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核农学报 2025年第1期39卷 107-118页

作者：张武陈天一应顺莉刘合生杨华曹少谦戚向阳浙江万里学院生物与环境学院浙江宁波315100 上海海洋大学食品学院上海201306

为充分利用鲨鱼软骨资源,本研究以成骨细胞增殖率为指标,在优化促成骨细胞增殖胶原蛋白肽酶解工艺的基础上,分析酶解物的相对分子质量、氨基酸组成及稳定性等。结果表明,酸性蛋白酶为最优蛋白酶,且在酶添加量5 100 U·g^(-1)、料液... 详细信息

为充分利用鲨鱼软骨资源,本研究以成骨细胞增殖率为指标,在优化促成骨细胞增殖胶原蛋白肽酶解工艺的基础上,分析酶解物的相对分子质量、氨基酸组成及稳定性等。结果表明,酸性蛋白酶为最优蛋白酶,且在酶添加量5 100 U·g^(-1)、料液比1∶50(g·mL^(-1))、酶解时间4.14 h和温度55℃条件下,得率为91.23%。所制酶解物促成骨细胞增殖率与水解度分别为141.23%与25.03%;鲨鱼软骨胶原蛋白肽具有一定的稳定性且对紫外光不敏感,适当加热可以提升其促成骨细胞增殖率,但温度过高会使增殖率显著下降;经胃肠模拟消化后,酶解物促成骨细胞增殖率显著下降;所制酶解物以疏水氨基酸为主,其蛋白肽分子量一般小于3 kDa,具有促进成骨细胞增殖、分化及矿化作用,以浓度1.0 mg·mL^(-1)时效果较佳。本研究可为鲨鱼资源精深加工和高值化利用提供一定理论依据。

关键词：鲨鱼软骨胶原蛋白肽促成骨细胞增殖活性制备特性

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牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松作用机制研究

牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松作用机制研究

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作者：叶孟亮中国农业科学院

学位级别：博士

牦牛(Bos grunniens)是我国珍贵的畜种资源,牦牛骨中含有丰富的胶原蛋白(约占21.5%),补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性。深入开展对牦牛骨精深加工技术的研究探讨,充分利用牦牛骨中丰富的骨胶原蛋白开发功能性食品... 详细信息

牦牛(Bos grunniens)是我国珍贵的畜种资源,牦牛骨中含有丰富的胶原蛋白(约占21.5%),补充胶原蛋白肽可以增加骨胶原纤维网架的规则性和牢固性。深入开展对牦牛骨精深加工技术的研究探讨,充分利用牦牛骨中丰富的骨胶原蛋白开发功能性食品,对提高牦牛附加值、增加藏区牧民收益、促进牧区社会经济发展和稳固边疆具有重要意义。本研究以牦牛骨为研究对象,利用酸溶酶提技术制备得到较高纯度牦牛骨胶原蛋白,并对其结构进行了鉴定。基于靶向酶解技术考查了复合蛋白酶(Protamex)、风味蛋白酶(Flavourzyme)、胰蛋白酶(Trypsin)、中性蛋白酶(Neutrase)、碱性蛋白酶(Alcalase)、木瓜蛋白酶(Papain)等6种常用商业蛋白酶对牦牛骨胶原蛋白酶解效果差异,并以水解度、促成骨细胞增殖活性为指标优选了最适用酶;采用响应面法优化了中性蛋白酶酶解牦牛骨胶原蛋白制备促成骨细胞增殖活性肽的最佳工艺参数。利用超滤、体积排阻色谱、反向液相色谱串联质谱技术对牦牛骨胶原蛋白肽进行了进一步分离、纯化和鉴定。通过模拟胃肠道消化、Caco-2细胞单层膜转运模型考查了牦牛骨胶原蛋白肽的消化、吸收、转运机制。基于Real-time qPCR、Western blot和分子对接技术探究了牦牛骨胶原蛋白肽促成骨细胞增殖潜在作用机制。利用骨转换生化标志物、骨生物力学指标、骨形态力学指标考查了牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松活性效应;首次基于非靶向代谢组学技术系统探究了牦牛骨胶原蛋白肽抗骨质疏松活性作用机制。取得主要研究成果如下:(1)通过比较分析6种蛋白酶酶解牦牛骨胶原蛋白水解液促成骨细胞增殖率差异,筛选出中性蛋白酶为酶解牦牛骨胶原蛋白制备促成骨细胞增殖活性肽最适用酶,并优化得到最佳酶解工艺组合为:酶解液温度54℃、酶解时间3.6 h、酶底比(E/S)5637 U/g、初始pH 6.12。(2)利用超滤、体积排阻色谱、反向高效液相色谱等方法对酶解牦牛骨胶原蛋白制备得到的促成骨细胞增殖活性肽进行了分离纯化。其中,经超滤后收集得到的组分UF-IV(Mw<3 kDa)表现出较高的促成骨细胞增殖活性;经Superdex peptide 10/300 GL色谱柱(体积排阻色谱法)分离后,组分SP-III表现出较高的促成骨细胞增殖活性,在0.5 mg/mL作用浓度下,促成骨细胞增殖率高达160.6%;经RP-HPLC分离纯化,组分SP-III经Innoval C18色谱柱进一步分离后的组分F8表现出较强的促成骨细胞增殖活性(190.6%)。利用反向液相色谱串联质谱法联合Mascot2.4 search engine对其氨基酸序列进行测定,共鉴定得到35条肽段。基于相对丰度、分子量、比对标准得分等指标筛选出9条具有较高潜在促成骨细胞增殖活性肽进行化学合成验证其体外生物活性,结果表明,GPAGPPGPIGNV(GP-12)肽相较其他8条肽段具有更高的促成骨细胞增殖活性(142.7%)。(3)模拟胃肠道消化试验结果表明,GP-12肽对胃-肠道消化具有一定的抗性,虽部分GP-12肽经肠道内肽酶水解为GPAGPPGPIGN(GP-11)和GPAGPPGPI(GP-9),经消化后仍可发挥促成骨细胞增殖活性。构建的Caco-2细胞单层膜试验结果表明,GP-12肽会被上皮细胞膜肽酶进一步水解为GPPGPIGNV(GV-9)、AGPPGPIGNV(AV-11)肽,仍有部分GP-12肽可以完整通过Caco-2细胞单层膜而转运,但吸收率较低,其吸收机制为细胞旁路途径吸收。(4)牦牛骨胶原蛋白肽GP-12通过激活Wnt/β-catenin信号通路和EGFR信号通路之间交互作用从而诱导成骨细胞的增殖和分化。体外模拟分子对接结果显示,GP-12肽和表皮生长因子受体EGFR的氨基酸残基结合位点为Asn12、Lys13、Leu14、Thr15、Gln16、Leu17、Gly18、Tyr45、Leu325和Phe357,结合力主要为氢键作用和范德华力。牦牛骨胶原蛋白肽GP-12潜在促成骨细胞增殖作用机制可能为:GP-12肽首先将表皮生长因子受体EGFR激活,活化后的EGFR进一步将GSK-3β因子磷酸化,从而阻止β-catenin蛋白降解,造成β-catenin蛋白在成骨细胞内的积累,从而激活Wnt/β-catenin信号通路诱导成骨细胞增殖过程。(5)牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)具有较好的促成骨增殖活性,且呈现良好的剂量-效应关系。所提取的牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)中分子量在1 kDa以下的多肽所占比例高达96.8%。牦牛骨胶原蛋白肽(<3kDa)的促成骨细胞增殖活性可能归因于GPSGPAGKDGRIGQPG(GP-16)、GDRGETGPAGPAGPIGPV(GD-18)或者含有类似氨基

关键词：牦牛骨生物活性肽促成骨细胞增殖活性骨质疏松代谢组学

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基于成分群动态变化探索药材质量优劣判断方法初步研究

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中医药学报 2012年第1期40卷 63-68页

作者：周培培言方荣张春凤杨中林中国药科大学天然药物活性物质与功能国家重点实验室江苏南京210009

目的:探索评价药材质量优劣的新方法。方法:以怀牛膝药材为研究对象,采用HPLC法构建18批怀牛膝药材的化学成分群图谱;采用MTT法测定各批怀牛膝药材相应的成骨细胞增殖活性,由此构建活性数据库;利用偏最小二乘法(PLS)对药材指纹图谱与成... 详细信息

目的:探索评价药材质量优劣的新方法。方法:以怀牛膝药材为研究对象,采用HPLC法构建18批怀牛膝药材的化学成分群图谱;采用MTT法测定各批怀牛膝药材相应的成骨细胞增殖活性,由此构建活性数据库;利用偏最小二乘法(PLS)对药材指纹图谱与成骨细胞增殖活性的相关性进行分析;对分析得到的YZL值进行正态拟合,并界定判定药材质量优劣的YZL值区间;并以另外10批药材对该判定方法和YZL区间值进行验证。结果:从测定得到的18批怀牛膝药材的指纹图谱中提取得到16个共有峰;以PLS法建立了药材共有峰峰面积与活性间的回归模型,得到相应的标准化回归系数,由此判断出怀牛膝指纹图谱的16个共有峰中1、2、4、5、6、7、11、13、15、16号色谱峰与活性呈正系数相关,其余各峰与活性呈负系数相关;基于回归模型相应标准化回归系数的正负性,经多重综合分析,提炼出YZL值(正、负系数相关峰峰面积和之比值);通过对YZL值进行正态拟合并界定,得到当YZL值≥0.9639时,该怀牛膝药材为优品;当YZL值≤0.6112时,该怀牛膝药材为劣品;该判定方法得到了验证。结论:PLS法适用于怀牛膝指纹图谱与成骨细胞增殖活性的相关性分析;YZL值可用于判定和划分怀牛膝药材质量的优劣;当YZL值≥0.9639时怀牛膝药材为优品,当YZL值≤0.6112时怀牛膝药材为劣品;验证性判断结果支持本文所建立的药材质量优劣评价新方法。

关键词：怀牛膝化学成分群图谱促成骨细胞增殖活性 PLS法 YZL值药材质量优劣判断方法

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