检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：吳雀維中山醫學大學

学位级别：博士

翼状赘片(pterygium)是一种古老而常见的眼部疾病，亦称之为「眼翼」。至今仍未知道其确切的发病原因。一般认为和长期紫外线的曝晒，刺激结膜细胞增生有强烈的相关性。翼状赘片在结膜表面不正常细胞增生之特性与肿瘤细胞极为相似，组织... 详细信息

翼状赘片(pterygium)是一种古老而常见的眼部疾病，亦称之为「眼翼」。至今仍未知道其确切的发病原因。一般认为和长期紫外线的曝晒，刺激结膜细胞增生有强烈的相关性。翼状赘片在结膜表面不正常细胞增生之特性与肿瘤细胞极为相似，组织中p53基因的变化及蛋白表现异常亦与肿瘤组织极为类似。近年来发现与肿瘤形成有关的microRNAs的变化可能也参与了翼状赘片疾病的发展。microRNA是小的非编码RNA，过去的研究指出microRNA经由表现量的差异调控细胞周期的进行，亦调控许多与细胞不正常增生相关的基因表现而参与细胞的癌化，例如ras、Rb、 p53、p21及myc等。但至今仍没有确切的研究结果证实microRNA与翼状赘片形成的相关性，因此本研究收集了120个翼状赘片组织及120个正常的结膜组织，使用免疫组织染色法、及时定量PCR (real-time RT-PCR) 及翼状赘片细胞株模型来确认监测β-catenin蛋白的位置、miR-221、p27Kip1、p53、p53下游的EMT相关蛋白及miR-200a基因表现。研究结果显示miR-221的表达在翼状赘片组有60.0％（72 of 120）显着高於对照组10.8％（13 of 120，p<0.0001）；miR-221表达在β-catenin-nuclear/cytoplasmic-阳性组显着比β-catenin membrane-阳性和阴性组（p=0.001）高。并且发现p27Kip1的基因表达与miR-221表达呈现负相关（p=0.002）。另外，miR-200a的表达在翼状赘片组显着低於对照组（Ratio＜0.5；p =0.015）。miR-200a的表现量与p53蛋白的表达呈正相关（p <0.001），但与下游基因ZEB1和ZEB2的表达呈负相关（ZEB1 p<0.001; ZEB2 p <0.001;）。本研究证实miR-221 / p27Kip1参与翼状赘片的细胞增殖。并且证明p53失去活性可导致miR-200a在翼状赘片的表现量增加，造成下游基因ZEB1 / ZEB2上升及上皮细胞间质转化，促进翼状赘片的发病机制。

关键词：翼狀贅片上皮細胞間質轉化免疫組織染色法及時定量PCR

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作者：张栋栋北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

第一部分EMT相关的LncRNA筛选及功能和机制研究　　长链非编码RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是广泛存在于哺乳动物细胞中的一类蛋白非编码序列，通常由RNA聚合酶Ⅱ转录形成，长度超过200nt。由于缺少有效开放阅读框，很少编码或不... 详细信息

第一部分EMT相关的LncRNA筛选及功能和机制研究　　长链非编码RNA(Long non-coding RNA, LncRNA)是广泛存在于哺乳动物细胞中的一类蛋白非编码序列，通常由RNA聚合酶Ⅱ转录形成，长度超过200nt。由于缺少有效开放阅读框，很少编码或不能编码蛋白。LncRNA能够通过不同的作用机制，如RNA-RNA碱基配对，RNA-蛋白相互作用，RNA-DNA相互作用等，在基因表达调控的各个层面发挥功能，参与染色质修饰、转录调节、剪切加工、RNA稳定性调节等重要过程。研究发现，LncRNA与一系列重大疾病相关，其中以神经性疾病和肿瘤最为突出。　　 EMT即上皮细胞间质转化，是指上皮细胞失去上皮表型转化为间质细胞的复杂过程，在这个过程中，上皮细胞失去自身极性、细胞间连接、获得运动能力，发生EMT的细胞可以离开上皮组织侵入周围组织或向更远端的位置转移。越来越来多的研究表明，EMT在肿瘤的侵袭转移中发挥重要功能，肿瘤细胞通过EMT过程可以侵入周围组织，并通过循环系统的运输，发生远端转移。TGFβ可以通过一系列的信号通路活化EMT相关的转录因子，因此用TGFβ处理细胞可以发生瞬时的EMT过程。　　与肿瘤侵袭迁移相关的LncRNA已有报道但与EMT相关的LncRNA还鲜有报道。在本研究中，我们首先建立了TGFβ1诱导的EMT模型。通过LncRNA芯片对该模型进行分析，筛选EMT相关的LncRNAs。芯片结果显示总共有1383条LncRNAs发生变化，其中表达上调的有722条，表达下调的有661条。按照一定的筛选原则包括变化倍数、表达丰度以及启动子分析等，对其中的23条序列进行Real-time PCR验证，通过多次验证最后选择LncRNA14作为研究目标。LncRNA14位于CDH4基因的3'-UTR区，我们通过Northern blot验证了独立序列的存在。进一步对其功能进行研究发现，无论是瞬时转染还是稳定高表达细胞系，LncRNA14均可以抑制肿瘤细胞的生长和侵袭迁移能力，并明显抑制其克隆形成能力。初步的机制研究发现，过表达LncRNA14能够上调E-cadherin的表达，同时抑制vimentin的表达，提示LncRNA14可能通过经典的通路调控EMT过程。　　综上所述，本文通过芯片筛选了一系列与EMT相关的LncRNAs，并通过Real-time PCR进行了验证。研究发现LncRNA14可以抑制肿瘤细胞的侵袭迁移以及克隆形成等，并对其具体的分子机制做了初步的探索。　　第二部分Gadd45α对自噬的调控及分子机制研究　　 Gadd45a是一种重要的抑癌基因，可被多种应激损伤因素诱导表达，包括:紫外照射、电离辐射、血清饥饿、化疗药物作用等。Gadd45a可诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA损伤修复以及抑制血管形成等。　　自噬是广泛存在于真核生物中的一种溶酶体依赖的降解途径，是细胞存活，生长，分化和内稳态平衡不可缺少的机制。自噬可以通过降解衰老、损伤细胞器和长半衰期蛋白维持细胞稳态，同时也可吞噬细胞内微生物病原体行使天然免疫功能。研究发现，在肿瘤的发生发展中，自噬起着重要的作用。不同肿瘤类型，肿瘤发生、发展的不同阶段，自噬发挥的作用会有所不同。一方面在某些肿瘤的发生过程中，自噬起到抑制肿瘤发生的作用。另一方面一些肿瘤细胞存在高活性的自噬作用，肿瘤细胞利用自噬机制对抗由于快速分裂和供血不足引起的营养缺乏和缺氧。此外，在肿瘤化疗、放疗后，自噬活性增强，以清除因电离辐射、细胞毒性而受损的大分子或细胞器，阻断了线粒体的凋亡信号通路，抑制肿瘤细胞的凋亡，促进肿瘤成活。　　但是Gadd45a作为一种抑癌基因是否通过自噬过程调控肿瘤的发生发展，现在还没有相关的报道。本研究通过western blot以及免疫荧光实验在6株不同的细胞系中证实，Gadd45α能够明显降低细胞内Lc3-Ⅱ的表达和自噬小体的数量。同时在Gadd45a敲除的小鼠中也得到一致的结果。Bafilomyein A1处理细胞发现，Gadd45α主要通过调控自噬小体的形成抑制自噬过程。进一步对其机制进行研究发现，Gadd45α可以影响Beclin1与Vps34的相互作用，从而抑制自噬。通过免疫共沉淀以及GST pull-down实验发现，Gadd45α与Beclin1相互作用从而解离了Beclin1与Vps34的相互作用。片段化实验表明，Gadd45α主要是通过71-81位氨基酸与Beclin1结合。进一步验证试验发现，敲降Beclin1可以消除Gadd45a过表达或敲降引起的自噬的改变。　　综上所述，Gadd45α可以抑制自噬过程，这种调控主要是通过上游抑制自噬小体的形成实现的。Gadd45α可以与Beclin1相互作用，从而解离了Bec

关键词：长链非编码RNA 上皮细胞间质转化肿瘤侵袭 Gadd45α 自噬调控分子机制

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藏红花酸对增生性玻璃体视网膜病变的抑制作用及分子机制研究

藏红花酸对增生性玻璃体视网膜病变的抑制作用及分子机制研究

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作者：王会芳河北医科大学

学位级别：博士

增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是继发于孔源性视网膜脱离、严重的眼外伤或其修复术后发生的一种常见的难治性致盲性眼病。PVR及其引起的视网膜脱离是视网膜脱离复位术后手术失败的主要原因,发病率达5-... 详细信息

增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是继发于孔源性视网膜脱离、严重的眼外伤或其修复术后发生的一种常见的难治性致盲性眼病。PVR及其引起的视网膜脱离是视网膜脱离复位术后手术失败的主要原因,发病率达5-10%。其发病机制包括:暴露于玻璃体腔的视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial,RPE）及神经胶质细胞增殖、移行、间质转化,在视网膜内、外表面及玻璃体腔形成纤维细胞膜并向细胞外分泌胶原纤维,继而纤维细胞膜收缩牵拉引起视网膜皱褶和脱离。PVR患者纤维细胞膜中细胞主要包含RPE、Müller/神经胶质细胞和成纤维细胞。孔源性视网膜脱离发生以后,血-视网膜屏障破坏,RPE暴露于血清中细胞因子,从Bruch膜脱离,细胞间紧密连接破坏并丢失了上皮细胞形态。没有细胞间紧密连接的抑制和在多种细胞因子的双重作用下,RPE细胞发生增殖、迁移、间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）为成纤维细胞样或肌成纤维样细胞,表现为移行、侵袭能力增加,凋亡减少和表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）并分泌细胞外基质。RPE细胞发生EMT在PVR纤维细胞膜的形成中起了非常重要的作用。目前,临床上治疗PVR的主要方法还是玻璃体切割术。但是PVR患者玻璃体切割术后即使视网膜复位,由于复发性视网膜脱离及PVR发病过程中对视网膜的损伤,使得术后视功能恢复有限。因此,修复视网膜脱离一个关键的目标就是预防PVR的发生发展。药物防治PVR一直都受到广泛的关注,但大多局限在基础研究阶段,进入到临床试验阶段的药物目前还不能够有效的防治PVR。这就需要我们继续寻找安全、高效的新药。藏红花酸（crocetin）又名番红花酸或西红花酸,来源于茜草科植物栀子果实,是藏红花柱头的主要有效成分之一,具有多不饱和共轭烯酸结构,属类胡萝卜素物质。它的化学式为C20H24O4,分子量为328.4。除了具有抗肿瘤、抗凋亡、抗炎、抗纤维化的作用外,还能减轻缺血再灌注引起的视网膜损伤,具有多重生物学作用。我们推测藏红花酸抑制细胞增殖、迁移、纤维化的生物学作用能够同样作用于PRE细胞,并抑制PVR的发生发展,同时能够降低视网膜的损伤,保护视功能。因此,本研究首次将藏红花酸应用于PVR防治,拟以RPE细胞和兔眼PVR模型为研究对象,在细胞和体内两个层面上展开研究。在细胞层面观察藏红花酸对RPE细胞增殖、迁移的抑制作用,对TGF-β2诱导发生EMT的RPE细胞的逆转作用,并验证其可能作用的分子机制。在体内首先通过视网膜功能学及组织学的检测验证藏红花酸玻璃体腔注射是否具有眼内毒副作用;而后借助高效液相色谱分析得到藏红花酸在玻璃体腔内药代动力学过程;最后通过玻璃体腔注药,观察藏红花酸对兔眼PVR发生发展的抑制以及对视网膜的保护作用。为临床应用藏红花酸防治PVR提供实验基础和理论依据。第一部分藏红花酸抑制体外培养的ARPE-19细胞增殖和迁移目的:观察藏红花酸对体外培养的ARPE-19细胞增殖和迁移能力的影响。方法:依据加入藏红花酸药物浓度不同,依次将ARPE-19细胞分为:对照组（0μM组）和实验组（50μM组、100μM组、200μM组）。通过CCK-8实验检测藏红花酸对ARPE-19细胞增殖活性的影响;流式细胞术分析藏红花酸对ARPE-19细胞周期的影响;western blot检测不同浓度藏红花酸对ARPE-19细胞增殖相关蛋白PCNA、p53、p21表达的影响;划痕实验和Transwell小室两种方法来验证藏红花酸对ARPE-19细胞迁移能力的影响。结果:藏红花酸即使在低浓度（50μM）短时间（24h）内对ARPE-19细胞增殖具有抑制作用（P<0.05）,而且这种抑制呈现浓度和时间依赖性;流式细胞术细胞周期分析表明藏红花酸将细胞阻滞在G1期,使其无法进入S期而抑制细胞增殖;western blot蛋白检测发现50μM藏红花酸即能诱导细胞p53、p21表达升高（P<0.05）,200μM藏红花酸能够显著升高p53及其下游蛋白p21的表达（P<0.01）并抑制PCNA的表达（P<0.01）;划痕实验和Transwell小室结果一致,50μM药物组对细胞迁移能力无影响,100μM和200μM药物组细胞创伤愈合能力和穿膜细胞数量较对照组明显下降。结论:藏红花酸通过将ARPE-19细胞周期阻滞在G1期,上调p53及其下游p21的表达并抑制PCNA的表达来抑制细胞增殖,同时抑制ARPE-19细胞水平方向和垂直方向的迁移能力。第二部分藏红花酸通过p38抑制TGF-β2介导的ARPE-19细胞EMT目的:观察藏红花酸在体外能否抑制TGF-β2介导ARPE-1

关键词：藏红花酸增生性玻璃体视网膜病变视网膜色素上皮细胞上皮细胞间质转化转化生长因子-β2 药代动力学

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宫颈癌干细胞的分选及放疗抵抗机制的研究

宫颈癌干细胞的分选及放疗抵抗机制的研究

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作者：刘红河北医科大学

学位级别：博士

宫颈癌是女性生殖系统最高发的恶性肿瘤之一,全世界每年有将近30万的患者死于宫颈癌,我国宫颈癌的发病率位居世界第二。目前,宫颈癌的治疗方法主要有手术、放疗和化疗三种。放射治疗因其广泛的适应症而成为宫颈癌治疗的重要方法。除患... 详细信息

宫颈癌是女性生殖系统最高发的恶性肿瘤之一,全世界每年有将近30万的患者死于宫颈癌,我国宫颈癌的发病率位居世界第二。目前,宫颈癌的治疗方法主要有手术、放疗和化疗三种。放射治疗因其广泛的适应症而成为宫颈癌治疗的重要方法。除患者存在严重的肝肾功能损伤以及造血功能障碍外,各期宫颈癌患者均可接受放射治疗,对于中晚期、复发或者无法手术的患者,放射治疗则为首选。然而,由于患者个体体质的差异以及肿瘤的异质性,不同患者对放射治疗的反应不同,存在放疗敏感性和放疗耐受性差异,导致放疗的效果不同。据统计,有大约30～50%的宫颈癌患者在最初治疗结束后3年至5年内会面临复发和转移。有研究表明,放疗耐受是宫颈癌治疗失败并出现复发转移的重要原因。然而,到目前为止,产生放疗抗拒的机制尚不明确。如果能够阐明宫颈癌放疗耐受性的机制不仅可为宫颈癌个体化治疗的设计提供理论依据,也可为开发逆转宫颈癌放疗耐受的治疗手段提供新的思路,因此具有重要的理论意义和实际应用价值。目前认为肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC)是肿瘤组织中数量极少的一部分细胞,具备自我更新和多向分化潜能,以及表达干细胞表面标志物等特性。研究表明,在多种实体瘤包括宫颈癌中已经发现有肿瘤干细胞存在。但是何为宫颈癌干细胞的表面标志物尚未明确,因此,有关明确宫颈癌干细胞的表面标志物及如何分离和鉴定宫颈癌干细胞方面的研究一直备受关注。上皮间质转化(Epithelial–mesenchymal transition,EMT)是指上皮表型与细胞粘附分子表达的缺失,同时获得间质分子、成纤维细胞或间充质细胞表型及迁移能力。肿瘤细胞可以通过EMT的形式向间质细胞转化,侵入淋巴管和血管,从而发生转移。在种植部位,癌细胞还可通过间质细胞向上皮细胞转化(mesenchymal–epithelial transition,MET)重建细胞骨架及细胞间的粘附复合体,形成转移灶。与EMT相关的信号转导通路可以增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力和抗凋亡能力。越来越多的研究表明在肿瘤细胞放疗抵抗和获得emt分子表型间存在关联,而肿瘤干细胞的特点之一就是可以分化为具备emt表型的肿瘤细胞,因此与emt相关的肿瘤放疗抵抗可能与肿瘤干细胞密切相关。宫颈癌患者出现治疗后局部的复发和远处的转移,其原因主要是由于放疗抵抗。我们实验发现放疗抵抗的宫颈癌细胞中富集cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞,因此推测cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞具备抗拒放疗及部分干细胞的特性,并经历emt过程。基于上述分析以及预实验的结果,本论文拟对cd44+/cd24+表达阳性的细胞的放疗抵抗性、是否具备肿瘤干细胞特性以及其与宫颈癌复发转移的关系进行深入研究,旨在阐明宫颈癌放疗抵抗的机制,为临床上宫颈癌的个体化治疗提供理论基础。主要研究内容如下:第一部分cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌干细胞样特性的研究目的:探讨放疗抵抗的宫颈癌细胞的特性,揭示宫颈癌复发和转移的原因。方法:用多次分割照射获得耐放疗的宫颈鳞状细胞癌siha细胞,利用流式细胞仪从宫颈鳞癌的亲代细胞中分选获得cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞;将耐放疗的宫颈鳞癌细胞和cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞设为实验组,亲代宫颈鳞癌细胞设为对照组,分别进行克隆形成试验和肿瘤移植瘤试验,评估试验组细胞是否具备肿瘤干细胞特性;通过transwell侵袭试验研究实验组及对照组细胞侵袭和转移能力的差异;利用rt-pcr和western试验检测实验组及对照组细胞oct-4、survivin、abcg2和bcl-2mrna的表达,以及与肿瘤转移相关的e-cadherin和vimentin蛋白表达;应用spss11.5软件包进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示,计量资料进行t检验,以α=0.05为水准,p<0.05为差异有统计学意义。结果:放疗抵抗的宫颈鳞癌细胞和cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞高表达抗凋亡蛋白bcl-2和凋亡阻抑蛋白survivin,并表达肿瘤干细胞相关标志物oct4和abcg2。两实验组细胞均具有较强的致瘤能力以及侵袭和转移能力,且表现出e-cadherin下调和vimentin蛋白上调的emt相关的分子表型变化。统计学结果显示,实验组与对照组间比较差异显著(p<0.05)。结论:放疗抵抗的宫颈鳞癌细胞与cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞表现出相同的肿瘤干细胞特性,经历了emt过程,放疗可以富集宫颈癌干细胞。第二部分cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞放疗抵抗机制的研究目的:探讨cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞的放射敏感性及其抗拒放疗机制。方法:体外培养人宫颈鳞癌siha细胞,采用流式细胞分选仪分选出cd44+/

关键词：宫颈癌干细胞放射抵抗细胞凋亡转移复发上皮细胞间质转化

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甘草酸抑制糖基化修饰调控EMT的机制研究

甘草酸抑制糖基化修饰调控EMT的机制研究

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作者：高丽丽大连医科大学

学位级别：博士

肺间质纤维化(Pulmonary fibrosis)是一种慢性疾病,病程逐渐发展、不可逆转,是间质性肺疾病的终末期,据统计其平均生存期短,不足5年。肺间质纤维化的患者呼吸困难明显,生活难以自理,且花费大,给社会、家庭、及个人带来沉重的精神及经济... 详细信息

肺间质纤维化(Pulmonary fibrosis)是一种慢性疾病,病程逐渐发展、不可逆转,是间质性肺疾病的终末期,据统计其平均生存期短,不足5年。肺间质纤维化的患者呼吸困难明显,生活难以自理,且花费大,给社会、家庭、及个人带来沉重的精神及经济负担。因此延缓肺间质纤维化进展、降低死亡率是我国肺病防治所面临的巨大挑战和重大需求。虽然导致肺间质纤维化的病因不甚清楚,但肺间质纤维化的病理表现与信号通路主要表现为:肺间质中大量炎症细胞浸润,肌成纤维细胞显著增多从而产生过多的细胞外基质积聚,最终出现纤维化的病理改变。目前尚无有效手段阻止其进展。因此,阐明肺间质纤维化发生、发展机制,寻找有效的新的干预治疗策略,对阻止疾病发展、降低死亡率有着重大的意义。但是,目前我们尚不十分明确有关肺间纤维化这一疾病的发病机制。肺间质纤维化疾病病程中关键的病理改变包括肌成纤维细胞大量、异常增多。目前针对肌成纤维细胞的来源的研究较多,说法不一,争议较大。其研究结果显示多数观点倾向主要来源为肺泡上皮细胞,即EMT(epithelial to mesenchymaltransition)。肺泡上皮细胞活化后的一个重要效应是:转化为肌成纤维细胞,促进细胞外基质合成,同时活化多种参与固有免疫、炎症的基因等,促进炎症、氧化应激损伤,从而加重肺间质纤维化进展。由此推测:肺泡上皮细胞转分化(EMT)是肺间质中肌成纤维细胞的主要来源。深入研究EMT的机制及其活化后导致的重要分子生物学效应,是寻求干预靶点的重要防治策略。综上所述,肺间质纤维化是一种难治、复杂的疾病。目前传统激素及单通路受体阻滞剂(如吉非替尼)可能获得部分疗效,但不能阻止肺间质纤维化的进展。近年来有关我国中草药方剂及其单体活性成分在疾病治疗中的研究越来越多,其在肺间质纤维化的治疗中的作用也越来越引起大家的重视。本课题组前期实验证实活血化瘀方剂(黄芪、川芎、丹参、当归、红景天、浙贝母、甘草)对肺间质纤维化有治疗作用。其中甘草酸(Glycyrrhizic acid,GA)作为甘草中最主要的活性成分,大量研究表明甘草酸对脏器纤维化(如肝脏)有显著的治疗作用。但甘草酸对肺间质纤维化是否有改善作用我们尚不清楚。因此我们提出以下科学问题:多种炎症、多条信号通路的过度激活是肺间质纤维化的重要基础,EMT又是导致肺间质纤维化的重要途径,是什么调控了这些炎症因子和信号通路活性?甘草酸是否能够找到控制它们活性的共同靶点?近年,糖蛋白组学的飞速发展为我们解答以上问题提供了新的研究方向。核心岩藻糖基化(core fucosylation,CF)是一种重要的蛋白质糖修饰,是由α-1,6岩藻糖转移酶(Fucosyltransferase8,FUT8)特异性地催化转移岩藻糖,将其连接在靶蛋白的特定氨基酸位点的核心糖链上,从而完成靶蛋白质的折叠、空间构象。我们课题组研究表明脏器纤维化中其关键蛋白均为糖蛋白,所以,我们思考:甘草酸是否通过CF修饰调控这些炎症因子及信号通路的活性?要解决上述科学问题,本实验拟通过建立博来霉素(Bleomycin,BLM)诱导肺间质纤维化大鼠模型明确甘草酸对肺间质纤维化有无作用;在大鼠肺间质纤维化模型上观察甘草酸对EMT的影响;在此基础上,通过观察甘草酸对CF的影响进而深入解析甘草酸抑制EMT的具体机制。本实验首次发现甘草酸能减轻BLM诱导的肺间质纤维化及抑制EMT;其次从糖生物学全新的角度阐释了甘草酸治疗肺间质纤维化的机制,填补了糖生物学在肺间质纤维化领域的空白,为临床研发新药提供了全新思路。第一部分甘草酸减轻BLM致肺间质纤维化目的:探讨甘草酸对BLM致大鼠肺间质纤维化的病理影响,明确甘草酸对肺间质纤维化有无干预作用。方法:利用BLM致大鼠肺间质纤维化模型,成功获得肺脏大体标本,使用不同剂量甘草酸观察其对肺脏病理的影响及明确对肺间质纤维化是否有治疗作用。首先大体观察甘草酸湿/干重比的影响;使用HE、Masson染色方法观测甘草酸对肺脏病理的影响;利用免疫组化及免疫印迹技术检测胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ的变化;其次利用ELISA法检测大鼠的肺组织中Hyp含量,明确甘草酸对肺间质纤维化是否有干预作用。结果:与正常组相比,BLM诱导的大鼠肺间质纤维化中肺湿/干重比明显升高;HE、Masson染色显示肺脏病理明显加重;免疫组化及免疫印迹显示胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ表达明显增加;ELISA检测Hyp的含量明显升高。经甘草酸治疗后,肺湿/干重比明显降低;,肺脏病理明显减轻,胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ及Hyp表达较纤维化组明显降低,并随甘草酸剂量的升高而明显减轻,其中高剂量甘草酸具有显著的抑制作用。结论:在BLM致大鼠肺间质纤维化的模型中,甘草酸对抑制及保护肺间质纤维化起到了一定作用,并呈剂量依赖性。第二部分甘草酸对EMT的影响目的:阐述甘草酸对肺上皮细胞转

关键词：甘草酸肺间质纤维化上皮细胞间质转化核心岩藻糖

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miR-205下调ASPP2表达促进食管癌转移及EMT的作用及机制研究

miR-205下调ASPP2表达促进食管癌转移及EMT的作用及机制研究

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作者：卜芳芳第二军医大学

学位级别：博士

研究背景及目的：食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。肿瘤转移和复发是食管癌预后差的主要原因之一，目前根治性食管... 详细信息

研究背景及目的：食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。肿瘤转移和复发是食管癌预后差的主要原因之一，目前根治性食管癌切除后5年复发率仍高达40%以上。因此，如果可以从遗传学以及表观遗传学的角度来深入研究食管癌进展和食管癌转移的机制，将能有效的为食管癌的诊断和治疗提供新靶点和策略。 ASPP2是凋亡调控蛋白ASPP (apoptosis stimulating proteins of p53)家族的一个重要的肿瘤抑制分子。ASPP2+/-的小鼠能自发形成肿瘤，且ASPP2杂合缺失能增加小鼠γ射线诱发肿瘤的发生率。研究也表明ASPP2在结肠癌、乳腺癌及血液系统肿瘤中都存在表达下调，我们前期也证明ASPP2在肝癌细胞系及临床病例中均存在启动子区高甲基化所致的基因沉默，提示我们ASPP2是一个重要的广谱的抑癌基因。已知的ASPP2的表达调控方式主要包括：①E2F1的转录激活，②启动子区甲基化导致的转录抑制，③泛素化促进蛋白降解；其中甲基化是多种肿瘤中ASPP2表达水平下降的主要原因。但我们的研究结果表明甲基化不是食管癌中ASPP2表达水平下降的主要原因；检测食管癌细胞系中ASPP2的内源性表达水平，发现ASPP2的mRNA与蛋白表达水平存在很大差异，提示ASPP2存在转录后蛋白水平的调控方式。 miRNA是近年来发现的一系列的内源性单链非编码的小RNAs分子，长度约18-25个核苷酸。其广泛分布于真核生物中，成熟的miRNA在RNA诱导沉默复合物（RISC）的引导下与靶信使RNA的3’非编码区（3’-UTR）完全或不完全配对，降解靶信使RNA或阻遏其转录后翻译，从而参与靶基因的表达调控。研究表明，在哺乳动物中miRNA主要是通过抑制转录后翻译的方式调控靶基因表达，是基因转录后翻译水平调控的重要方式。miRNA的表达具有组织和疾病特异性，使其有望成为新型的肿瘤标记物；此外，miRNA可以分泌且稳定存在于外周循环，为其成为新的无创的诊断性生物标记提供了有利条件。肿瘤转移是肿瘤细胞、宿主细胞和组织微环境之间相互作用的序贯连续过程。上皮细胞间质化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在肿瘤转移中的作用越来越引起人们的重视。2011年Lu X等发现ASPP2在中枢神经系统发育中发挥了重要的作用，ASPP2作为Par-3的结合分子，通过调节神经细胞的极性影响细胞的增殖及组织重构。同时，Shigeo等在MDCK细胞中证明ASPP2通过影响PAR复合体的形成调节上皮细胞顶-基地极性的建立和维持。但是，ASPP2是否参与了癌性EMT的调控还尚无报道。研究方法及结果： 1.免疫组化检测ASPP2在食管癌组织中的表达及其与临床指标的关系我们通过免疫组化技术，检测了ASPP2和E-cadherin在食管癌中的表达情况。在正常的食管粘膜中ASPP2主要分布于棘细胞层到角质细胞层，而在基底层细胞表达缺失，并且，ASPP2在食管癌原发灶及转移灶中的表达水平均较正常食管上皮细胞有显著下调。通过分析ASPP2与多项临床指标之间的关系，发现ASPP2与食管癌的浸润深度（P=0.004）、淋巴结转移（P=0.026）及远处转移（P=0.043）呈负相关，而与其它临床指标无明显相关性。通过Wilcoxon rank sum检验分析ASPP2表达水平与E-cadherin表达情况的关系，发现在E-cadherin表达正常组ASPP2的表达水平显著高于E-cadherin表达异常组（P<0.001），提示我们ASPP2可能参与了EMT的调控。Log-Rank检验分析ASPP2的表达和患者生存的关系发现，发现ASPP2低表达组患者的总体生存期显著差于ASPP2高表达组（37.67±3.10vs.49.70±3.16，month），结果提示我们食管癌中ASPP2的表达水平较正常组织显著下降，且ASPP2低表达与食管癌转移及预后差呈正相关。 2. miR-205抑制ASPP2转录后翻译下调ASPP2的表达我们利用QRT-PCR及Westen blots两种方法分别检测了ASPP2在正常食管粘膜细胞Het-1A细胞及11株食管癌细胞系KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE150、KYSE180、KYSE410、TE3、TE7、TE10、TE11、TE12中的mRNA和蛋白表达水平。发现食管癌细胞系中ASPP2的mRNA水平和蛋白表达水平不一致，提示在食管癌中ASPP2存在转录后水平的调控机制来抑制其表达。通过Microlnspector、

关键词： ASPP2 miR-205 上皮细胞间质转化食管癌肿瘤转移

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长链非编码RNA AOC4P在结直肠癌中的表达及作用

长链非编码RNA AOC4P在结直肠癌中的表达及作用

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作者：亢健山东大学

学位级别：博士

背景目前,在世界范围内,结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)发病率居第二位,癌症相关死亡率居第三位,严重危害着人类健康。结直肠癌患者临床表现各异,可以没有症状,也可以有症状,这与发病时间和临床分期有关。无症状患者通常在大便潜血检... 详细信息

背景目前,在世界范围内,结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)发病率居第二位,癌症相关死亡率居第三位,严重危害着人类健康。结直肠癌患者临床表现各异,可以没有症状,也可以有症状,这与发病时间和临床分期有关。无症状患者通常在大便潜血检查结果阳性后行结肠镜检查病理确诊。有症状患者常常表现为直肠出血、腹痛、大便习惯改变、腹部包块、贫血和隐形失血。少数结直肠癌患者首次在急诊就诊,主要表现为梗阻症状,如腹痛腹胀;更有甚者,一旦癌肿破溃穿孔,表现为急腹症征象。此时,大多数患者已是进展期结直肠癌,已失去最佳治疗时机。近几十年来,结直肠癌在诊断和治疗上取得了巨大进步,患者术前行消化系统彩超、结肠镜、胸片和CEA水平检查,如果怀疑存在远处转移情况,推荐行胸腹及颅脑CT检查。直肠癌患者需要加做盆腔MRI检查和直肠超声内镜检查,同时行硬内窥镜检查确定癌灶位置。完善检查后,行术前TNM分期(cTNM stage)评估,选择相应手术方式,有姑息手术或者根治手术。对于pT3-4或者N+直肠癌患者,需要术前行新辅助放化疗,术后行辅助化疗。但是患者预后仍然不尽人意,尤其是发生远处转移的进展期结直肠癌患者[1]。约25%结直肠癌患者在确诊时已存在肝转移,而且约50%患者在术后3年内被发现肝转移[2]。由于大多数结直肠癌肝转移患者已不适合手术,失去根治机会,其预后往往很差,确诊结直肠癌肝转移后5年生存率低于10%[3]。癌胚抗原(CEA)水平可作为随访标志物,但是不能作为可靠的筛选或诊断工具,因为在结直肠癌早期检测中缺乏敏感性和特异性。患者术后随访期间发现CEA水平上升可能预示着结直肠癌复发或者远处转移,需要行CT或者MRI扫描检查来评估肝转移和肺转移情况。目前,在血清及血浆中发现了可能成为结直肠癌肿瘤标志物的LncRNA,对结直肠癌诊断和预后有一定指导意义。此外,还发现有些LncRNA影响结直肠癌对放化疗的敏感性,在理论上可预测治疗效果。因此,为了发展更加有效的早期诊断和综合治疗方法,进一步探索结直肠癌发生、进展及转移的分子机制是很有必要,也是最关键的。目前,基因组学研究已揭示90%以上DNA序列被有效转录,但是仅仅2%转录本编码蛋白质,相比之下,绝大多数转录本被认定为非编码RNA(Non-coding RNA,ncRNA)[4]。基因组转录一系列复杂多样的保守ncRNA,包含经典的管家基因,如核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)等,最近鉴定了一系列微小RNA(microRNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA),这些都是不被翻译成蛋白质的RNA分子。LncRNA由RNA聚合酶Ⅱ转录,长度在200nt和1OOkb之间,而且缺少有效的开放读码框(open reading frame,ORF)[5]。这些和信使RNA(Messenger RNA,mRNA)相似的分子被普遍转录,根据与编码蛋白基因的相对位置被粗略定义为反义LncRNA,并展现了调控基因表达的功能。LncRNA调控基因表达的模式表明了这些分子在不同的生物进程中发挥着作用,包括基因调控、免疫监视和胚胎干细胞多向潜能分化[6-8]。近来,LncRNA发挥作用的分子机制被研究发现与肿瘤发生发展有关,与LncRNA调节紊乱干扰基因表达,抑癌基因失活,激活癌基因等有关[9,10]。AOC4P是长度为2073bp的长链非编码RNA,中文翻译为“含铜胺氧化酶4的假基因”,在肝癌中,LncRNAAOC4P表达降低是疾病预后不良的因素之一,可以作为肝癌的独立预后因子,可能与Vimentin蛋白结合促进其分解,从而抑制上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程[11]。然而,LncRNAAOC4P在结直肠癌中的表达及作用尚不清楚。癌细胞转移级联反应中最具有决定意义的一步就是侵袭能力的获得,包括破坏细胞之间的连接,降解细胞外基质,激活癌细胞支架运动。在过去十几年,研究者已证实了 EMT在癌细胞转移过程中的关键作用,EMT是细胞在受到环境刺激后,通过复杂的膜信号传导,从而发生一系列的外形和功能变化。在EMT过程中,上皮细胞失去极性,并且转化为间质细胞表型,增强癌细胞侵袭能力,同时也能促进细胞生长。EMT进程的启动和进行牵涉到极其复杂的信号转导途径之间的相互作用和相关基因的转录调节,其标志性行为表现为E-cadherin下调,E-cadherin是上皮细胞主要的分子蛋白标志物,受到一系列EMT转录因子调控,这些转录因子包括SNAIL,TWIST和ZEB家族,在胚胎发生和肿瘤形成中均发挥重要作用。此外,这些EMT相关转录因子与癌侵袭和转移,以及预后不良相关,这更加表明EMT在癌发生发展中的重要作用

关键词：结直肠癌长链非编码RNA AOC4P 上皮细胞间质转化

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HIF-1α和EMT相关蛋白在胰腺癌组织中的表达及临床意义

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世界华人消化杂志 2011年第19期19卷 2022-2030页

作者：朱光辉岑刚黄陈张志华冯正中吕秀红裘正军上海交通大学附属第一人民医院普外科上海市胰腺疾病重点实验室上海市200080 上海交通大学附属第一人民医院病理科上海市200080

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和上皮细胞间质转化(EMT)相关蛋白在胰腺导管腺癌(PDAC)组织中的表达及临床意义.方法:采用免疫组织化学法检测92例PDAC和10例正常胰腺组织中HIF-1α、Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin的表达,并... 详细信息

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和上皮细胞间质转化(EMT)相关蛋白在胰腺导管腺癌(PDAC)组织中的表达及临床意义.方法:采用免疫组织化学法检测92例PDAC和10例正常胰腺组织中HIF-1α、Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin的表达,并分析其与患者临床病理特征和预后的关系.结果:HIF-1α、Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin在PDAC和正常胰腺组织中表达的阳性率分别为:69.57%,69.57%,58.70%,36.96%,73.91%;10%,0%,0%,90%,0%.HIF-1α的表达与淋巴结转移有关;Snail的表达与TNM分期有关;Slug的表达与TNM分期和淋巴结转移有关;N-cadherin的表达与TNM分期、淋巴结转移和肿瘤分化程度有关.HIF-1α表达与Snail、Slug表达呈正相关(r=0.309,P=0.005;r=0.231,P=0.027);Snail表达与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.223,P=0.033);E-cadherin表达与N-cadherin表达呈负相关(r=-0.478,P=0.000).HIF-1α、Snail和E-cadherin是患者术后独立的预后因子.结论:HIF-1α、Snail、Slug、E-cadherin、N-cadherin在PDAC的演进及预后中发挥作用.

关键词：胰腺肿瘤缺氧诱导因子-1α 上皮细胞间质转化预后

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SPARCL1对膀胱癌发生发展的作用和机制研究

SPARCL1对膀胱癌发生发展的作用和机制研究

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作者：赵有利兰州大学

学位级别：博士

研究背景和目的膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤之一,通常以尿路上皮癌最为常见,占膀胱癌90%以上。膀胱癌的发病率和死亡率高且呈逐年上升趋势,严重威胁人们的健康。尽管近年来膀胱癌在诊断和治疗方面取得了极大进展,但治疗后5年生存率仍不理... 详细信息

研究背景和目的膀胱癌是泌尿系统恶性肿瘤之一,通常以尿路上皮癌最为常见,占膀胱癌90%以上。膀胱癌的发病率和死亡率高且呈逐年上升趋势,严重威胁人们的健康。尽管近年来膀胱癌在诊断和治疗方面取得了极大进展,但治疗后5年生存率仍不理想,尤其是转移性膀胱癌,生存率更低。膀胱癌的侵袭转移和高复发率是影响膀胱癌患者治疗和预后的重要因素,鉴别高侵袭性膀胱癌及明确膀胱癌的发病机制对膀胱癌患者的早期诊断、手术方案以及个体化治疗的选择具有重要意义。目前关于膀胱癌侵袭转移的相关分子机制还不完全清楚。因此,深入研究膀胱癌侵袭转移的分子生物学机制有助于探寻膀胱癌诊断、治疗和预后的新型靶标,对膀胱癌早期诊断、治疗及提高患者生存率具有重要意义。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白类似蛋白1(SPARCL1,secreted protein acidic and rich in cysteines-like protein 1),是一种细胞外多功能基质糖蛋白,参与了细胞黏附、增殖和迁移调控等多种生物学功能。SPARCL1在绝大多数肿瘤细胞中表达下调,并参与了多种肿瘤的发生、发展、转移和预后。然而对于SPARCL1在膀胱癌中的研究目前未见详细报道,SPARCL1在膀胱癌发生发展中的作用机制尚不明确。因此,本课题拟通过研究SPARCL1在膀胱癌组织及配对癌旁组织中的差异表达量,分析SPARCL1表达与膀胱癌患者临床疾病特征及预后的相关性;研究SPARCL1对膀胱癌细胞生物学行为的影响;探讨SPARCL1在膀胱癌发生发展中的作用及分子机制,为SPARCL1成为膀胱癌诊断、治疗及预后的新靶标提供理论依据。方法1.分析Oncomine数据库中多种肿瘤中的SPARCL1表达情况。检索GEPIA和TCGA数据库内不同膀胱癌数据进一步探讨SPARCL1在膀胱癌中的表达情况。2.运用q RT-PCR检测22例膀胱癌组织及配对癌旁组织中SPARCL1的差异表达情况;通过q RT-PCR及Western blot检测4株膀胱癌细胞(T24、5637、UMUC-3、SW780)及人尿路上皮细胞株SV-HUC-1内SPARCL1的m RNA及蛋白表达水平。3.通过免疫组化染色分析含有68例膀胱癌及40例配对癌旁组织芯片中SPARCL1蛋白表达量,进一步分析SPARCL1与临床相关病理参数之间的关系。通过对TCGA公共数据库中膀胱癌数据集挖掘,选取Bladder Cancer(MSK/TCGA,2020)数据集探寻SPARCL1表达量与膀胱癌预后的关系。4.构建过表达SPARCL1慢病毒,转染内源性SPARCL1低表达的T24及5637细胞,建立稳定过表达Lv-SPARCL1的细胞株。通过CCK8、流式细胞术和Transwell迁移侵袭等实验方法分析过表达SPARCL1后T24及5637细胞在增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭等细胞生物学行为方面的改变,并通过q RT-PCR检测MMP7、MMP13表达量的变化。构建敲减SPARCL1慢病毒,转染UMUC-3细胞,Transwell实验分析敲减SPARCL1后UMUC-3细胞迁移和侵袭的改变及MMP7、MMP13表达水平的变化。***1在膀胱癌中的作用机制初探:对SPARCL1过表达组与对照组细胞进行RNA-seq,通过测序数据分析过表达前后差异基因及通路富集,初步研究SPARCL1参与膀胱癌发生发展的分子生物学机制。6.通过q RT-PCR及Western blot对测序分析数据验证:检测过表达SPARCL1后T24及5637细胞EMT标志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)和相关转录因子Snail的变化,以及PI3K/AKT信号通路中相关蛋白表达变化。7.建立裸鼠移植瘤模型,利用免疫组化方法检测过表达SPARCL1的移植瘤体中EMT标志物表达变化。结果1.分析Oncomine数据库结果显示,20余种肿瘤中SPARCL1均有异常表达,膀胱癌中SPARCL1表达下调。进一步对GEPIA和TCGA数据库内的膀胱癌数据分析发现,与癌旁组织相比,膀胱癌组织内的SPARCL1表达下降,差异显著。2.q RT-PCR结果显示,与配对癌旁组织相比,22例膀胱癌组织中SPARCL1表达量明显下调;4株膀胱癌(T24、5637、UMUC-3、SW780)细胞内SPARCL1的m RNA及蛋白表达量均低于人尿路上皮细胞SV-HUC-1,差异显著。3.68例膀胱癌组织芯片的免疫组化染色结果显示,SPARCL1在膀胱癌中的表达水平显著低于癌旁组织。SPARCL1的表达量与患者年龄、性别及肿瘤大小无显著相关性,但与患者AJCC分期和淋巴转移显著相关。对TCGA数据库内膀胱癌数据集Bladder Cancer(MSK/TCGA,2020)进

关键词： SPARCL1 膀胱癌上皮细胞间质转化基质金属蛋白酶 PI3K/AKT信号途径

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FOXO3a基因表达下调在肾透明细胞癌远处转移中的作用及其机制研究

FOXO3a基因表达下调在肾透明细胞癌远处转移中的作用及其机制研究

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作者：倪栋南开大学

学位级别：博士

研究背景：肾癌(Renal Cell Carcinoma, RCC)占人类全部恶性肿瘤的2%-3%,其中最为常见的组织病理类型是肾透明细胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC)占肾癌的80%-90%。肾癌对放化疗均不敏感,缺少有效的系统治疗方法,因此局限... 详细信息

研究背景：肾癌(Renal Cell Carcinoma, RCC)占人类全部恶性肿瘤的2%-3%,其中最为常见的组织病理类型是肾透明细胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma, ccRCC)占肾癌的80%-90%。肾癌对放化疗均不敏感,缺少有效的系统治疗方法,因此局限性肾癌经外科手术治疗后预后较好,5年生存率能超过70%,然而转移性肾癌的预后很差,5年生存率低于27.1%。目前对于转移性肾癌的诊断仍然依赖影像学检测,缺少能够早期反应肾癌转移的确切的分子生物学标志。因此临床上可能存在一些患者虽然诊断为局限性肾癌,但实际上已经发生了影像学无法检测到的肾癌微转移灶。这部分患者经过原发灶切除手术后可能比较容易出现肿瘤的转移复发。本研究以基因芯片检测原发转移性ccRCC与未转移ccRCC的mRNA表达谱差异,通过生物信息学分析、实时定量RCP验证、电话随访和体内外生物学功能实验等手段探索了可能促进ccRCC转移的分子生物学机制。材料与方法： 1、组织样本收集：收集解放军总医院泌尿外科2009至2012年135例肾透明细胞癌组织样本。其中21例患者为原发转移性肾透明细胞癌,114例患者为原发未转移肾透明细胞癌。 2、随访观察：对114例原发未转移肾透明细胞癌患者进行了电话随访,观察事件为肿瘤的转移复发。随访时间为14.1至41.5个月,中位随访时间28.2个月,失访患者4例。 3、芯片检测：5例原发转移性肾透明细胞癌以及5例原发未转移肾透明细胞癌组织样本,通过总RNA抽提、纯化、质控、逆转、片段化、标记、杂交等步骤,使用Affymetrix Human Genome U133Plus2.0Array检测样本转录谱。经随机方差模型(RVM) t检验筛选组间具有显著性表达差异的基因(p<0.05)。 4、生物信息学分析：Gene Ontology (GO), pathway和Signal-net分析转移性肾透明细胞癌的生物学特性,筛选潜在的促进肾透明细胞癌转移的关键基因。 5、RNA提取和实时定量PCR:常规提取组织总RNA,反转录为cDNA。实时定量PCR用SYBR Green法比较△CT。 6、免疫组化染色：随机挑选10例原发转移性肾癌组织样本以及10例原发未转移肾癌组织样本。经过石蜡包埋,4μ m连续切片,SP法检测FOXO3a蛋白的表达。 7、细胞培养：肾癌细胞株A-498,769-P,786-0, Caki-2, Caki-1, ACHN以及SN12-PM6常规培养用于在体以及体外实验。 8、质粒构建、siRNA干扰和细胞转染：FOXO3a的表达质粒pCR3.1-FOXO3a以及靶向沉默FOXO3a的siRNA用于瞬时转染肾癌细胞后经流式细胞仪检测细胞凋亡。FOXO3a的表达质粒pIRES2-EGFP-FOXO3a以及靶向沉默FOXO3a的短发夹RNA (shRNA)表达质粒pGFP-V-RS-shFOXO3a用于构建稳定转染的肾癌细胞株,同时稳定转染相应空质粒的细胞株作为对照组,用于其它生物学功能验证实验。 9、提取细胞蛋白及western-blot检测蛋白表达：RIPA裂解液提取细胞蛋白,按照常规western-blot操作步骤检测相关蛋白表达。 10、流式细胞仪检测细胞凋亡：Annexin V-FITC/PI双标法检测肾癌细胞凋亡。 11、肿瘤细胞的侵袭迁移实验：将稳转细胞株铺在未加基质胶的Transwell小室中检测肿瘤细胞的迁移能力,铺在加有基质胶的Transwell小室中检测肿瘤细胞的侵袭能力。细胞划痕实验用于检测肿瘤细胞的迁移能力。 12、裸鼠原位肾肿瘤模型以及转移灶的检测：将构建好的稳转肾癌细胞株用微量注射器种植在裸鼠单侧肾脏皮质内。6周后处死裸鼠,取肺组织切片做HE染色寻找肺转移灶。用IVIS系统检测裸鼠肺组织中绿色荧光的含量从而定量检测肺转移灶的多寡。实验结果： 1、经过Affymetrix Human Genome U133Plus2.0芯片检测对比,发现在肾透明细胞癌原发转移组与未转移组之间有1257个基因表达差异具有显著性意义(p<0.05)。对这1257个差异基因进行GO和pathway分析发现这些差异基因具有间质细胞的表达特征,提示在转移性肾癌中可能发生上皮细胞间质化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。结合Signal-net分析和PubMed数据采集,推测差异基因中FOXO3a的表达下调可能是促进肾癌转移的关键基因。 2、经过实时定量PCR检测,对比21例原发性转移组和经过1：2配对的4

关键词：肾透明细胞癌远处转移 FOXO3a 上皮细胞间质转化

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