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中国预防兽医学报 2008年第2期30卷 118-121页

作者：何来王云峰石星明崔红玉韩文雄兰德松王玫童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列(NC006233)设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因,并对其进行序列分析。用DNAStar软件分析gJ蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa～483aa片段,克隆并... 详细信息

根据GenBank中已发表的传染性喉气管炎病毒全基因组序列(NC006233)设计引物,以传染性喉气管炎病毒WG株基因组为模板,PCR扩增糖蛋白gJ基因,并对其进行序列分析。用DNAStar软件分析gJ蛋白的抗原性,选择抗原性强的140aa～483aa片段,克隆并连接到原核表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)菌株。经IPTG诱导后,获得大小为65.2ku的重组蛋白,命名为r-gJ,表达量占菌体蛋白总量的60.8%;Western blot分析表明r-gJ具有较强的抗原性。

关键词：传染性喉气管炎病毒糖蛋白J(gJ) 序列分析表达抗原性

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传染性喉气管炎病毒河南株gB基因的克隆、序列分析及其真核表达载体的构建

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008年第10期36卷 29-33页

作者：廖仲磊陈红英李新生崔保安李祥瑞南京农业大学兽医学院江苏南京210095 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

【目的】构建传染性喉气管炎病毒（ILTV）的真核表达载体。【方法】从传染性喉气管炎病毒河南株（ILTV-XY）感染的鸡胚绒毛尿囊膜中提取病毒DNA,进行PCR扩增,PCR产物进行T-A克隆与测序,获得了鸡IL-TV-XYgB全基因序列;对ILTV-XY株gB基因... 详细信息

【目的】构建传染性喉气管炎病毒（ILTV）的真核表达载体。【方法】从传染性喉气管炎病毒河南株（ILTV-XY）感染的鸡胚绒毛尿囊膜中提取病毒DNA,进行PCR扩增,PCR产物进行T-A克隆与测序,获得了鸡IL-TV-XYgB全基因序列;对ILTV-XY株gB基因与GenBank中读取的5株ILTVgB基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行了比较分析;并将该基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,对构建的重组质粒pcDNA3.1/gB进行酶切、测序鉴定。【结果】序列测定表明,gB全基因核苷酸长度为2 629 bp,编码873个氨基酸,推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点,有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸。与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因进行比较,核苷酸序列同源性为99%以上,与ILTV-SA2株gB基因比较发现,ILTV-XY株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G,而在第102位又都插入1个碱基A,从而引起该毒株gB基因推导的氨基酸序列中第28-32位5个氨基酸的移码突变。构建的重组质粒pcD-NA3.1/gB经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。【结论】成功构建了ILTV的真核表达质粒pcDNA3.1/gB,为ILTV核酸疫苗的研究奠定了基础。

关键词：传染性喉气管炎病毒 gB基因聚合酶链反应序列分析真核表达载体

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传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

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中国兽医科技 2005年第7期35卷 520-524页

作者：王利丽王云峰智海东王玫步志高冉多良童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点,经过酶切、测序分析,筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒,分别命名为pCAGGgB、pCAGGgC、pCAGGgD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进... 详细信息

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点,经过酶切、测序分析,筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒,分别命名为pCAGGgB、pCAGGgC、pCAGGgD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化,将纯化后的质粒转染293T细胞,用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明,目的蛋白得到了真实的表达。

关键词：传染性喉气管炎病毒 gB基因 gC基因 gD基因真核表达

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传染性喉气管炎病毒田间分离株重要基因的序列分析

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中国兽医学报 2015年第12期35卷 1911-1916页

作者：李胜鹏严专强薛瑜覃健萍周庆丰孙宝丽谢青梅陈峰毕英佐华南农业大学兽医学院广东广州510642 华南农业大学动物科学学院广东广州510642 广东温氏食品集团股份有限公司广东温氏集团技术中心广东云浮527439

为了解我国田间传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)的具体流行情况,利用序列测定和PCR-RFLP对2010-2014年分离的19株田间毒株进行分析,并将结果与6株疫苗株对比。序列分析发现,与CEO疫苗株相比,9株毒株的ICP... 详细信息

为了解我国田间传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)的具体流行情况,利用序列测定和PCR-RFLP对2010-2014年分离的19株田间毒株进行分析,并将结果与6株疫苗株对比。序列分析发现,与CEO疫苗株相比,9株毒株的ICP4基因不但没有4个连续氨基酸(丙氨酸-丙氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的缺失,而且在201位有1个蛋氨酸的插入。TK基因序列分析发现252位氨基酸不能决定该毒株的毒力,而可能是由终止密码子下游24 bp是否存在典型的多聚腺苷酸信号(AATAAA)来决定,即存在时为强毒株。综合PCR-RFLP和序列分析结果发现,我国田间流行毒株中既存在有野毒株和疫苗株的相关株,也存在两者的重组毒株,提示我们在对ILTV进行防制时应当注意弱毒疫苗的使用。

关键词：传染性喉气管炎病毒序列分析 PCR-RFLP 流行病学

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传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的克隆、表达、蛋白功能研究以及缺失该基因病毒的重组

传染性喉气管炎病毒糖蛋白G基因的克隆、表达、蛋白功能研究以及...

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作者：孙照刚中国农业大学

学位级别：博士

以纯化的传染性喉气管炎病毒（ILTV）北京E3株基因组为模板,通过PCR方法扩增了E3毒株的完整的糖蛋白G（gG）基因及其两侧的序列,包括部分UL47同源序列、完整的US4同源序列（gG基因）以及部分的ORF5序列,将其克隆到pGEM-T载体上,构建了pG... 详细信息

以纯化的传染性喉气管炎病毒（ILTV）北京E3株基因组为模板,通过PCR方法扩增了E3毒株的完整的糖蛋白G（gG）基因及其两侧的序列,包括部分UL47同源序列、完整的US4同源序列（gG基因）以及部分的ORF5序列,将其克隆到pGEM-T载体上,构建了pGEM-FgG质粒,并进行了测序。通过设计另外一对引物克隆了Zhonghai弱毒疫苗株的gG基因,并进行了测序,发现E3株与Zhonghai株的gG基因序列完全一致。与其它疱疹病毒的gG基因和推测的蛋白序列进行了的进化关系、蛋白同源序列比较发现gG蛋白在ILTV中高度保守,疱疹病毒gG蛋白都存在三个保守的半胱氨酸位点,并且三个位点之间间隔的氨基酸残基相同。等电点以及天然蛋白可能存在的修饰等方面的分析,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。利用两种大肠杆菌表达系统（pMAL-c2x（E. coli BT1）和pET-30a（+）（E. coli BL21）载体系统）,对不含信号肽部分的gG基因进行了原核表达,结果表明这两种表达系统都具有较高的表达水平,pMAL-c2x（E. coli BT1）表达系统中目的蛋白（MBP-GG）占整个菌体蛋白的比例为25.8%,但是gG蛋白占整个MBP-GG融合蛋白的比例不超过45%;pET-30a（+）（E. coliBL21）表达系统中目的蛋白（His-GG）占整个菌体蛋白的比例为18.3%,组氨酸标签占His-GG融合蛋白的比例极小,约10%左右。其中MBP-GG融合蛋白是可溶性表达的,分子量大约为72KDa;His-GG融合蛋白是以包涵体的形式存在的,需要使用脲进行变性和复性,分子量为34KDa。经分离纯化分别得到两种融合蛋白MBP-GG和His-GG后,分别制备了抗ILTV gG蛋白的大鼠抗血清,并利用蛋白G对两种抗血清进行了纯化,获得了纯化的免疫球蛋白。为了进一步研究gG蛋白的功能,通过利用DEAE BIO-GEL从感染ILTV的鸡胚尿囊液中纯化得到ILTV天然gG蛋白。利用在鸡胚原代单层肝细胞（CEL）培养液中添加ILTV天然gG蛋白及其抗体的方法,对gG蛋白在ILTV（北京E3和Zhonghai）的吸附、侵入、细胞到细胞间的直接传染以及病毒的复制曲线方面的作用进行了研究,结果表明:gG蛋白在病毒的吸附和侵入过程中没有作用,但是北京E3和Zhonghai两毒株都具有较强的吸附和侵入效率,两毒株的吸附效率分别为对照的85.6%和79.1%;两毒株的侵入效率分别为68.9%和62.9%。添加抗体能够降低在细胞上培养的病毒滴度,并促使ILTV在CEL单层细胞上形成的噬斑明显变小,分别为对照的50.96%（E3）和56.73%（Zhonghai）。gG蛋白的添加在上述几个方面都没有发现可见的作用,推测可能的原因是ILTVgG蛋白不能单独起作用,需要有其它蛋白分子协同作用;也可能是由于病毒gG蛋白在CEL细胞中的表达特点所致,gG基因启动子属于中早期启动子,并且启动效率高,病毒活动产生的gG蛋白掩盖了添加部分的gG蛋白的功能。利用前面克隆的完整的gG基因及其两侧的序列,将绿色荧光蛋白（GFP）基因插入gG基因ORF中间,分别构建了以CMV、SV40和ILTV gG基因启动子作为启动子,以SV40 polyA作为终止序列,用以启动GFP基因表达的转移质粒pGEM-FgG/CMV-GFP、pGEM-FgG/SV40-GFP和pGEM-FgG/GFP。利用这三种转移质粒和pBL-ICP4质粒与ILTV基因组DNA共转染原代CEL细胞,24h后,用荧光显微镜检测带荧光的ILTV重组子,结果发现:

关键词：传染性喉气管炎病毒糖蛋白G 原核表达功能缺失同源重组

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传染性喉气管炎病毒王岗株糖蛋白gB基因在重组杆状病毒中的表达

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中国预防兽医学报 2001年第5期23卷 321-324页

作者：张绍杰倪健强孟松树王柳仇华吉王云峰童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒 (ILTV)糖蛋白gB基因 ,通过EcoRI位点亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中 ,构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB。将rpVLgB转移载体质粒与杆状病毒DNA(Bac_N_BlueDNA)共转染Sf9昆虫细胞 ,经 3轮蚀斑... 详细信息

将克隆到pUC119中的传染性喉气管炎病毒 (ILTV)糖蛋白gB基因 ,通过EcoRI位点亚克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中 ,构建成重组杆状病毒转移载体rpVLgB。将rpVLgB转移载体质粒与杆状病毒DNA(Bac_N_BlueDNA)共转染Sf9昆虫细胞 ,经 3轮蚀斑纯化 ,获得重组病毒并命名为rpVL_ILTVgB。PCR方法鉴定证明gB基因正确插入到杆状病毒基因组中 ,直接免疫荧光试验和Dot_ELISA结果均表明gB基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中获得表达 ,表达的gB蛋白将作为鸡传染性喉气管炎的亚单位疫苗和诊断抗原。

关键词：传染性喉气管炎病毒糖蛋白gB 重组杆状病毒基因鸡病毒

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传染性喉气管炎病毒WG株糖蛋白gD基因主要抗原区的表达

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中国兽医科学 2011年第2期41卷 188-192页

作者：魏秀英石星明张晶王玫赵妍胡顺磊崔红玉全炎铭闫帅陈洪岩王云峰东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gD蛋白,根据GenBank中登录的ILTV全基因组序列(EU675324)设计了1对引物,进行gD全基因的PCR扩增,产物经纯化后连接至pGEM-T Easy载体,进行序列测定,采用DNAStar软件分析gD蛋白的抗原性,选择抗原性强的第25... 详细信息

为表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gD蛋白,根据GenBank中登录的ILTV全基因组序列(EU675324)设计了1对引物,进行gD全基因的PCR扩增,产物经纯化后连接至pGEM-T Easy载体,进行序列测定,采用DNAStar软件分析gD蛋白的抗原性,选择抗原性强的第256～405aa的编码片段设计引物并进行PCR扩增,结果获得截短的gD基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化*** BL21(DE3)。经IPTG诱导后,获得大小为43.5ku的重组蛋白,命名为r-gD。Western-blot分析结果表明,r-gD具有较强的抗原性。

关键词：传染性喉气管炎病毒糖蛋白D 序列分析蛋白质免疫印迹

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传染性喉气管炎病毒河南株gB基因的克隆与序列分析

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华南农业大学学报 2007年第2期28卷 99-102页

作者：陈红英崔保安李新生赵丽郑兰兰管倩河南农业大学牧医工程学院

根据传染性喉气管炎病毒（ILTV）gB基因的核苷酸序列，设计、合成1对引物，应用PCR扩增鸡ILTV河南株（ILTV—CG）gB基因，将扩增片段克隆人pGEM—T Easy载体后，经蓝白斑筛选，菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序．结果表明克隆到... 详细信息

根据传染性喉气管炎病毒（ILTV）gB基因的核苷酸序列，设计、合成1对引物，应用PCR扩增鸡ILTV河南株（ILTV—CG）gB基因，将扩增片段克隆人pGEM—T Easy载体后，经蓝白斑筛选，菌液PCR和酶切鉴定为阳性的重组菌进行测序．结果表明克隆到ILTV—CG株gB基因，全长为2629bp，包含一个完整的开放阅读框，共编码873个氨基酸的多肽，推导氨基酸序列有8个潜在的N-糖基化位点，有12个与二硫键形成有关的半胱氨酸．序列分析表明，ILTV—CG株gB基因与GenBank中读取的澳大利亚SA2疫苗株、辽宁疫苗株、烟台株、美国632强毒株、英国Throne强毒株gB基因核苷酸序列同源性为99％以上，与ILTV—SA2株gB基因比较发现，ILTV—CG株gB基因核苷酸序列在第89位均缺失1个碱基G，而在第102位又插入1个碱基A，从而引起该毒株舻基因推导的氨基酸序列中第28～32位5个氨基酸的移码突变．

关键词：传染性喉气管炎病毒 gB基因聚合酶链反应序列分析

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传染性喉气管炎病毒UL56蛋白在不同感染模式中的表达及其亚细胞定位分析

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中国预防兽医学报 2022年第8期44卷 817-822页

作者：马德青张金城徐贝贝冯伟民陈鑫韦平黄腾广西大学动物科学技术学院广西南宁530005

传染性喉气管炎病毒(ILTV)编码的UL56蛋白在进化上非常保守,其功能尚不清楚。为明确UL56蛋白在鸡胚肾(CEK)细胞和气管环(TOC)两种不同感染模式中的表达特征及其在HEK293T细胞中的亚细胞定位,本研究分别构建了野生型ILTV UL56的重组质粒p... 详细信息

传染性喉气管炎病毒(ILTV)编码的UL56蛋白在进化上非常保守,其功能尚不清楚。为明确UL56蛋白在鸡胚肾(CEK)细胞和气管环(TOC)两种不同感染模式中的表达特征及其在HEK293T细胞中的亚细胞定位,本研究分别构建了野生型ILTV UL56的重组质粒pUL56(WT)、其关键结构域突变体的质粒pUL56(AY)将UL56氨基酸序列中两个PY基序(PY motif)的脯氨酸(Pro,P)均突变为丙氨酸(Ala,A)及pUL56(ΔTMD)(删除UL56氨基酸序列中的跨膜域TMD),将这3个质粒分别转染DF-1细胞后均经western blot鉴定。结果显示,分别获得了约81 ku的特异性条带,表明野生型UL56及其突变体均获得了表达。以5000 EID_(50)/mL ILTV疫苗株K317分别感染CEK和TOC后不同时间,利用兔UL56多克隆抗体通过western blot检测UL56蛋白表达的变化。结果显示,UL56蛋白在两种不同感染模式中的表达特征明显不同。CEK中的UL56蛋白从感染后24 h开始表达,48 h达到高峰后逐渐下降;而TOC中UL56蛋白的表达量则持续上升,至感染后96 h达到峰值。将pUL56(WT)、pUL56(AY)和pUL56(ΔTMD)分别转染HEK293T细胞后瞬时表达UL56蛋白及其突变体,经高尔基体标志蛋白58k的抗体孵育后,通过激光共聚焦试验观察UL56蛋白的亚细胞定位。结果显示UL56蛋白主要定位于高尔基体,且亚细胞定位不受其PY motif的影响而受其TMD的影响。本研究首次揭示了ILTV感染细胞和离体组织后UL56蛋白表达的特征,并鉴定了影响其亚细胞定位的关键结构域,为后续探究该蛋白的分子作用机制和生物学功能奠定了实验基础。

关键词：传染性喉气管炎病毒 UL56 表达规律亚细胞定位

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传染性喉气管炎病毒河南株TK基因的克隆与序列分析

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江西农业大学学报 2007年第5期29卷 813-817页

作者：陈红英崔保安李新生张书松魏战勇崔沛金钺河南农业大学牧医工程学院河南省兽医防治站河南郑州450008

根据传染性喉气管炎病毒TK基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,利用该对引物PCR扩增出鸡传染性喉气管炎病毒河南株ILTV-CGI、LTV-XY及以色列疫苗株TK全长片段,并进行克隆、测序。结果显示3株ILTV的TK基因全长均为1 183 bp,包含一个开... 详细信息

根据传染性喉气管炎病毒TK基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,利用该对引物PCR扩增出鸡传染性喉气管炎病毒河南株ILTV-CGI、LTV-XY及以色列疫苗株TK全长片段,并进行克隆、测序。结果显示3株ILTV的TK基因全长均为1 183 bp,包含一个开放性阅读框(1 092 bp),编码363个氨基酸的多肽;3株ILTV TK基因核苷酸序列完全一致,并与GenBank收录的ILTV美国632强毒株、北京E2株TK基因完全一致,而与山东烟台株、英国Thorne强毒株和英国216株TK基因核苷酸同源性均为99.5%,与其他疱疹病毒TK基因核苷酸同源性在19.1%～27.2%之间。分子进化分析揭示了各毒株间的亲缘关系。

关键词：传染性喉气管炎病毒 TK基因克隆序列分析

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