检索结果-内蒙古大学图书馆

脊柱外科杂志 2025年第1期23卷 67-72页

作者：马宏伟李刚全王磊甘谷县人民医院骨科天水741200

脊髓损伤(SCI)可导致部分运动、感觉和自主神经功能受损或缺失,严重影响患者的生活质量。全世界每年约有91万新发SCI病例[1]。创伤直接导致脊髓神经细胞死亡,或由内环境变化引发细胞器和蛋白质受损以及蛋白质错误折叠等间接导致细胞死亡... 详细信息

脊髓损伤(SCI)可导致部分运动、感觉和自主神经功能受损或缺失,严重影响患者的生活质量。全世界每年约有91万新发SCI病例[1]。创伤直接导致脊髓神经细胞死亡,或由内环境变化引发细胞器和蛋白质受损以及蛋白质错误折叠等间接导致细胞死亡,是SCI难以恢复的重要原因。

关键词：脊髓损伤分子伴侣介导的自噬综述文献

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分子伴侣介导的自噬在消化系统疾病的研究进展

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临床医学进展 2025年第1期15卷 1010-1018页

作者：李忠标宋志超青岛大学青岛医学院山东青岛淄博市第一医院肛肠外科山东淄博

自噬通过溶酶体分解和循环利用细胞成分,促进细胞质量控制和能量代谢。作为自噬的一种形式,分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)选择性降解细胞内含有KFERQ五肽的受损或异常蛋白,在维持细胞稳态中具有核心作用。近... 详细信息

自噬通过溶酶体分解和循环利用细胞成分,促进细胞质量控制和能量代谢。作为自噬的一种形式,分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)选择性降解细胞内含有KFERQ五肽的受损或异常蛋白,在维持细胞稳态中具有核心作用。近期研究表明,CMA通过调控脂质代谢、细胞周期和氧化应激等途径,在消化系统疾病中发挥重要功能。作为CMA标志物的溶酶体相关膜蛋白2A (lysosomal-associated membrane protein 2A, LAMP2A)有望成为诊断、预后及治疗消化系统疾病的潜在靶点。本文总结了CMA在肝癌、胃肠肿瘤、脂肪性肝病及炎性肠病等方面的研究进展,为相关疾病的临床诊疗提供新的视角。Autophagy promotes cellular quality control and energy metabolism by degrading and recycling essential cellular components via lysosomes. As a form of autophagy, Chaperone mediated autophagy (CMA) selectively degrades damaged or dysfunctional proteins containing the KFERQ motif within the cell, playing a central role in maintaining cellular homeostasis. Recent studies indicate that CMA regulates critical processes such as cell cycle, oxidative stress, and lipid metabolism, significantly influencing digestive system diseases. Lysosomal-associated membrane protein 2A (LAMP2A), a CMA marker, holds promise as a potential target for diagnosis, prognosis, and therapy. This review highlights CMA research progress in liver cancer, gastrointestinal tumors, fatty liver disease, and inflammatory bowel diseases, offering new perspectives for clinical management.

关键词：分子伴侣介导的自噬消化系统疾病溶酶体相关膜蛋白2A

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分子伴侣介导的自噬在阿尔茨海默病中作用的研究进展

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上海交通大学学报（医学版） 2021年第11期41卷 1529-1534页

作者：陈俊慧谷有全姚利和张薇王怀祥兰州大学第一医院神经内科兰州730013 兰州大学第一临床医学院兰州730013 兰州大学第二医院口腔科兰州730030 甘肃省张掖市甘州区人民医院重症医学科张掖734000

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经系统退行性疾病,其主要病理变化是β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)大量堆积形成的老年斑(senile plaque,SP)和细胞内Tau蛋白(Tau protein)过度磷酸化积聚形成的神经原纤维缠... 详细信息

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的神经系统退行性疾病,其主要病理变化是β淀粉样蛋白(amyloidβ-protein,Aβ)大量堆积形成的老年斑(senile plaque,SP)和细胞内Tau蛋白(Tau protein)过度磷酸化积聚形成的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)是一种选择性地将带有CMA基序的蛋白传递到溶酶体进行降解的过程。当自噬过程受损时,Aβ与异常磷酸化的Tau蛋白会大量堆积于神经元内,从而破坏细胞的正常功能并加速其死亡。相关研究表明,CMA是早期AD中异常蛋白质降解的重要途径,且该途径的失活可能在AD进展中发挥了重要作用。该文从CMA的概念、生理作用,CMA与AD的病理联系等方面进行综述,并对CMA途径的失活在AD中的作用进行详细阐述,以期为AD发病机制的研究及治疗提供新的思路。

关键词：分子伴侣介导的自噬阿尔茨海默病 Tau蛋白 β淀粉样蛋白

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分子伴侣介导的自噬对胆红素诱导的小鼠小胶质细胞损伤的影响

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中国当代儿科杂志 2024年第4期26卷 385-393页

作者：潘知繁李思宇李玲张燕华子瑜重庆医科大学附属儿童医院新生儿科/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地/儿童感染免疫重庆市重点实验室重庆400013

目的探讨分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)对未结合胆红素(unconjugated bilirubin,UCB)诱导的小鼠小胶质细胞BV2损伤的影响。方法BV2细胞实验分为两部分。(1)CMA激活实验分为:对照组(等体积二甲基亚砜处理)、QX77... 详细信息

目的探讨分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)对未结合胆红素(unconjugated bilirubin,UCB)诱导的小鼠小胶质细胞BV2损伤的影响。方法BV2细胞实验分为两部分。(1)CMA激活实验分为:对照组(等体积二甲基亚砜处理)、QX77组(20μmol/L QX77处理24 h)、UCB组(40μmol/L UCB处理24 h)、UCB+QX77组(20μmol/L QX77和40μmol/L UCB共处理24 h)。(2)细胞转染实验分为:LAMP2A沉默对照组(等体积二甲基亚砜处理)、LAMP2A沉默对照+UCB组(40μmol/L UCB处理24 h)、LAMP2A沉默组(等体积二甲基亚砜处理)、LAMP2A沉默+UCB组(40μmol/L UCB处理24 h)。采用改良MTT法检测细胞存活率,蛋白免疫印迹法检测p65、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)蛋白表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应法检测炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA相对表达量,ELISA法检测细胞培养上清液中炎症因子IL-6和TNF-α水平,免疫荧光法检测细胞内p65、NLRP3与热休克同源蛋白70的荧光共定位。结果与UCB组相比,UCB+QX77组细胞存活率升高,炎症相关蛋白p65、NLRP3、caspase-1表达水平降低,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相对表达量降低以及IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05)。与对照组相比,UCB组和UCB+QX77组热休克同源蛋白70与p65、NLRP3存在共定位。沉默LAMP2A基因后,与LAMP2A沉默对照+UCB组相比,LAMP2A沉默+UCB组炎症相关蛋白p65、NLRP3、caspase-1蛋白表达水平升高,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA相对表达量升高以及IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。结论CMA在UCB诱导的BV2细胞损伤中被抑制,激活CMA可能通过降低p65和NLRP3蛋白水平,抑制炎症反应,拮抗胆红素神经毒性。

关键词：胆红素分子伴侣介导的自噬神经毒性小胶质细胞

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分子伴侣介导的自噬在降解亨廷顿舞蹈病的蛋白Htt-552中的作用

分子伴侣介导的自噬在降解亨廷顿舞蹈病的蛋白Htt-552中的作用

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作者：齐琳苏州大学

学位级别：博士

目的:研究亨廷顿舞蹈病蛋白(Hungtingtin, Htt)氨基端片段Htt-552蛋白能否通过CMA途径进行降解;研究Htt-552与CMA途径作用的位点并探讨CMA选择性降解Htt-552的机制。方法:采用腺病毒介导野生型与突变型Htt-552片段转染的方法构建HD的细... 详细信息

目的:研究亨廷顿舞蹈病蛋白(Hungtingtin, Htt)氨基端片段Htt-552蛋白能否通过CMA途径进行降解;研究Htt-552与CMA途径作用的位点并探讨CMA选择性降解Htt-552的机制。方法:采用腺病毒介导野生型与突变型Htt-552片段转染的方法构建HD的细胞模型。利用免疫荧光标记法检测Htt-552蛋白在细胞内表达的水平,采用MTT法以及LDH法测定腺病毒Htt-552对细胞生存率的影响。Western Blot法检测使用大自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)、溶酶体抑制剂氯化铵(NH4Cl)对Htt-552片段在细胞蓄积的影响。Western Blot法及免疫荧光双标记法检测不同饥饿时间引起的不同自噬的最大自噬活性对蓄积的Htt-552片段表达水平的影响。免疫共沉淀和免疫荧光双标记法检测Htt-552片段与CMA通路的组成蛋白LAMP-2A和Hsc70的相互关系。Western Blot法及免疫荧光双标记法检测通过转染外源基因和RNA干扰改变CMA水平对Htt-552片段在细胞里表达水平的影响。Western Blot法检测分离的溶酶体对Htt-552片段的摄取与降解能力。免疫共沉淀以及免疫荧光双标记法检测了在突变了与Hsc70识别位点后,Htt-552片段通过CMA的降解情况,从而研究CMA降解Htt-552片段的机制。结果:腺病毒成功介导野生型与突变型Htt-552片段在细胞中表达,其在细胞内主要分布于细胞浆,细胞核内表达较少。3-MA可使Htt-552在细胞内的蓄积量明显增加,而NH4Cl可更显著的提高细胞内Htt-552片段的蓄积。饥饿6小时和12小时会分别最大限度地激活大自噬和CMA,在这两个时间点可以观察到蓄积的Htt-552片段减少。Htt-552与LAMP-2A和Hsc70有很好的共定位并观察到Htt-552片段与Hsc70的免疫共沉淀现象。激活CMA能使Htt-552片段的蓄积减少,而降低CMA活性会使Htt-552片段的蓄积增多。成功分离小鼠肝脏中的溶酶体并观察到溶酶体能够摄取和降解Htt-552片段。带有100Q的Htt-552片段不易穿过溶酶体膜从而更多的蓄积在溶酶体膜上,而带有18个polyQ的野生型Htt-552片段则更容易进入溶酶体腔中被酶类所降解。突变了两个Htt-552片段上的Hsc70所识别的“KFERQ”相似位点,并证实突变Htt-552片段上的CMA识别位点能够显著降低Htt-552的降解。说明Htt-552片段上存在CMA的识别位点。结论:Htt-552片段存在潜在的CMA识别位点,Hsc70通过识别位点与Htt-552相互作用,Htt-552片段通过溶酶体膜蛋白LAMP-2A进入溶酶体腔中被水解酶类降解,Poly-Q延长后, Htt-552进入CMA途径受阻,造成突变huntingtin细胞内蓄积。这些发现为寻找HD的治疗方法提供了新的思路。

关键词：亨廷顿舞蹈病分子伴侣介导的自噬溶酶体溶酶体膜受体分子伴侣蛋白

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分子伴侣介导的自噬在动脉粥样硬化中的作用及分子机制研究

分子伴侣介导的自噬在动脉粥样硬化中的作用及分子机制研究

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作者：乔磊山东大学

学位级别：博士

1研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovASCular disease,ASCVD）是一类以动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）为病理基础的疾病的总称,包含脑卒中、冠心病和外周动脉疾病等。ASCVD是目前导致我国人口死亡和残疾... 详细信息

1研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病（atherosclerotic cardiovASCular disease,ASCVD）是一类以动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）为病理基础的疾病的总称,包含脑卒中、冠心病和外周动脉疾病等。ASCVD是目前导致我国人口死亡和残疾的首要原因,给我国造成了沉重的社会负担,已成为我国重大的公共卫生事件。尽管医学的不断进步,AS的防治策略仍有待完善。因此,进一步深入研究AS的发病机制,探寻新的治疗靶点,对于提高我国ASCVD的防治疗水平具有重要意义。巨噬细胞是AS斑块中的主要细胞群,在AS的发生发展中起重要作用。巨噬细胞摄取脂质并转化为泡沫细胞,标志动脉粥样硬化病变的形成。巨噬细胞泡沫化加重了斑块的脂质负荷、炎症反应和斑块不稳定性。因此,如何减少巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质沉积,是治疗AS的一个重要靶点,一直备受科学家的关注。近年研究发现,自噬-溶酶体系统在AS的发生和发展过程中起到重要作用。溶酶体作为细胞的“废物处理系统”,是细胞处理和降解废弃或未被利用物质的主要场所。自噬是细胞以溶酶体为最终降解场所的一种分解代谢过程。自噬在调控脂质分解代谢中的重要作用是过去十多年中一个令人鼓舞的发现。自噬通过调控脂滴分解代谢和脂质排出降低细胞的脂质负荷。这些研究催生了“脂噬（L1βophagy）”这一概念,指脂滴通过自噬途径运输到溶酶体,在溶酶体酸性水解酶的作用下发生分解代谢的过程。促进脂噬过程是促进脂质代谢和胆固醇逆转运的重要途径。目前在AS领域中,关于自噬和脂质代谢关系的研究方兴未艾。根据降解底物运输到溶酶体的方式不同,自噬被人为的分为三种形式:大自噬（macroautophagy）、小自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）。三种自噬共存于真核细胞中,共同维持细胞稳态。其中,大自噬和分子伴侣介导的自噬（以下简称CMA）对哺乳动物细胞尤为重要。大自噬即我们平常所说的自噬,也是目前研究最为成熟的一种自噬。在过去10年中,已经充分证明大自噬参与了 AS的发生和发展。自噬通过改善内皮功能、促进巨噬细胞脂质代谢、降低斑块脂负荷和减轻斑块炎症等机制发挥抗动脉粥样硬化作用。然而人们对另一种自噬过程,即CMA在AS中的作用,知之甚少。CMA是不同于大自噬的另一种自噬过程。两者的差异主要体现在底物选择和运输方面。大自噬对底物选择缺乏特异性,其降解底物包含长寿蛋白、受损细胞器、脂滴和糖等成分;而CMA是一种具有严格选择性的自噬类型,其降解底物为胞质中带有特定标签（KFERQ序列）的蛋白质。CMA对底物的运输不需要大自噬过程中的典型双层膜性结构,而是通过热休克蛋白70（Hsc70）结合底物进而运送到溶酶体,与溶酶体膜上的LAMP-2A结合,进入溶酶体进行降解。相比于大自噬,CMA的选择性使其可精确有效地降解参与细胞生命活动的关键蛋白。近年发现,CMA参与调控肝细胞糖和脂代谢,如CMA通过促进脂滴相关蛋白的降解促进脂质分解代谢。这些研究将CMA和大自噬在脂质代谢中的作用联系起来,使得CMA成为调控脂噬过程的关键上游因子,为人类脂质代谢异常相关疾病提供了新的线索。目前,CMA在AS以及其他心血管疾病中尚无报道。由于动脉粥样硬化是一种以脂质代谢紊乱和慢性炎症为病理基础的疾病,以及CMA在肝脏糖脂代谢和免疫反应中的重要作用,我们推测CMA可能与AS的发病机制密切相关。因此,我们提出以下科学问题:在AS斑块中,哪种细胞主要承担CMA的功能?AS进展过程中,CMA如何变化?干预CMA是否影响AS进程?CMA在AS中的作用是否与调控巨噬细胞脂质代谢有关?本课题的研究有助于人们加深认识自噬-溶酶体系统在动脉粥样硬化中的作用,发现动脉粥样硬化新的发病机制,为动脉粥样硬化的治疗提供新的靶点。2研究目的（1）探讨CMA在AS进程中的动态变化;（2）探讨干预CMA对AS的影响。（3）探讨干预CMA后对巨噬细胞泡沫化的影响,分析CMA影响AS的机制。3研究方法3.1构建小鼠AS进展模型给予ApoE-/-小鼠不同时间高脂饮食,分别高脂喂养8周、12周、18周、24周和38周,在小鼠主动脉根部分别构建早、中、晚期斑块模型。3.2临床冠状动脉标本人体冠状动脉标本来自于本实验室冻存的尸检标本。标本经固定、包埋、冰冻切片。3.3构建巨噬细胞LAMP-2A基因特异性敲除小鼠LAMP-2A是CMA的限速蛋白,针对LAMP-2A进行基因干预是目前研究CMA的最可靠手段。分别在C57BL/6小鼠和ApoE-/-小鼠背景中构建巨噬细胞LAMP-2A特异性敲除小鼠,在体内阻断CMA过程,研究CMA对小鼠AS的作用及分子机制。3.4一般检测指标检测小鼠摄食量、体重、血糖、血脂

关键词：动脉粥样硬化自噬分子伴侣介导的自噬脂质代谢分子伴侣介导的自嗤 NLRP3炎性小体蛋白降解

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分子伴侣介导的自噬通过降解PARP1改善H2O2诱导的心肌细胞凋亡

分子伴侣介导的自噬通过降解PARP1改善H2O2诱导的心肌细胞凋亡

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作者：张丹丹南昌大学

学位级别：硕士

研究背景:磷酸腺苷核糖聚合酶1[Poly（ADP-Ribose）Polymerase 1,PARP1]是PRRP酶家族的典型代表,主要与DNA修复、基因的转录调控、炎症反应及氧化应激有关。研究发现,PARP1参与了多种心血管疾病的病理生理过程,如缺血再灌注损伤、心脏... 详细信息

研究背景:磷酸腺苷核糖聚合酶1[Poly（ADP-Ribose）Polymerase 1,PARP1]是PRRP酶家族的典型代表,主要与DNA修复、基因的转录调控、炎症反应及氧化应激有关。研究发现,PARP1参与了多种心血管疾病的病理生理过程,如缺血再灌注损伤、心脏重构以及血管炎症等。但迄今为止,仅发现PARP1经泛素依赖性蛋白酶体途径降解,是否存在其他的降解途径尚不明确。近年来,研究人员发现分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediated autophagy,CMA）参与了包括心血管疾病在内的多种疾病的分子调控。分子伴侣Hsc70（Heat shock protein 70）特异性识别带有“KFERQ”序列的底物蛋白,促进底物去折叠并与溶酶体相关膜蛋白2A（Lysosome-associated membrane protein 2A,LAMP2A）结合,继而进入溶酶体腔被降解。因此,CMA的抑制或过度激活都将引起细胞功能异常,最终导致疾病的发生。根据底物蛋白的特殊性,本团队首次发现PARP1具有“KFERQ”五肽序列。然而在心肌细胞中PARP1能否与Hsc70相结合,以及与CMA之间是否存在调控关系尚不明确。研究目的:本研究试图揭示CMA是否可以调控PARP1的蛋白表达,并进一步阐明在H2O2诱导的心肌细胞损伤中CMA调控PARP1表达的具体分子机制。研究方法:本研究采用原代乳鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）用于实验研究。1、明确CMA对PARP1表达的调控作用:（1）利用自噬激活剂平衡盐溶液（EBSS）自噬阻断剂氯喹（CQ）以及蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理NRCMs,使用Western Blot实验检测PARP1及其上下游蛋白的表达情况,明确PARP1是否经溶酶体降解。（2）通过Co-IP和免疫荧光共聚焦验证PARP1和Hsc70是否存在相互作用。2、明确CMA调控PARP1的具体机制:（1）通过构建LAMP2A基因过表达和干扰腺病毒载体来激活或抑制CMA,通过Western Blot检测PARP1及其上下游蛋白PAR和AIF的蛋白表达。（2）Western Blot检测激活或抑制CMA后,再利用自噬激活剂EBSS和自噬阻断剂CQ进一步验证PARP1是否经CMA途径降解。3、探究氧化应激损伤状态下,CMA对PARP1的调控作用:（1）利用H2O2构建细胞氧化应激损伤模型,通过TUNEL实验检测细胞凋亡情况。（2）利用Western Blot检测细胞应激损伤程度与蛋白表达量之间的关系。（3）利用免疫荧光共聚焦实验探究H2O2刺激后PARP1和Hsc70共定位的变化情况。研究结果:***1经溶酶体途径降解。NRCMs经使用自噬激活剂EBSS后,Western Blot结果显示PARP1蛋白表达水平逐渐降低,而经EBSS与自噬阻断剂CQ同时处理后,PARP1蛋白下降程度明显缓解。此外,NRCMs经线菌酮CHX抑制蛋白合成后,PARP1蛋白表达水平下降,而与CQ同时处理后,CQ也可显著缓解CHX导致的PARP1蛋白表达下降。***1与Hsc70存在相互作用。采用免疫共沉淀与免疫荧光共聚焦验证PARP1与Hsc70存在相互作用。PARP1基因的氨基酸序列符合“KFERQ”五肽基序特征,氨基酸序列位于353-357和670-674。***1在心肌细胞中经CMA途径降解。NRCMs经EBSS处理激活自噬后,Western Blot结果显示PARP1的上游蛋白PAR及下游蛋白AIF也呈下降趋势;利用巨自噬抑制剂3-MA和EBSS同时处理后,结果显示3-MA对PARP表达的影响不明显。此外,抑制CMA会导致PARP1及其上下游蛋白表达上升,且该趋势可以被自噬激活剂EBSS所逆转。反之,激活CMA导致PARP1及其上下游蛋白表达下降,并且该下降趋势可被自噬阻断剂CQ逆转。***可以通过抑制PARP1（cleaved）的蛋白表达来保护心肌细胞免受氧化应激所致的凋亡。4.1激活CMA可以抑制氧化应激导致的细胞凋亡TUNEL实验结果显示,H2O2刺激可导致细胞凋亡且呈浓度依赖性;激活CMA可有效抑制细胞凋亡。反之,抑制CMA则促进细胞凋亡。4.2激活CMA影响PARP1（cleaved）的蛋白表达Western Blot结果显示低浓度的H2O2可激活CMA,LAMP2A蛋白表达升高,PARP1（cleaved）的表达下降;而高浓度H2O2（>400?M）使CMA功能严重受损,导致细胞内的LAMP2A表达下降,而PARP1（cleaved）表达显著升高。此外,Western Blot结果显示激活CMA可以降低PARP1（full length）及PARP1（cle

关键词： PARP1 分子伴侣介导的自噬 Hsc70 氧化应激

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分子伴侣介导的自噬在系统性红斑狼疮中的作用

分子伴侣介导的自噬在系统性红斑狼疮中的作用

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作者：吴邱红川北医学院

学位级别：硕士

目的:检测系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)标志性分子溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associated membrane proteins,LAMP)-2表达,旨在探讨CMA与SLE发病的关系。方法:1.选取88例SLE患者(SLE)组和40例健康体检者(对照组),应用实时定量PCR检测两组受试者PBMCs中LAMP-2mRNA表达水平,分析与SLE患者临床特点及病情活动度的相关性。2.通过蛋白质免疫印迹法(Western Blot,WB)检测两组受试者PBMCs中溶酶体内LAMP-2A蛋白的表达水平。3.应用激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning Confocal Microscopy,LSCM)检测两组受试者PBMCs中LAMP-2A与溶酶体共定位。结果:***-2 mRNA表达水平在正常对照组为1.015±0.667,在SLE组为2.402±2.233(p=0.000)。进一步分析显示LAMP-2 mRNA表达水平与SLEDAI呈明显正相关(r=0.312,P=0.003),而且LAMP-2 mRNA表达增高患者的肾脏损害发生率明显高于非增高患者(40.7%vs 16.3%,p=0.013),其它临床、实验室检查指标,以及激素、羟氯喹和免疫抑制剂使用情况在不同LAMP-2 mRNA表达水平患者间并未发现有统计学意义的差异。***患者中LAMP-2A蛋白质表达水平显著高于正常对照组(0.482±0.207和0.294±0.190,t=2.319,p=0.03)。***患者LAMP-2A(绿色荧光)与溶酶体(红色荧光)较正常对照组荧光强度增加,绿色荧光与红色荧光融合后的黄色荧光较正常对照组明显增加,即SLE患者LAMP-2A与溶酶体共定位较正常对照组增加。结论:***患者LAMP-2 mRNA表达水平、LAMP-2A蛋白质表达水平及LAMP-2A与溶酶体共定位增加,提示SLE患者CMA功能增强,并且LAMP-2 mRNA表达水平增高与肾脏受累有关。2.通过干预调整CMA关键分子LAMP-2A水平,有望为SLE的治疗寻找新的靶点。

关键词：溶酶体相关膜蛋白2 自噬分子伴侣介导的自噬系统性红斑狼疮

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分子伴侣介导的自噬调节Keap1-Nrf2抗氧化应激反应的机制及在帕金森病发病中的作用研究

分子伴侣介导的自噬调节Keap1-Nrf2抗氧化应激反应的机制及在帕金...

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作者：朱林中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

研究背景及目的神经元的氧化应激损伤是包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)在内的多种神经退行性疾病的发病机制之一[1]。分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)是一种经溶酶体的选择性蛋白降解途径,主要进程包括:1... 详细信息

研究背景及目的神经元的氧化应激损伤是包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)在内的多种神经退行性疾病的发病机制之一[1]。分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)是一种经溶酶体的选择性蛋白降解途径,主要进程包括:1)分子伴侣Hsc70识别并结合含有KFERQ-like基序的蛋白底物,将其输送至溶酶体膜;2)底物经溶酶体膜上的LAMP2A进入溶酶体中降解。其中LAMP2A是CMA进程的主要限速因子[2]。CMA在轻-中度氧化应激条件下可被激活,通过降解氧化损伤蛋白质、维护胞核转录功能、线粒体形态等机制缓解神经元氧化应激损伤,维持神经元稳态[3,4]。然而应激条件下CMA维护神经元稳态以及抗氧化应激机制目前还远未得到阐明。Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)是机体中一个主要的抗氧化应激转录因子,通过转录表达多种抗氧化应激蛋白参与机体中的氧化稳态维持。研究已证实Nrf2水平下降可加重氧化应激导致的神经元损伤,加快PD的发生发展。Nrf2的水平主要受Keap1-CULLIN3泛素连接酶复合体调控。其中,Keap1作为配体介导CULLIN3持续泛素化Nrf2,使Nrf2经蛋白酶体降解。Keap1的修饰或者蛋白水平变化可直接影响Nrf2的稳定性与功能[5]。我们采用i TRAQ定量蛋白质组学技术,筛选了一批CMA的潜在底物,且发现Keap1也在其中。因此,本研究的主要目的在于,探究CMA是否可通过选择性降解Keap1进而上调Nrf2水平及功能,进一步阐明CMA抵抗神经元氧化应激的分子机制及CMA功能障碍在PD发病中的重要作用。实验方法1.检测激活CMA对Nrf2的影响。采用小鼠黒质多巴胺神经元细胞系SN4741细胞作为模式细胞,通过转染CMA关键因子LAMP2A增强CMA活性,通过Western blot、q PCR等检测Nrf2及下游靶基因m RNA水平。同时检测Nrf2的蛋白稳定性及泛素化水平。2.探究Keap1是否经CMA降解。采用SN4741细胞作为模式细胞,通过无血清处理、过表达LAMP2A或敲除LAMP2A调节CMA活性后检测Keap1水平变化;采用Gst-pull down及免疫共沉淀技术,检测CMA降解过程中的伴侣分子Hsc70与Keap1之间的结合;纯化溶酶体,体外检测Keap1能否直接被溶酶体结合并摄取;运用生物信息学分析,采用点突变等方法明确Keap1的KFERQ-like元件。3.探究氧化应激条件下CMA与Keap1-Nrf2信号通路之间的关系。采用SN4741细胞作为模式细胞,使用神经毒素6-OHDA处理细胞诱导氧化应激,检测相关蛋白变化。通过转染si-LAMP2A抑制CMA活性,并检测该情况下,6-OHDA处理对Keap1、Nrf2蛋白水平的影响。通过q PCR检测Nrf2下游基因的表达水平,并通过活性氧检测试剂盒和TUNEL染色检测细胞的ROS及凋亡水平。实验结果及结论1.过表达LAMP2A增强CMA活性能够明显上调细胞中Nrf2水平;核浆分离实验显示增强CMA活性后,胞核中Nrf2水平显著升高。使用放线菌酮(CHX)处理细胞,抑制细胞蛋白合成功能,从而检测Nrf2的降解速率后发现,增强CMA活性可以显著降低Nrf2的降解速率。Keap1与Nrf2结合导致Nrf2被持续泛素化降解,我们免疫共沉淀结果显示发现上调CMA活性后,Keap1与Nrf2的结合显著减少,并显著降低Nrf2的泛素化水平。此外,过表达LAMP2A上调CMA活性也可以促进Nrf2下游基因的表达。以上结果表明,CMA可以通过抑制Keap1对Nrf2的泛素化作用,从而稳定并上调Nrf2水平,促进Nrf2入核发挥转录功能。2.通过长时程无血清处理或过表达LAMP2A升高CMA活性可明显降低Keap1的蛋白水平;采用GST-pull down以及免疫共沉淀实验证明了Keap1与伴侣分子Hsc70相互结合;溶酶体体外结合及摄取实验显示Keap1可被高CMA活性的溶酶体结合并摄取降解。我们通过“KRERQ finder”,查找了Keap1的KFERQ-like基序为NELRL68-72,并采用点突变技术将NE突变为AA(NE/AA),免疫共沉淀结果显示NE/AA突变能够显著抑制Keap1与Hsc70的结合,进一步证实了Keap1含有KFERQ-like基序。以上结果表明,Keap1可经CMA途径降解。3.使用神经毒素6-OHDA处理SN4741细胞诱导氧化应激损伤,我们发现,Nrf2水平在6-OHDA处理下显著升高以抵抗氧化应激,并伴有LAMP2A水平升高以及Keap1的降低;使用si-LAMP2A抑制CMA活性可以阻断6-OH

关键词：分子伴侣介导的自噬 Keap1-Nrf2信号通路氧化应激帕金森病

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分子伴侣介导的自噬对胆红素诱导的小鼠小胶质细胞损伤的影响

分子伴侣介导的自噬对胆红素诱导的小鼠小胶质细胞损伤的影响

引用

作者：潘知繁重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)对未结合胆红素(Unconjugated bilirubin,UCB)诱导的小鼠小胶质细胞(BV2)损伤的影响。方法:BV2细胞随机分成(1)对照组(等体积二甲基亚砜处理)、QX77组(20μmol/L QX77处理24 h)、UCB组(40μmol/L UCB处理24 h)、UCB+QX77组(20μmol/L QX77和40μmol/L UCB共处理24 h);(2)LAMP2A沉默对照组(等体积二甲基亚砜处理)、LAMP2A沉默对照+UCB组(40μmol/L UCB处理24 h)、LAMP2A沉默组(等体积二甲基亚砜处理)、LAMP2A沉默+UCB组(40μmol/L UCB处理24 h)。改良MTT法检测细胞存活率,免疫印迹法检测p65、NLRP3、caspase-1蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应法检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA相对表达量和ELISA法检测细胞培养上清液中炎症因子IL-6和TNF-α水平,免疫荧光法检测细胞内p65、NLRP3与HSC70的荧光共定位。结果:与UCB组相比,UCB+QX77组细胞存活率升高,炎症相关蛋白p65、NLRP3、caspase-1降低,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA相对表达量降低以及IL-6、TNF-α释放减少(P<0.05)。与对照组相比,UCB组和UCB+QX77组HSC70与p65、NLRP3存在共定位。沉默LAMP2A后,与LAMP2A沉默对照+UCB组相比,LAMP2A沉默+UCB组炎症相关蛋白p65、NLRP3、caspase-1升高,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA相对表达量升高以及IL-6、TNF-α释放增加(P<0.05)。结论:CMA在UCB诱导的BV2细胞损伤中被抑制,激活CMA可能通过降低p65和NLRP3蛋白水平,抑制炎症反应,拮抗胆红素神经毒性。

关键词：胆红素分子伴侣介导的自噬神经毒性小胶质细胞

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