检索结果-内蒙古大学图书馆

中国水产科学 2008年第6期15卷 910-916页

作者：卜兴江仉晓文孙允东赵小凡王金星山东大学生命科学学院山东济南250100 安徽师范大学生命科学学院安徽芜湖241000

组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族,在哺乳动物中它与抗原提呈、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等许多生命活动有关。但对其在无脊椎动物中的功能了解的不多。从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到... 详细信息

组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族,在哺乳动物中它与抗原提呈、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等许多生命活动有关。但对其在无脊椎动物中的功能了解的不多。从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了组织蛋白酶L基因,为了进一步研究组织蛋白酶L的组织分布及其功能,对该基因进行了重组表达。将中国明对虾组织蛋白酶L基因的酶原片段亚克隆进原核表达载体pET30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,其分子量在40kD左右,与期望的中国明对虾组织蛋白酶L的分子量一致。表达产物形成包涵体,经过对包涵体变性和复性,并进行His-tag柱亲和纯化,得到了纯化的蛋白。利用重组蛋白制备了的兔抗血清。Western实验表明,组织蛋白酶L在中国明对虾的肝、胃、肠中有表达,而在卵巢中没有表达。

关键词：中国明对虾组织蛋白酶L 原核重组表达组织分布

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墨吉明对虾(Fenneropenaeus merguiensis)CrustinⅡ型基因的克隆与原核重组表达

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基因组学与应用生物学 2018年第1期37卷 229-237页

作者：刘燕张展雄李晓筠梁华芳陈兆明广东海洋大学水产学院

Crustin是一类具有广谱抗菌活性的且富含半胱氨酸的小分子抗菌肽,广泛分布于甲壳动物中。为研究CrustinⅡ基因在墨吉明对虾中的免疫功能,本研究采用了RT-PCR技术获得了墨吉明对虾CrustinⅡ基因的ORF序列,共390 bp,编码一个129个氨基酸... 详细信息

Crustin是一类具有广谱抗菌活性的且富含半胱氨酸的小分子抗菌肽,广泛分布于甲壳动物中。为研究CrustinⅡ基因在墨吉明对虾中的免疫功能,本研究采用了RT-PCR技术获得了墨吉明对虾CrustinⅡ基因的ORF序列,共390 bp,编码一个129个氨基酸残基的多肽,且具有典型的Ⅱ型Crustin基因结构：N-末端的信号肽、C-末端的WAP（whey acidic protein）结构域、Gly和Cys富集区;运用实时荧光定量PCR技术检测了CrustinⅡ基因在墨吉明对虾不同组织中的表达模式,数据分析表明,CrustinⅡ在血细胞中高量表达,而在肠道、鳃、肝胰腺、尾部肌肉、胃、眼柄和心脏组织中的表达量非常低,且具有显著性差异;同时本研究运用原核重组表达技术成功诱导出CrustinⅡ蛋白。本研究为进一步探究Crustin在对虾的先天性免疫功能和防御机制提供理论依据。

关键词：墨吉明对虾 CrustinⅡ 实时荧光定量PCR 原核重组表达

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猪细胞色素P450（CYP）3A22的原核重组表达及结构功能鉴定

猪细胞色素P450（CYP）3A22的原核重组表达及结构功能鉴定

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作者：林慧娜华南农业大学

学位级别：硕士

细胞色素P450(cytochromeP450，简称CYP450)是一类重要的亚铁血红素—硫醇盐蛋白超家族，由多种同工酶组成，在生物体内参与多种内源性物质的生物合成与降解，以及一些外源性化合物的代谢转化。近年来，畜禽产品中有害物质和药物残留逐... 详细信息

细胞色素P450(cytochromeP450，简称CYP450)是一类重要的亚铁血红素—硫醇盐蛋白超家族，由多种同工酶组成，在生物体内参与多种内源性物质的生物合成与降解，以及一些外源性化合物的代谢转化。近年来，畜禽产品中有害物质和药物残留逐渐成为食品安全监控的重点。研究表明人CYP 3A4是一种普遍存在于肝脏和肠上皮细胞的药物代谢关键酶。猪的细胞色素P450 3A22和人CYP 3A4的DNA序列相似性为75%，且两者在活性与结构的关键氨基酸位点上存在高度保守，因此我们推测，CYP 3A22可能是猪体内异源物质代谢中的关键酶。\n 目的：细胞色素CYP是一类膜结合蛋白，具有性质不稳定、容易聚集的特点，本课题重点针对猪CYP 3A22亚型，构建其重组蛋白原核表达与纯化体系。通过筛选合适的原核表达载体，优化重组蛋白的表达和纯化条件，结合蛋白质工程改造，期望最终获取一定量具有天然构象和催化活性的重组目的蛋白，进而对其结构与功能进行深入研究。\n 方法：本研究选用pCold TF、pET-28a、pET-32a和pET-43a四个表达载体进行比较筛选，从中确定有利于目的蛋白可溶性表达的最佳载体；比较宿主菌BL21和Ressetta的表达效果，选择最适的表达菌；确定IPTG诱导时的最适菌液OD600、培养温度和时间等参数，优化表达条件；利用定点突变的方法进行蛋白质工程改造，从而改善重组蛋白的表达量和溶解性；最后利用His tag单克隆抗体和人CYP 3A多克隆抗体对重组蛋白进行Western Blot鉴定，用圆二色谱测定其二级结构，并通过底物孵育结合HPLC检测特异性产物，以鉴定其酶催化活性。\n 研究结果：猪CYP 3A22重组蛋白的最适原核表达载体为pET28a，BL21为最适宿主表达菌，IPTG诱导的最适菌液浓度OD600为0.6～0.7，20℃诱导24h有利于目的蛋白的可溶性表达。经过一系列蛋白质工程改造之后得到了一个最佳突变体，它在目的蛋白的表达量和溶解度方面均有显著改善，该突变体是用6个亲水性氨基酸（KKREKR）替换了N端原有的39个疏水性氨基酸。对该重组蛋白进行结构与功能鉴定，圆二色谱检测结果显示重组蛋白CYP 3A22具有典型的α-螺旋结构；底物孵育实验可检测到特异性产物的生成，表明重组蛋白CYP 3A22具有一定的酶催化活性。\n 结论：本研究成功构建了猪CYP 3A22重组蛋白的原核表达与纯化体系，获得了具有天然构象和催化活性的重组酶蛋白，为进一步深入探讨关键CYP P450酶的结构与功能打下坚实的基础。

关键词：猪细胞色素P450 猪CYP3A22亚型原核重组表达结构功能鉴定指标

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CCL21的原核重组表达与抗肿瘤工程菌的构建及其应用研究

CCL21的原核重组表达与抗肿瘤工程菌的构建及其应用研究

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作者：李思田郑州大学

学位级别：硕士

CCL21是一种关键的趋化因子，它通过与G蛋白偶联受体CCR7结合，激活细胞内信号通路，进而诱导细胞向高浓度的CCL21区域迁移。已有研究发现，自然杀伤细胞(NKCs)和抗原提呈细胞(APCs)等肿瘤免疫效应细胞表面均表达CCR7受体，因此成为CCL2... 详细信息

CCL21是一种关键的趋化因子，它通过与G蛋白偶联受体CCR7结合，激活细胞内信号通路，进而诱导细胞向高浓度的CCL21区域迁移。已有研究发现，自然杀伤细胞(NKCs)和抗原提呈细胞(APCs)等肿瘤免疫效应细胞表面均表达CCR7受体，因此成为CCL21招募的潜在目标。这些效应细胞在肿瘤组织中的聚集能增强抗肿瘤免疫反应，但由于CCL21在淋巴组织中的高浓度与肿瘤组织中的低浓度差异，导致对效应细胞的招募能力受到限制。因此，构建一个富含CCL21的肿瘤微环境对于增强肿瘤免疫治疗的效果至关重要。　　尽管CCL21具备重要的生物学作用，但其应用具有明显的局限性，例如较短的半衰期、快速的代谢速率和高昂的生产成本。这些因素降低了其在临床治疗中的有效性和可行性。本论文中，我们将基因工程技术与药物递送的理念相结合，设计利用原核表达系统表达CCL21用于增强CCL21的治疗效果，研究在分子水平对CCL21蛋白进行重组构建以实现其在肿瘤部位的聚集和利用基因工程技术改造细菌以实现CCL21的可控表达与高效递送。本论文主要进行了两部分工作。　　***21在原核表达系统中的重组表达、纯化和体外活性研究　　本课题利用原核重组表达系统来生产CCL21,旨在减少生产成本。为了提升异源CCL21在大肠杆菌中的表达效率，我们进行了一系列优化，包括密码子优化、融合标签蛋白的使用以及诱导表达条件的调整。同时，我们在CCL21序列中整合了一种来自细菌视紫质蛋白的α螺旋低pH插入肽(pHLIP)。该pHLIP在弱酸性环境下能够自发折叠成α螺旋并插入细胞膜，从而将CCL21展示于细胞表面。鉴于肿瘤组织特有的酸性内环境，pHLIP的引入为CCL21识别和结合肿瘤细胞提供了一种高效的方式，有助于提高肿瘤免疫治疗的针对性和效果。　　将与Trx-Tag融合和密码子优化的目标蛋白的cDNA序列插入到pT7-LacO载体中得到重组质粒，经过质粒转化得到工程大肠杆菌。SDS-PAGE分析证明，工程细菌在0.1mMIPTG浓度条件下诱导4h可以得到最高诱导表达量，且低温诱导可以增加目标蛋白的可溶性表达。融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达保证了其生物活性并且可以直接用于纯化。通过镍柱层析技术纯化后得到高纯度的Trx-CCL21和Trx-CCL21-pHLIP。通过一系列体外活性实验证明，重组蛋白可明显促进表达CCR7细胞的迁移，同时pHLIP在酸性环境下可自发形成α螺旋。通过激光共聚焦荧光显微镜观察证明Trx-CCL21-pHLIP与4T1细胞具有酸响应的共定位效果，且定位效率随时间增加。并且切割标签蛋白之后对CCL21和CCL21-pHLIP的生物活性没有影响。利用基因工程技术实现CCL21的原核系统表达，同时在分子水平上对CCL21进行功能化修饰，使其能够高效地识别并定位肿瘤细胞膜，为CCL21的肿瘤治疗应用奠定了基础。　　***21在工程细菌中的可控表达和递送研究　　本课题基于基因工程技术，利用大肠杆菌作为CCL21的“制药工厂”，实现CCL21在工程大肠杆菌中的可控和持续性表达。利用细胞封装技术将工程细菌封装在甲基丙烯酰化明胶（GelMA）中制备载菌微球以抵抗胃肠道的恶劣环境，最后系统考察对小鼠MC38肿瘤模型的治疗效果。利用工程细菌作为CCL21的递送载体，有希望在肿瘤治疗领域发挥其潜在的应用价值。　　蛋白可控表达是工程细菌应用治疗的关键技术，本研究将CCL21分别利用pT7-LacO、pBV220和pDawn启动子表达，并且在目标蛋白的N端融合表达Trx-Tag,以探究其对目标蛋白可溶性表达的影响。结果表明CCL21可以分别以IPTG、热诱导和蓝光诱导的形式可控表达，同时与Trx-Tag融合表达可以显著增加其可溶性。为了保护工程细菌并提高其口服给药的利用率，我们将基因工程细菌封装于GelMA凝胶中，形成载菌微球，研究了不同诱导因子在微生物细胞工厂中引发蛋白质表达的敏感性。最后，我们利用经过封装的工程细菌对小鼠MC38结肠癌模型进行治疗，结果表明载菌微球能够显著抑制肿瘤的发展。通过流式细胞术分析显示肿瘤组织中CD4+和CD8+T细胞比例的增加，另外通过qPCR分析证实了其诱导了肿瘤组织中的TNF-α、IFN-γ和IL-6促炎细胞因子表达的提高，证明载菌微球有效诱导了抗肿瘤免疫反应，提高了对肿瘤的杀伤作用。这一研究通过基因工程技术实现了药物蛋白CCL21的可控表达，并利用细胞封装技术制备了载菌微球，有效提高了口服工程细菌的肠道利用率，成功诱导了肿瘤的消退，为CCL21用于生物治疗应用提供了新思路。

关键词： CCL21趋化因子肠道递送原核重组表达抗肿瘤工程菌

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弓形虫分泌蛋白ROP2的原核重组表达与免疫反应性鉴定

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寄生虫与医学昆虫学报 2014年第2期21卷 75-80页

作者：薛峰黄敏君洪彩玲杨英超甘绍伯谷俊朝首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所北京100050 热带病防治研究北京市重点实验室北京100050 中国食品药品检定研究院生物制品检定所寄生虫疫苗室北京100050

本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2（ROP2），并初步评价其免疫反应性。主要步骤为体外细胞培养速殖子，提取总RNA，反转录获得cDNA，PCR扩增ROP2基因全长，与pET-41 Ek／LIC载体通过基因重组直接连接，在大肠杆菌Rose... 详细信息

本研究在大肠杆菌工程菌中重组表达弓形虫棒状体蛋白2（ROP2），并初步评价其免疫反应性。主要步骤为体外细胞培养速殖子，提取总RNA，反转录获得cDNA，PCR扩增ROP2基因全长，与pET-41 Ek／LIC载体通过基因重组直接连接，在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白GST-6×His—ROP2，最后以重组蛋白与人源弓形虫抗血清的Western blotting反应评价rROP2免疫反应性。本研究获得了ROP2全长重组蛋白，初步证明其良好的免疫反应性，为进一步改进弓形虫免疫学诊断方法，研究分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白ROP2 原核重组表达免疫反应性

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弓形虫分泌蛋白ROP5的全基因原核重组表达与抗原性鉴定

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中国热带医学 2014年第3期14卷 259-263页

目的在大肠杆菌工程菌中重组表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白5(ROP5)的融合蛋白GST-6×His-ROP5,并初步评价重组蛋白的抗原性。方法体外细胞培养弓形虫速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP5基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过... 详细信息

目的在大肠杆菌工程菌中重组表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白5(ROP5)的融合蛋白GST-6×His-ROP5,并初步评价重组蛋白的抗原性。方法体外细胞培养弓形虫速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP5基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,最后通过Western blotting鉴定重组蛋白rROP5的抗原性。结果构建了弓形虫ROP5全基因重组表达质粒,诱导表达了GST-6×His-ROP5融合蛋白,分子量为96 kDa,与预测结果相符,重组蛋白与人源抗血清有显著免疫印迹反应。结论本研究获得了弓形虫ROP5全长重组蛋白,为进一步改进弓形虫诊断抗原,研究蛋白结构以及分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

关键词：刚地弓形虫棒状体蛋白ROP5 原核重组表达抗原性

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弓形虫致密颗粒蛋白GRA7的全基因原核重组表达

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中国热带医学 2013年第9期13卷 1045-1047,1050页

作者：洪彩玲薛峰黄敏君甘绍伯谷俊朝首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所北京100050 首都医科大学附属北京友谊医院热带病防治研究北京市重点实验室北京100050

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)的全长基因,在大肠杆菌工程菌中重组表达GST-His-GRA7融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA7基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)pL... 详细信息

目的克隆弓形虫RH株致密颗粒蛋白7(GRA7)的全长基因,在大肠杆菌工程菌中重组表达GST-His-GRA7融合蛋白。方法提取弓形虫总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增GRA7基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,最后采用SDS-PAGE和West ern blotting鉴定重组蛋白产物。结果构建了弓形虫GRA7全基因的重组表达质粒,诱导表达了GST-His-GRA7融合重组蛋白,分子量为62kD,与预测结果相符。结论研究获得了弓形虫GRA7全基因的重组蛋白,为进一步研究弓形虫GRA7抗原性及其与宿主细胞的相互作用奠定了基础。

关键词：刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7 反转录基因克隆原核重组表达

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一种贻贝酰胺酶型肽聚糖识别蛋白的分子特征及功能分析

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水生生物学报 2025年第2期49卷 116-128页

作者：阳宗欣王昊东何志巧肖文慧杨子霖张晓林何建瑜严小军廖智浙江海洋大学海洋科学与技术学院海洋生物蛋白质工程研究室舟山316022

从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)鳃组织中鉴定到一种新型贻贝肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein,PGRP)分子,为探讨其在贻贝先天免疫系统中的作用,对其开展了序列分析,表达模式,亚细胞定位,原核重组表达及表达产物的功能... 详细信息

从厚壳贻贝(Mytilus coruscus)鳃组织中鉴定到一种新型贻贝肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein,PGRP)分子,为探讨其在贻贝先天免疫系统中的作用,对其开展了序列分析,表达模式,亚细胞定位,原核重组表达及表达产物的功能验证研究。研究结果表明,厚壳贻贝新型PGRP由438个氨基酸残基组成。序列中含典型肽聚糖识别蛋白/酰胺酶(PGRP/Amidase)结构域,属于酰胺酶型PGRP。该蛋白在厚壳贻贝各组织中呈组成型表达特征。微生物胁迫可明显上调PGRP表达量,其响应速度和表达量上调幅度对不同微生物胁迫具有差异。利用原核重组表达技术成功表达出可溶性重组厚壳贻贝PGRP。对表达产物的功能验证结果表明,重组厚壳贻贝PGRP蛋白表现出明显的抑菌活性、细菌凝集活性和对PGN的酰胺酶活性,上述活性均具有锌离子依赖性。亚细胞定位分析结果表明,该PGRP分子主要定位于细胞核内。上述结果为深入了解厚壳贻贝的免疫识别机制奠定了基础。

关键词：肽聚糖识别蛋白荧光定量PCR 原核重组表达免疫厚壳贻贝

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重组蝎毒素多肽BmK IT和BmK IT-AP的原核表达及钠电流调制研究

重组蝎毒素多肽BmK IT和BmK IT-AP的原核表达及钠电流调制研究

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作者：韩玉莹延安大学

学位级别：硕士

钠通道在神经元兴奋性的调控和动作电位的产生等方面起着重要的作用。钠通道病是由于编码钠通道的基因发生突变、表达异常,或内环境中出现对钠通道具有致病性物质时,钠通道的结构或者功能发生不同程度的异常,从而导致机体生理性功能紊乱... 详细信息

钠通道在神经元兴奋性的调控和动作电位的产生等方面起着重要的作用。钠通道病是由于编码钠通道的基因发生突变、表达异常,或内环境中出现对钠通道具有致病性物质时,钠通道的结构或者功能发生不同程度的异常,从而导致机体生理性功能紊乱,所引起的先天或后天性疾病。动物毒素多肽是钠通道的天然分子工具之一。蝎毒素是一类由28-76个氨基酸残基构成的分子多肽。通常,类α长链蝎毒素多肽作用于钠通道,延缓钠通道失活,起致痛效应,而类β长链蝎毒素多肽则相反。但由于纯天然蝎毒素蛋白获得比较困难、成本高昂,致使对钠离子通道的研究受到极大限制。因此,蝎毒素多肽基因重组表达和改造是钠通道结构与功能研究的有效途径之一。本文通过在东亚钳蝎中克隆两种兴奋性昆虫毒素BmK IT和BmK IT-AP,其中BmK IT毒素成熟肽由69个氨基酸残基组成,包含4对二硫键,主要作用于昆虫细胞膜钠离子通道,能够引起动作电位的重复发放,增强峰钠电流,延缓峰钠传导的关闭,使昆虫兴奋性麻痹死亡。BmK IT-AP毒素成熟肽由72个氨基酸残基组成,包含4对二硫键,属于一类兴奋性昆虫选择性毒素。本实验通过将末端带有六个组氨酸的基因序列克隆到载体pET-32(a)中,成功构建重组质粒pET-32(a)-N-Tag(His)-BmK IT和pET-32(a)-N-Tag(His)-BmK IT-AP。再将这两个重组质粒转化到*** BL21(DE3)中进行原核可溶性表达,并通过优化诱导表达时间、IPTG浓度、诱导表达温度得到最佳表达条件;通过对缓冲液配比和流速的优化获得大量重组毒素BmK IT和BmK IT-AP。通过全细胞膜片钳检测对其生理化学性质进行深入研究,主要获得以下结果:根据Genbank中蝎毒素多肽BmK IT和BmK IT-AP成熟肽序列设计并优化密码子,按照大肠杆菌对密码子的偏好性合成BmK IT和BmK IT-AP的基因序列,构建表达载体pET-32(a)-N-Tag(His)-BmK IT和pET-32(a)-N-Tag(His)-BmK IT-AP。重组蛋白BmK IT的理论分子量为28553.333 Da,重组蛋白BmK IT-AP的理论分子量为28113.3333 Da。通过优化诱导条件,得出蝎神经毒素BmK IT最佳表达条件为:诱导表达时间为8 h,诱导物IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导温度20℃的条件下,目的蛋白表达量占总蛋白的43.5%;蝎神经毒素BmK IT-AP最佳表达条件为:诱导表达时间5 h,诱导物IPTG浓度为0.5 mmol/L、诱导温度为25℃的条件下,目的蛋白表达量占总蛋白量的44.1%。采用金属镍离子亲和层析法从离心后的菌体上清液中初步分离纯化出重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT和Tag(His)-BmK IT-AP;上样前测重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT菌体上清液浓度为30μg/ml,将10 ml的菌体上清液经过镍离子亲和层析,对洗脱峰进行冷冻干燥处理,得到10μg重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT,得率约为33.3%;上样前测重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT-AP菌体上清液浓度为35μg/ml,将10 ml的菌体上清液经过镍离子亲和层析,对洗脱峰进行冷冻干燥处理得到12μg重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT-AP,得率约为34.3%;再将镍离子亲和层析中的洗脱峰进行RT-HPLC纯化,得到电泳纯级的重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT和Tag(His)-BmK IT-AP。采用全细胞膜片钳实验检测表明,将10μmol/L的重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT作用于大鼠背根节神经元细胞,与对照组相比,其激活时间稍有延缓,峰钠电流值有微小增加,而10μmol/L的重组蝎毒素多肽Tag(His)-BmK IT-AP作用于大鼠背根神经节神经元细胞,给药组较对照组峰钠电流值明显减小,同时激活时间明显延长,综上,Tag(His)-BmK IT对SD鼠的DRG细胞膜钠电流无明显调节抑制,Tag(His)-BmK IT-AP对SD鼠的DRG细胞膜钠电流具有调制抑制活性。

关键词：蝎神经毒素原核重组表达 BmK IT BmK IT-AP 背根节钠电流

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斑马鱼抗寒模型的构建及鱼类相关基因功能探讨

斑马鱼抗寒模型的构建及鱼类相关基因功能探讨

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作者：王倩中国科学院研究生院（海洋研究所）

学位级别：博士

许多鱼类都具有非常重要的经济价值，并是我国主要的水产养殖品种。目前环境变化加剧，气温波动大并时常出现严寒气候，带来鱼类越冬死亡率高、越冬成本加大等问题，严重制约了鱼类养殖业的健康发展。因此，建立鱼类抗寒机理研究模型，... 详细信息

许多鱼类都具有非常重要的经济价值，并是我国主要的水产养殖品种。目前环境变化加剧，气温波动大并时常出现严寒气候，带来鱼类越冬死亡率高、越冬成本加大等问题，严重制约了鱼类养殖业的健康发展。因此，建立鱼类抗寒机理研究模型，研究阐明鱼类抗寒基因调控网络及其作用机理具有重要的应用意义。本研究对抗寒相关候选基因进行分析，采用肌肉Ⅲ型肌酸激酶（m3ck）基因构建转基因斑马鱼，探讨了低温下可能发挥作用的分子调控网络；对谷胱甘肽巯基转移酶M（GSTM）基因进行了DNA序列多态性分析，筛选出与鱼类低温耐受性相关的SNP分子标记；并对牙鲆IV型抗冻蛋白（AFP-IV）基因进行体外蛋白重组表达，以期对其抗冻活性进行体外分析。主要研究结果如下： 1、构建转基因质粒并通过显微注射方法获得了2个组织特异性转m3ck基因斑马鱼系，Tg(smyd1:m3ck)转基因鱼为骨骼肌特异性启动子smyd1驱动m3ck表达，Tg(cmlc:m3ck)转基因鱼为心肌特异性启动子cmlc驱动m3ck表达。将转基因鱼培养至F2代，其阳性率分别为34.90%（22/63）和58.75%（47/80）。低温处理后行为学观察结果显示，Tg (smyd1: m3ck)转基因鱼游动能力较好、身体偶有摆动、对外界刺激有应激性的鱼数目百分比均比野生斑马鱼显著增加（P <0.05），完全静止、身体出现翻转及死亡的鱼数目百分比均比野生斑马鱼显著减少（P<0.05）；Tg(cmlc:m3ck)转基因鱼仅表现为身体出现翻转的鱼数目百分比比野生斑马鱼显著减少（P<0.05）。生理指标检测结果显示，Tg(smyd1:m3ck)转基因鱼常温及低温下肌肉组织能量（ATP浓度）均比野生斑马鱼显著增加（P<0.05）；Tg (cmlc: m3ck)转基因鱼常温及低温下心脏组织能量与野生斑马鱼无显著差异。 2、以Tg (smyd1: m3ck)转基因鱼为模型，借助表达谱芯片分析常温及低温下转基因鱼与野生鱼基因表达变化。Microarray检测到1249个差异转录本，GO分析及KEGG pathway分析发现转基因斑马鱼的低温诱导基因主要涉及类固醇生物合成和磷酸肌醇代谢途径。这些途径主要参与环境适应、信号转导和细胞膜构建等生物过程。野生型斑马鱼的低温诱导基因涉及MAPK信号通路、NOD受体信号通路、Toll样受体信号通路、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转换等。此外，转基因鱼的低温抑制途径主要包括PPAR信号通路、细胞因子受体相互作用等途径，而野生斑马鱼包括原发性胆汁酸的生物合成、丙酮酸代谢、醚脂代谢和柠檬酸循环（TCA循环）等与能量代谢密切的生物过程。 3、以Tg (cmlc: m3ck)转基因鱼为模型分析能量对心脏的影响。F2代野生斑马鱼幼鱼与转基因鱼幼鱼（48hpf）分别进行低温（13°C）及常温（28°C）处理，心脏搏动频率统计结果显示，常温下野生斑马鱼心率为152.88±4.01次/分，低温处理后显著下降为41.20±4.13次/分（P <0.01）；常温下野生斑马鱼心率为187.50±7.84次/分，低温处理后为87.82±9.71次/分，均比野生斑马鱼显著增加（P <0.05）。且低温下转基因斑马鱼心率可达野生斑马鱼的57.44%。对早期心脏发育模式进行分析，发现转基因斑马鱼心脏发育时期比野生斑马鱼有明显提前。 4、运用PCR-SSCP技术对斑马鱼实验群体中低温耐受及低温敏感组进行GSTM基因多态性分析，在第1内含子中获得1个与低温耐受性状相关的多态位点，检测到DD、DE和EE3种基因型，共D、E2个等位基因，该群体的观测杂合度和期望杂合度分别为0.408和0.477，多态信息含量为0.362，在该位点符合Hardy-Weinberg平衡。连锁分析结果显示，这3种基因型与低温耐受性状显著相关（χ2=8.498，P <0.05）：DD基因型在耐低温群体中占优势（50.00%），并表现为对受低温胁迫斑马鱼的保护性因素（OR=0.520,95%CI=0.255-1.061），而DE基因型在不耐低温群体中占优势（51.31%），表现为低温胁迫下斑马鱼的危险因素（OR=3.012，95%CI=1.413-6.419）。研究结果为鱼类耐低温标记的筛选提供依据。 5、在牙鲆cDNA文库中筛得IV型抗冻蛋白（AFP-IV）同源基因AFP-IV-1、AFP-IV-2。AFP-IV-1基因cDNA全长为652bp，其开放阅读框为375bp，编码124个氨基酸残基；AFP-IV-2基因cDNA全长为781bp，其开放阅读框为465bp，编码154个氨基酸残基。应用原核表达系统进行体外重组表达，AFP-IV-1重组蛋白得到成功表达，融合蛋白的分子量理论值为19.36kDa KDa，主要以可溶形式存在，少

关键词：转基因斑马鱼基因芯片 PCR-SSCP 牙鲆抗冻蛋白原核重组表达

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