体。此外,利用本团队构建并保存的能够稳定表达SVA VP1蛋白的重组病毒rPRRSV-SVA-VP1感染Marc-145细胞后,用上述制备的VP1多克隆抗体进行验证。结果显示,pET-VP1在大肠杆菌中于37℃经1 mmol/L的IPTG诱导12 h,成功表达约37 ku目的蛋白;Western-blot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别VP1蛋白;间接免疫荧光试验表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别rPRRSV-SVA-VP1感染Marc-145细胞后表达的VP1蛋白和真核质粒pcDNA3.1-VP1-Myc转染至293T细胞后表达的VP1蛋白。上述结果表明,本研究制备的VP1多克隆抗体具有良好的反应性和特异性,为SVA血清学检测方法的建立以及SVA VP1蛋白的生物学功能的研究奠定了基础。

关键词： A型塞内卡病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒 VP1蛋白多克隆抗体原核表达活病毒载体

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猪繁殖与呼吸综合征病毒基因重组的研究进展

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中国兽医学报 2025年第1期45卷 145-152,162页

作者：帅文娜郭子强李佳乐罗梦李丽薇周艳君姜一峰童武童光志高飞中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 上海市兽医生物技术重点实验室上海200240

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要引发母猪流产、死胎、木乃伊胎和仔猪呼吸道症状,自1996年国内首次报道以来,经过20多年的遗传演化,其复杂性显著增加,给养猪业带来了巨大的经... 详细信息

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要引发母猪流产、死胎、木乃伊胎和仔猪呼吸道症状,自1996年国内首次报道以来,经过20多年的遗传演化,其复杂性显著增加,给养猪业带来了巨大的经济损失。近年来,随着各种PRRSV重组病毒的出现,防控这一疫病的难度进一步加大。现全面梳理PRRSV的基因组结构及功能、RNA病毒重组机制、重组的主要类型、流行现状和主要流行毒株的重组情况,以期为深入研究PRRSV的基因重组提供线索,同时为制定科学的防控策略提供理论支撑。

关键词： PRRSV RNA重组重组类型

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非洲猪瘟病毒B602L基因编码蛋白多克隆抗体的制备及其在PRRSV活载体中的表达

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中国兽医科学 2025年第2期55卷 171-181页

作者：罗梦郭子强李佳乐帅文娜李丽薇周艳君姜一峰童武童光志丛雁方韦祖樟高飞广西大学动物科学技术学院南宁530004 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 扬州大学江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心扬州225009 上海市兽医生物技术重点实验室上海200240 青岛动保国家工程技术研究中心有限公司青岛266000

为深入研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的编码基因B602L,本研究根据ASFVSY18株的B602L基因序列(MH766894.3),设计引物合成1593 bp的B602L基因全长序列,构建pCold-TFB602L原核表达质粒。将鉴定正确的原核表达质粒转化... 详细信息

为深入研究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的编码基因B602L,本研究根据ASFVSY18株的B602L基因序列(MH766894.3),设计引物合成1593 bp的B602L基因全长序列,构建pCold-TFB602L原核表达质粒。将鉴定正确的原核表达质粒转化感受态细胞,用IPTG诱导表达重组蛋白B602L并通过SDS-PAGE进行验证和分析。用纯化后的pB602L蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,测定抗体效价并经Westernblot鉴定其特异性。同时基于本实验室前期研究,构建表达B602L基因编码蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)全长感染性克隆。本研究将ASFV B602L基因全长序列插入PRRSVORF1b和ORF2a之间,转染全长感染性克隆质粒后拯救获得重组病毒rPRRSV-B602L,并对其进行病毒学特性分析。利用制备的多克隆抗体与重组病毒和真核细胞表达的蛋白进行Western-blot和IFA验证。结果显示,成功构建pCold-TF-B602L原核表达质粒,诱导表达的重组蛋白pB602L可与His标签单抗和制备的抗pB602L抗体产生特异性反应,其效价为1∶16000;成功构建并拯救出重组病毒rPRRSV-B602L,它与亲本病毒具有相似的病毒学特性。本研究拯救的重组病毒可以稳定表达pB602L蛋白,该抗pB602L多克隆抗体能够特异性识别重组病毒表达的蛋白和真核细胞表达的蛋白,具有良好的特异性和反应原性,为进一步探索pB602L蛋白的功能及研制表达ASFV特异性抗原蛋白的重组PRRSV活载体疫苗提供一定的研究基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 pB602L蛋白多克隆抗体病毒活载体

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苏北地区规模化猪场产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及灭活疫苗效果评估

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微生物学报 2020年第2期60卷 261-272页

作者：杨德鸿张鹏于沛欣任建鸾李德志王娟芳孙建和汤芳戴建君南京农业大学农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095 上海市兽医生物技术重点实验室上海200240

[目的]产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌,本研究通过调查苏北地区规模化猪场ETEC的流行情况,分析其生物学特性,研制具有免疫保护效果的优势血清型菌株的灭活疫苗,以期对苏北地区ETE... 详细信息

[目的]产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌,本研究通过调查苏北地区规模化猪场ETEC的流行情况,分析其生物学特性,研制具有免疫保护效果的优势血清型菌株的灭活疫苗,以期对苏北地区ETEC的防控提供参考。[方法]从苏北地区规模化猪场采集3-30日龄的仔猪新鲜粪样、肛拭子及小肠组织样,分离出ETEC,对分离菌株进行血清型鉴定、耐药性测定、小鼠致病力测定;最后通过动物免疫试验研究优势血清型菌株灭活疫苗对小鼠的免疫保护效果。[结果]从21个规模化猪场采集病料562份,通过PCR鉴定及测序得到141株ETEC;血清凝集试验鉴定出85株菌的O抗原血清型,其中08、0101和0128为优势血清型,占定型菌株的61.2%(52/85),其他血清型包括09、03、020、0148、0149等;分析141株ETEC对14种常见抗生素的耐药情况,得出分离株对新霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、强力霉素、阿莫西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑高度耐药,耐药率均高达80%以上;对恩诺沙星敏感性较高,敏感率达50.4%(71/141);对多粘菌素B和头孢噻肟中介耐药,占比分别为66%(93/141)和51.8%(73/141);多重耐药现象严重,其中10重耐药的菌株占比最大,为19%(27/141);小鼠攻毒试验测得08血清型强毒株YC-6的半数致死量(median lethal dose,LD50)为1.4×10^7 CFU/只,最低致死量(minimum lethal dose,MLD)为3×10^7 CFU/只;08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3制备的单价灭活疫苗对小鼠的保护率均达到100%,因此利用08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3研制二价灭活疫苗,结果显示该二价疫苗对感染不同血清型ETEC小鼠的保护率在83%以上。[结论]本研究通过对苏北地区ETEC的流行病学调查,得出其优势血清型,并研制出针对对优势血清型免疫保护效果较好的二价灭活疫苗,给临床ETEC的监测和防控提供参考。

关键词：产肠毒素大肠杆菌分离鉴定血清型耐药性灭活疫苗

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禽致病性大肠杆菌O1、O2、O78血清型三重PCR检测方法的建立

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南京农业大学学报 2020年第1期43卷 108-115页

作者：王娟芳戴建君姜敏任建鸾李德志张鹏孙建和汤芳南京农业大学动物医学院/农业农村部细菌学重点实验室江苏南京210095 上海市兽医生物技术重点实验室上海200240

[目的]本试验旨在建立一种能同时检测禽致病性大肠杆菌O1、O2和O 783种血清型的三重PCR检测方法。[方法]根据O1、O2和O 783种血清型的特异性基因片段设计并合成引物,分别提取O1、O2和O 78血清型禽致病性大肠杆菌的DNA作为模板,优化三重... 详细信息

[目的]本试验旨在建立一种能同时检测禽致病性大肠杆菌O1、O2和O 783种血清型的三重PCR检测方法。[方法]根据O1、O2和O 783种血清型的特异性基因片段设计并合成引物,分别提取O1、O2和O 78血清型禽致病性大肠杆菌的DNA作为模板,优化三重PCR反应条件,进行特异性和敏感性检测,并对临床模拟样品进行检测。[结果]在三重PCR的25μL反应体系中,dNTP 1.5μL,MgCl 22.5μL,Taq DNA酶0.6μL,O1、O2、O78最佳引物加入量分别为0.6、0.2、0.6μL;最佳退火温度为55.9℃。三重PCR的特异性好,3种血清型之间无交叉反应;对146株不同血清型的大肠杆菌进行检测,准确率为99.32%(145/146),用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽胞杆菌进行特异性检测时,没有出现非特异性扩增。三重PCR敏感性高,以单一血清型DNA为模板时,O1和O2血清型的DNA最低检测限均为0.1 ng·μL^-1,O 78血清型的DNA最低检测限为0.02ng·μL^-1;以O 1、O2和O78混合DNA为模板时,最低检测限为0.05ng·μL^-1。对18份临床模拟样品进行检测,准确率为94.4%(17/18)。[结论]建立了一种能同时检测O1、O2和O783种血清型禽致病性大肠杆菌的三重PCR方法,方法特异性好,敏感性高,适用于临床上禽大肠杆菌病的快速检测。

关键词：三重PCR 禽致病性大肠杆菌血清型特异性敏感性

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非洲猪瘟病毒蛋白的结构和功能研究进展

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畜牧与兽医 2025年第3期57卷 125-134页

作者：罗梦郭子强李佳乐帅文娜李丽薇周艳君姜一峰童武童光志韦祖樟高飞中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 广西大学动物科学技术学院广西南宁530004 扬州大学/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 上海市兽医生物技术重点实验室上海200240

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种在家猪和野猪之间传播的高度传染性和致死性的病毒性疾病,该病的病原体是非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV),致死率高达100%。近年来,ASF疫情严重威胁着我国生猪产业的健康发展... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种在家猪和野猪之间传播的高度传染性和致死性的病毒性疾病,该病的病原体是非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV),致死率高达100%。近年来,ASF疫情严重威胁着我国生猪产业的健康发展。与之前相比,我国的ASFV流行毒株逐渐由ASFVⅡ型强毒株转变为ASFVⅡ型和Ⅰ型的重组毒株。因此,迫切需要开发具有交叉保护效力的有效疫苗来预防ASFV的感染。ASFV的结构复杂,其基因组是一种大型双链DNA分子,大小在170~193 kb,包含150~167个开放阅读框,编码近200种蛋白。这些蛋白具有复杂的结构、功能以及免疫逃逸机制,使ASF疫苗研发困难重重。截止目前,尚未有针对ASF的有效疫苗或治疗药物问世,仍需要全面解析非洲猪瘟病毒蛋白的结构和功能,深入了解病毒感染机制以及病毒蛋白和宿主蛋白的相互作用。本文旨在综述当前关于ASFV相关蛋白的结构和功能的研究进展,以期为有效预防和控制ASF提供科学依据。

关键词：非洲猪瘟病毒结构蛋白非结构蛋白免疫逃避

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