检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：白书婉浙江理工大学

学位级别：硕士

家蚕杆状病毒核型多角体蛋白(polyhedron, Polh)是昆虫杆状病毒的重要结构蛋白,其在外界极稳定,能保护病毒粒子免受物理和生化降解。将野生杆状病毒感染家蚕BmN细胞,待发病后收集细胞,根据天然Polh能溶解在碱性溶液中的性质,用pH 10.8... 详细信息

家蚕杆状病毒核型多角体蛋白(polyhedron, Polh)是昆虫杆状病毒的重要结构蛋白,其在外界极稳定,能保护病毒粒子免受物理和生化降解。将野生杆状病毒感染家蚕BmN细胞,待发病后收集细胞,根据天然Polh能溶解在碱性溶液中的性质,用pH 10.8的缓冲液溶解发病细胞裂解后的沉淀,离心,得到的上清中Polh含量达85%以上,通过阴离子交换柱和分子筛进一步纯化,得到纯度高达99%以上的天然Polh。将纯化的Polh免疫小鼠获得特异性高的多克隆抗血清,以此抗体作为一抗,通过Western blotting方法检测融合Polh的融合蛋白的表达。多角体蛋白基因作为融合伴侣与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合构建到原核表达载体pET-28a中,并在二者之间引入一个烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus, TEV)蛋白酶酶切位点,使其在***中表达,发现表达的重组蛋白显示了与天然多角体蛋白几乎完全一样的特性,在碱性缓冲液下快速的溶解,而且形成了稳定且易于分离的包涵体。通过差速离心与缓冲液pH变化,分离纯化得到Polh-EGFP融合蛋白,其纯度高达95%,融合蛋白的得率为79.3%。再用TEV酶切除多角体标签,获得纯的EGFP。本实验成功建立了原核表达的基于多角体蛋白融合的快速高效的纯化方案。Bax inhibitor-1(BI-1)是一种包含多个跨膜结构域的抗凋亡蛋白,其蛋白家族中的成员定位于内质网膜,通过Bcl-2调节细胞的凋亡。我们对本实验室构建的家蚕cDNA文库进行筛查时,发现一条与小鼠Bax inhibator-1有52%同源性的基因,生物信息学分析后,初步命名为BmBI-1(家蚕Bax inhibator-1), GenBank登录号是DN237509。为了进一步证实多角体基因在融合表达与纯化中的优势,将BmBI-1与Polh在家蚕杆状病毒表达系统进行融合表达。首先利用杆状病毒载体pFastBac HTb作为转座载体,将Polh-BmBI-1基因转座到杆状病毒基因组(Bacmid)上,构建Bacmid-Polh-BmBI-1。然后通过脂质体将Bacmid-Polh-BmBI-1转染家蚕BmN细胞得到重组病毒vBmPolh-BmBI-1 。以扩增后的重组病毒感染家蚕细胞,收集发病细胞,Western blotting和荧光定量PCR分析发现,Polh-BmBI-1基因在家蚕细胞中成功表达而作为对照的未融合Polh的BmBI-1无法表达。最后,将重组病毒vBmPolh-BmBI-1接种于五龄家蚕幼虫体内,待大部分蚕出现明显病毒感染症状后,大量收集蚕血淋巴。Western blotting检测发现Polh-BmBI-1融合蛋白在家蚕幼虫及蛹中成功表达,表达产物分子量在60 kDa左右,和融合蛋白预测的分子量一致。荧光定量PCR结果显示,在病毒感染细胞72 h后蛋白表达量最高。

关键词：家蚕 Bax inhibitor-1 多角体蛋白家蚕杆状病毒表达系统 Western blot

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鸭α干扰素在家蚕中的表达及抗病毒活性检测

引用

蚕业科学 2019年第5期45卷 706-712页

作者：王朋王先翔魏珍珍刘兴建张志芳李轶女胡小元易咏竹江苏科技大学生物技术学院江苏镇江212018 中国农业科学院生物技术研究所北京100081

鸭α干扰素(DuIFN-α)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤等生物学活性的细胞因子,可用于鸭及其他家禽养殖业中各种病毒性疾病的预防和治疗。将编码鸭α干扰素的基因序列密码子优化后进行合成,再对翻译起始序列进行优化,然后将2条序列分别克... 详细信息

鸭α干扰素(DuIFN-α)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤等生物学活性的细胞因子,可用于鸭及其他家禽养殖业中各种病毒性疾病的预防和治疗。将编码鸭α干扰素的基因序列密码子优化后进行合成,再对翻译起始序列进行优化,然后将2条序列分别克隆到杆状病毒转移载体上得到pVL1393-DuIFN-α和pVL1393-DuIFN-αm,与缺失orf1629的杆状病毒reBmBac共转染家蚕卵巢细胞系,获得携带目的片段的重组病毒reBmBac-DuIFN-α和reBmBac-DuIFN-αm。用重组病毒感染5龄起蚕后从血淋巴中获得表达产物,在鸡胚细胞中采用微量细胞病变抑制法检测表达产物对VSV?GFP病毒的抑制效果。结果显示,重组DuIFN-α产物的效价可达813×10^5U/mL,重组DuIFN-αm的效价可达307×10^5U/mL;重组病毒reBmBac-DuIFN-α经筛选纯化后,表达量提高,最高效价可达(190±025)×10^6U/mL。研究结果为利用家蚕杆状病毒表达系统表达生产高抗病毒活性的重组鸭α干扰素奠定了基础。

关键词：鸭α干扰素家蚕杆状病毒表达系统抗病毒活性

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鸭α、γ、λ干扰素在家蚕中的表达及其抗病毒活性检测

鸭α、γ、λ干扰素在家蚕中的表达及其抗病毒活性检测

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作者：王朋江苏科技大学

学位级别：硕士

近些年,我国家禽养殖业稳步发展,作为畜牧业中的重要一环,家禽养殖已经成为部分地区农民的主要收入来源。家禽业养殖模式逐渐从散养转向集约化和规模化,在规模化养殖中家禽病毒性疾病的爆发往往造成巨大的损失,在引起家禽死亡率的病因... 详细信息

近些年,我国家禽养殖业稳步发展,作为畜牧业中的重要一环,家禽养殖已经成为部分地区农民的主要收入来源。家禽业养殖模式逐渐从散养转向集约化和规模化,在规模化养殖中家禽病毒性疾病的爆发往往造成巨大的损失,在引起家禽死亡率的病因中病毒所占比例达到36%,水禽则是很多病毒的携带者。干扰素是一种具有强大抗病毒、免疫调节等多功能生物活性的细胞因子,对病毒性疾病有很好的治疗和预防效果。本研究采用基因工程的手段制备了鸭的Ⅰ型(α)、Ⅱ型(γ)和Ⅲ型(λ)干扰素,期望对鸭(禽)类病毒性疾病预防和治疗提供帮助。本研究首先对鸭α、γ、λ干扰素的基因序列进行设计优化,通过化学合成的方法获得基因序列,将鸭α、γ、λ干扰素基因构建到杆状病毒转移载体pVL1393的多克隆位点中,获得重组转移载体pVL1393-DuIFN-α、pVL1393-DuIFN-γ和pVL1393-DuIFN-λ,将重组转移载体与失活拯救型家蚕杆状病毒穿梭质粒reBmBac共转染BmN细胞,收集重组病毒rBmBac-DuIFN-α、rBmBac-DuIFN-γ、rBmBac-DuIFN-λ,用重组病毒感染家蚕幼虫并收获表达产物,并通过PCR、RT-PCR的方法证明了三种干扰素基因均重组到了家蚕杆状病毒基因组中,且随着病毒基因组在家蚕幼虫体内进行了复制和高效的转录。其次,本研究利用CEF/VSV-GFP系统对蚕血淋巴中的鸭α、γ、λ干扰素进行了抗病毒活性检测,即采用微量细胞病变抑制法,在CEF细胞上检测蚕血淋巴中的鸭干扰素对VSV-GFP病毒增殖的抑制效果,抗病毒结果显示蚕血淋巴中表达的重组鸭α、γ、λ干扰素都具有较强的抗病毒活性,重组鸭α、γ、λ干扰素抗病毒效价分别为8.13×10～5U/mL、3.0×10～5U/mL、6.1×10～5U/mL。最后通过空斑筛选对共转染病毒进行纯化,分别获得了高表达三种干扰素的病毒毒种,重组鸭α干扰素效价为(1.9±0.25)×10～6 U/mL,重组鸭γ干扰素效价为(8.65±0.52)×10～5U/mL,重组鸭λ干扰素效价为(1.56±0.1)×10～6U/mL,与未经纯化的重组病毒相比,纯化后的最高表达量的毒株所表达的干扰素效价均有2～3倍的提高。本研究利用家蚕杆状病毒表达系统对鸭的α、γ、λ干扰素进行了高效表达,经检测均由较强抗病毒活性。为廉价鸭(禽)用干扰素的生产奠定了基础,期待对鸭(禽类)病毒性疾病的防控和治疗有所帮助。

关键词：鸭α干扰素鸭γ干扰素鸭λ干扰素家蚕杆状病毒表达系统抗病毒活性

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猪ω7干扰素突变体及其制备方法和应用

猪ω7干扰素突变体及其制备方法和应用

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作者：张志芳李轶女胡小元易咏竹刘兴健王先翔赵璐璐赵泽王朋 100081 北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院生物技术研究所

本发明公开了猪ω7干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的猪ω7干扰素以及将其进行单位点突变获得的序列为SEQ ID NO.3所示的抗病毒活性提高的突变体。本发明将该突变体编码基因进行密码子优... 详细信息

标准号: CN108707194B

本发明公开了猪ω7干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的猪ω7干扰素以及将其进行单位点突变获得的序列为SEQ ID NO.3所示的抗病毒活性提高的突变体。本发明将该突变体编码基因进行密码子优化得到抗病毒活性明显提升的优化基因。本发明还将SEQ ID NO.3所示突变体分别进行氨基酸单位点突变、双位点突变和多位点突变获得多个抗病毒活性显著提高的猪ω7干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述猪ω7干扰素突变体，所表达产物的抗病毒活性大幅提高。本发明提供的猪ω7干扰素突变体能够用于制备预防或治疗猪病毒性疾病的药物或试剂。

关键词：干扰素突变体抗病毒活性点突变突变体家蚕杆状病毒表达系统制备方法和应用干扰素猪病毒性疾病氨基酸单位密码子优化生物反应器突变体编码氨基酸序表达产物优化基因多位双位制备基因预防治疗

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鸡λ3干扰素、其突变体及其表达方法和应用

鸡λ3干扰素、其突变体及其表达方法和应用

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作者：张志芳李轶女胡小元赵泽易咏竹邵丽萍杨鑫刘兴健赵璐璐阿斯兰·梅赫布 100081 北京市海淀区中关村南大街12号

本发明公开了一种鸡λ3干扰素、其突变体及其表达方法和应用。本发明公开了鸡λ3干扰素突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。本发明将鸡λ3干扰素突变体第150位氨基酸由谷氨酸突变成赖氨酸得到SEQ ID NO.5所示的突变体，其抗病毒活... 详细信息

标准号: CN108329390B

本发明公开了一种鸡λ3干扰素、其突变体及其表达方法和应用。本发明公开了鸡λ3干扰素突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。本发明将鸡λ3干扰素突变体第150位氨基酸由谷氨酸突变成赖氨酸得到SEQ ID NO.5所示的突变体，其抗病毒活性明显提高。本发明进一步将氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示突变体分别进行氨基酸单位点突变、双位点突变以及多位点突变，获得多个抗病毒活性显著提高的鸡λ3干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所获得的突变体，抗病毒活性提升显著。本发明提供的鸡λ3干扰素突变体在制备预防或治疗鸡病毒性疾病的药物或试剂中具有重要的应用前景。

关键词：干扰素突变体突变体抗病毒活性点突变氨基酸序家蚕杆状病毒表达系统干扰素谷氨酸鸡病毒性疾病氨基酸单位生物反应器赖氨酸氨基酸多位双位种鸡制备应用预防治疗

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猪λ3干扰素突变体及其制备方法和应用

猪λ3干扰素突变体及其制备方法和应用

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作者：李轶女张志芳胡小元易咏竹刘兴健宋浩志杨鑫杜梦潭张伟业 100081 北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院生物技术研究所

本发明公开了猪λ3干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的猪λ3干扰素及其编码基因。本发明将猪λ3干扰素编码基因按照家蚕密码子偏好性进行密码子优化得到抗病毒活性提升的SEQ ID NO.3所示... 详细信息

标准号: CN108484750B

本发明公开了猪λ3干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的猪λ3干扰素及其编码基因。本发明将猪λ3干扰素编码基因按照家蚕密码子偏好性进行密码子优化得到抗病毒活性提升的SEQ ID NO.3所示的优化基因。本发明进一步将SEQ ID NO.3所示的优化基因分别进行氨基酸单位点突变、双位点突变和多位点突变获得多个抗病毒活性呈显著提升的猪λ3干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述猪λ3干扰素突变体，所表达产物的抗病毒活性提高显著。本发明提供的猪λ3干扰素突变体能够用于制备预防或治疗猪病毒性疾病的药物或试剂。

关键词：干扰素突变体抗病毒活性点突变干扰素编码基因优化基因家蚕杆状病毒表达系统制备方法和应用密码子偏好性猪病毒性疾病氨基酸单位密码子优化生物反应器氨基酸序表达产物多位家蚕双位制备预防治疗

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利用家蚕杆状病毒表达系统表达虎杖白藜芦醇芪合酶基因

利用家蚕杆状病毒表达系统表达虎杖白藜芦醇芪合酶基因

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华东六省一市生物化学与分子生物学学会-2011年学术交流会

作者：潘晶晶潘华晔严珍珍张耀洲吴祥甫吕正兵浙江理工大学生命科学学院浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室

临床实验表明白藜芦醇对退化病有较好的预防和治疗作用,可改善内皮细胞功能,也是发挥其非酒精依赖性的心血管保护效应的机制之一。目前生产的白藜芦醇在其化学结构专一性、可食用安全度、生产周期长和原料合理利用开发及环境保护问题上... 详细信息

临床实验表明白藜芦醇对退化病有较好的预防和治疗作用,可改善内皮细胞功能,也是发挥其非酒精依赖性的心血管保护效应的机制之一。目前生产的白藜芦醇在其化学结构专一性、可食用安全度、生产周期长和原料合理利用开发及环境保护问题上都存在不利因素,故利用现代分子生物学手段生产天然药物以适应社会需求已成为当前制药行业的大势所趋。本研究利用Bac-to-Bac系统,设计一对引物通过位点特异转座,将虎杖白藜芦醇芪合酶基因的

关键词：白藜芦醇酶基因家蚕杆状病毒表达系统

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一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法及其重组杆状病毒和应用

一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法及其重组杆状病毒...

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作者：郝碧芳陈凯黄金山沈兴家 212008 江苏省镇江市京口区梦溪路2号

本发明公开了一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法及其重组杆状病毒和应用，该方法敲除家蚕核型多角体病毒的gp64基因，在此基础上回复截短了18个氨基酸的gp64基因，构建的重组病毒半数致死时间较对照延长了32小时，达到显著... 详细信息

标准号: CN110295196A

本发明公开了一种延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的方法及其重组杆状病毒和应用，该方法敲除家蚕核型多角体病毒的gp64基因，在此基础上回复截短了18个氨基酸的gp64基因，构建的重组病毒半数致死时间较对照延长了32小时，达到显著差异，但是重组病毒的一步生长曲线和对照没有显著差异。本发明制备用于延长家蚕感染核型多角体病毒死亡时间的重组杆状病毒，可以有效延迟感染家蚕幼虫的死亡时间，不影响病毒的增值。本发明的重组杆状病毒为利用家蚕杆状病毒表达系统在虫体内制备外源蛋白提供了更长时间。本发明提供的方法简单明了，易于理解、操作简单易行，效率高。

关键词：重组杆状病毒核型多角体病毒显著差异重组病毒家蚕制备家蚕杆状病毒表达系统家蚕核型多角体病毒死亡感染家蚕幼虫生长曲线外源蛋白影响病毒感染氨基酸构建截短敲除延迟回复致死体内应用

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鸭λ干扰素突变体及其制备方法和应用

鸭λ干扰素突变体及其制备方法和应用

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作者：胡小元张志芳刘兴健易咏竹李轶女王朋 100081 北京市海淀区中关村南大街12号中国农业科学院生物技术研究所

本发明公开了鸭λ干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先确定以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为鸭λ干扰素原始氨基酸序列并对鸭λ干扰素所有氨基酸序列进行比对得到SEQ ID No.3所示的鸭λ干扰素保守序列，对其编码基因进行密码子... 详细信息

标准号: CN110256552A

本发明公开了鸭λ干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先确定以SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为鸭λ干扰素原始氨基酸序列并对鸭λ干扰素所有氨基酸序列进行比对得到SEQ ID No.3所示的鸭λ干扰素保守序列，对其编码基因进行密码子优化得到SEQ ID No.5所示的优化基因。本发明还对该保守序列进行氨基酸单位点或多位点突变获得多个抗病毒活性提高的鸭λ干扰素突变体。本发明更进一步利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述的鸭λ干扰素或其突变体，所得到的突变体的抗病毒活性大幅提高，能够用于预防或治疗鸭病毒性疾病,对鸭养殖业中具有重大威胁的病毒性传染病具有显著的防御和抑制作用。

关键词：干扰素干扰素突变体抗病毒活性保守序列突变体家蚕杆状病毒表达系统原始氨基酸序列制备方法和应用病毒性传染病鸭病毒性疾病氨基酸单位氨基酸序列密码子优化生物反应器氨基酸序编码基因优化基因点突变比对多位养殖业防御治疗预防威胁

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羊λ3干扰素突变体及其制备方法和应用

羊λ3干扰素突变体及其制备方法和应用

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作者：李轶女张志芳胡小元易咏竹赵泽邵丽萍刘兴健杨鑫邹媛媛 100081 北京市海淀区中关村南大街12号

本发明公开了一种羊λ3干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了一种羊λ3干扰素突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。本发明将所述羊λ3干扰素突变体第58位氨基酸由丙氨酸突变成缬氨酸得到氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示... 详细信息

标准号: CN109929024A

本发明公开了一种羊λ3干扰素突变体及其制备方法和应用。本发明首先公开了一种羊λ3干扰素突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。本发明将所述羊λ3干扰素突变体第58位氨基酸由丙氨酸突变成缬氨酸得到氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的突变体，其抗病毒活性明显提高。本发明进一步将氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示突变体进行氨基酸单位点突变、双位点突变和多位点突变，获得多个抗病毒活性提高的羊λ3干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达的所述羊λ3干扰素突变体的抗病毒活性大幅度提高。本发明提供的羊λ3干扰素突变体能够用于制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂。

关键词：干扰素突变体抗病毒活性氨基酸序点突变突变体家蚕杆状病毒表达系统制备方法和应用氨基酸单位病毒性疾病生物反应器丙氨酸缬氨酸氨基酸多位双位制备预防治疗

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