检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：张建军山东农业大学

学位级别：硕士

核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus, 简称 NPV)是目前农林害虫生物防治中应用较多的病毒制剂之一。本文利用家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis virus,简称 BmNPV)感染多种农林业害虫,以期筛选出宿主域扩大... 详细信息

核型多角体病毒(Nuclear polyhedrosis virus, 简称 NPV)是目前农林害虫生物防治中应用较多的病毒制剂之一。本文利用家蚕核型多角体病毒 (Bombyx mori Nuclear polyhedrosis virus,简称 BmNPV)感染多种农林业害虫,以期筛选出宿主域扩大的病毒株系。并较为系统地研究了 BmNPV 对舞毒蛾 1-6 龄幼虫的感染情况,利用特定年龄生命表探讨了 BmNPV 对舞毒蛾幼虫的室内种群的控制作用以及 BmNPV 对舞毒蛾幼虫的弱化作用。 1 易感宿主昆虫的筛选通过室内感染 11 种农林害虫,其中甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、苹掌舟蛾(Phalera flavescens)、黄杨斑蛾 (Pryeria sinica)、舞毒蛾(Lymantria dispar)幼虫对 BmNPV 较为敏感, 感染发病率分别为 43.2%、56.3%、7.8%、16.4%。筛选舞毒蛾幼虫为易感宿主,以舞毒蛾幼虫为模式昆虫进行后期实验。 2 BmNPV 对舞毒蛾幼虫实验室种群的控制作用利用不同浓度病毒悬液感染不同龄期的舞毒蛾幼虫,结果表明对于各龄幼虫而言,浓度为 1.44×106PIB/ml 的 BmNPV 悬液感染效果最佳,1、 2、4、5 龄幼虫幼虫感染病毒后的死亡率分别达到 56%、54%、72%、73.3%。舞毒蛾 2 龄、4 龄幼虫对 BmNPV 较为敏感,死亡率均高于其它龄期幼虫, 1 龄幼虫对 BmNPV 的敏感性较差。由于 BmNPV 并非舞毒蛾本身专一性病毒,幼虫本身对 BmNPV 存在抗性,所以感染病毒后的发病时间相对延长。利用特定年龄生命表对舞毒蛾室内种群进行研究,存活个体各年龄阶段的平均生命期望值 ex 随舞毒蛾幼虫的生长发育呈下降趋势。但感染病毒的室内种群期望值较对照明显偏低。以 1 龄幼虫期最大,为 4.079,前蛹期最小,为 0.825。除卵期外,感染病毒的室内种群各虫态的死亡率均高于对照。表明舞毒蛾对 BmNPV 敏感,BmNPV 对舞毒蛾有一定的感染效果。感染病毒的舞毒蛾室内种群的种群趋势指标(I)约为 1.719。而对照的种群趋势指标(I)约为 9.200。说明 BmNPV 对舞毒蛾室内种群确实有一定的控制作用,但控制效果并不如同源病毒的控制效果理想。 1 家蚕核型多角体病(BmNPV)毒对其它农林害虫的感染及弱化作用研究 3 BmNPV 对舞毒蛾幼虫的弱化作用通过用 4 种浓度病毒感染 3 龄幼虫,感染病毒后幼虫的体重、体长生长均受到一定影响。相比较而言,1.44×106 PIB/ml 、1.44×107 PIB/ml 两种浓度病毒处理对幼虫体重增长的抑制作用较强;1.44×107 PIB/ml 、1.44 ×108 PIB/ml 两种浓度对幼虫体长增长影响较大。随着接毒浓度的增加, 幼虫体重、体长增长呈减缓趋势,但这种影响并不十分明显。当残存幼虫化蛹后,病毒的影响更加明显。残存幼虫所化蛹的蛹重显著轻于对照组。羽化率也明显低于对照组,仅为 58.9%。成虫的性比♀:♂为 1:3.05。接毒组成虫产卵量仅为 77.4 粒,而对照组成虫的产卵量达到 119.7 粒。但蛹历期和成虫寿命则无明显差异。结果表明 BmNPV 感染舞毒蛾幼虫后, 使宿主昆虫的化蛹率、羽化率和生殖力均有不同程度的下降,感染 BmNPV 确实对舞毒蛾产生较强的弱化作用。 4 感染 BmNPV 后舞毒蛾 5 龄、6 龄幼虫的呼吸代谢变化用Warburg呼吸计和红外CO2呼吸仪测定接毒后舞毒

关键词：家蚕核型多角体病毒宿主域弱化作用特定年龄生命表

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家蚕核型多角体病毒多角体单克隆抗体的制备与鉴定

家蚕核型多角体病毒多角体单克隆抗体的制备与鉴定

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作者：倪爱民江苏大学

学位级别：硕士

杆状病毒(baculovirus)是外形呈杆状的双链闭环的DNA大形病毒,杆状病毒主要以鳞翅目昆虫为宿主,其复制和装配是在宿主的细胞核内进行的。杆状病毒的病毒粒子常被特别地包裹在坚固的晶体颗粒中,这种晶体颗粒被称之为多角体(polyhedra),... 详细信息

杆状病毒(baculovirus)是外形呈杆状的双链闭环的DNA大形病毒,杆状病毒主要以鳞翅目昆虫为宿主,其复制和装配是在宿主的细胞核内进行的。杆状病毒的病毒粒子常被特别地包裹在坚固的晶体颗粒中,这种晶体颗粒被称之为多角体(polyhedra),多角体就像一个包裹,在不利的环境中可以保护有传染性的病毒粒子得以长期生存。多角体蛋白(polyhedrin)是病毒蛋白中最保守的蛋白之一,但多角体蛋白的结构以及多角体的包装机制目前仍未明确。为更进一步地研究这些机制,还有赖于更有效的检测方法。本研究运用杂交瘤技术制备了家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体的单克隆抗体(mAb),并对之进行了鉴定。主要研究和结果如下: 1. BmNPV多角体mAb的制备运用差速离心将BmNPV多角体颗粒分离纯化,再通过腹腔注射(IP)方式将已纯化过的BmNPV多角体颗粒直接免疫BaLb/c小鼠。然后取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在聚乙二醇(PEG-4000)作用下进行细胞融合,并用HAT培养基对融合的杂交瘤细胞进行选择性培养。运用间接ELISA检测,对能分泌抗BmNPV多角体抗体的杂交瘤细胞多次进行有限稀释法亚克隆培养。最终筛选出了一株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系,命名为D7。4个月内经连续传代和3次冻存复苏后,D7仍能稳定分泌抗体,说明该株杂交瘤细胞分泌单抗的能力稳定,具有较好的遗传稳定性。 2. BmNPV多角体mAb的鉴定对阳性杂交瘤细胞染色体、mAb亚类、效价和特异性等分别进行了鉴定。将D7染色体计数,发现其染色体数为99～108条,从遗传角度证明确实获得了杂交瘤细胞株。MAb亚型测定为IgG2a,轻链为kappa型,腹水ELISA效价为1:106～1:107。对获得的mAb采用Western blot方法分析,发现其与BmNPV多角体具有良好的特异性反应,与AcNPV、ClbiNPV和EoNPV多角体无交叉反应,而与ApNPV和PcrNPV多角体存在交叉反应。 3. BmNPV多角体mAb抗原表位的初步定位实验运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功构建并验证了一系列重组苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV),这些重组杆状病毒中融合有不同长度的BmNPV多角体片段(F1-6)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)。用这些病毒感染昆虫细胞,六种不同长度的蛋白F1-6-EGFP被表达出来。运用Western blot分析,mAb的抗原表位被初步界定在BmNPV多角体氨基酸序列100-180间。综上,本研究运用杂交瘤技术,建立了一株能稳定分泌抗BmNPV多角体mAb的杂交瘤细胞株,并对其生产的mAb进行了初步鉴定。抗BmNPV多角体mAb的成功制备为进一步研究杆状病毒以及其他相关方面的问题奠定了基础。

关键词：家蚕核型多角体病毒多角体单克隆抗体杆状病毒表达系统

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家蚕核型多角体病毒中RNA干扰抑制子的筛选与鉴定研究

家蚕核型多角体病毒中RNA干扰抑制子的筛选与鉴定研究

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作者：曹妮西南大学

学位级别：硕士

RNAi是由dsRNA触发的高度保守的基因表达调控机制,在植物和昆虫中,RNAi是一种主要的抗病毒防御机制。病毒进入宿主后,其复制过程中形成的dsRNA在宿主RNA酶ⅢDicer2的作用下,被切割成21-23nt的siRNA,siRNA随后被组装到RISC中,引导AGO2切... 详细信息

RNAi是由dsRNA触发的高度保守的基因表达调控机制,在植物和昆虫中,RNAi是一种主要的抗病毒防御机制。病毒进入宿主后,其复制过程中形成的dsRNA在宿主RNA酶ⅢDicer2的作用下,被切割成21-23nt的siRNA,siRNA随后被组装到RISC中,引导AGO2切割与其互补配对的mRNA,从而阻断病毒的复制。然而许多植物和动物病毒也进化出了RNAi的抑制子——VSR,来抑制宿主的抗病毒途径。这些VSR都是在病毒感染宿主过程中起到重要作用的蛋白,但它们在基因序列和病毒结构上并不保守,而且在RNAi机制中的作用位点也不相同。比如,FHV B2蛋白和DCV的1A蛋白可以与dsRNA结合,阻止dsRNA被识别及剪切成siRNA。FHV B2蛋白也可以与siRNA结合,阻止RISC的组装。而CrPV的1A蛋白、TCV的P38蛋白、poleorviruses的P0蛋白等通过与AGO2蛋白相互作用,阻止RISC的组装或作用于RNAi的效应阶段。而最近的研究发现,与AGO蛋白作用的一部分RNA干扰抑制子,通过保守的GW/WG motif与AGO蛋白结合,从而抑制RNAi应答。研究称,AGO蛋白中发挥与GW/WG motif结合功能是PIWI结构域。家蚕核型多角体病毒BmNPV是威胁蚕业生产的主要病毒,给蚕业生产带来巨大危害。为了促进对BmNPV的感染机制的了解,以开发应对之策,本篇研究对BmNPV能否抑制家蚕的RNAi进行了探索,并对其可能编码的RNA干扰抑制子进行了预测以及抑制子功能的鉴定。主要研究结果如下:***对BmN4-SID1和BmE细胞中RNAi的抑制作用的检测体外合成两条针对萤火虫荧光素酶的双链RNA——dsFluc1和ds Fluc2,将其与双荧光素酶报告基因共同转染BmN4-SID1细胞,对酶活的测定结果显示,两条dsRNA均抑制萤火虫荧光素酶的表达,即其均触发RNAi机制。而dsFluc2干涉引发的RNAi效应强于dsFluc1,因此选择dsFluc2进行实验。在未感染的BmN4-SID1细胞中,dsFluc2干涉引发的RNAi对萤火虫荧光素酶的沉默为dsRed的5倍,而在BV病毒感染的细胞中,这种基因沉默的现象基本得到回复,显示BmNPV可以抑制家蚕BmN4-SID1细胞中的RNAi过程。用dsFluc2与双荧光素酶报告基因共同转染BmE细胞,发现其对萤火虫荧光素酶的干扰为对照dsRed的27倍。而在BV病毒感染的细胞中,萤火虫荧光素酶基因的沉默也完全得到了回复,显示BmNPV同样可以抑制家蚕BmE细胞中的RNAi过程。因此,BmNPV编码RNAi的抑制子。2.对BmNPV中潜在的RNA干扰抑制子的预测研究用Blastx的方法在TCV、SPMMV和ToRSV的总蛋白中筛选含GW/WG motif的蛋白,分别得到2个、5个和5个含GW/WG motif的蛋白,发现已报道的这三个病毒的VSR-P38、P1和CP蛋白分别位于其中,证明可以用这种方法找出病毒中含GW/WG motif的抑制子。对BmNPV中含GW/WG motif的蛋白进行筛选,共得到16个蛋白,按照功能不同将其分为四类:结构蛋白、复制和表达相关蛋白、宿主机体调节蛋白及其他功能蛋白。这些蛋白在病毒DNA的复制、完整病毒粒子的组装、病毒进入宿主以及子代病毒的释放等过程中分别显示出重要功能。包膜蛋白GP64/67、ODV-E66和衣壳蛋白orf1629,38K和VP39是构成病毒粒子的主要蛋白,并在蛋白进入宿主和出芽过程中起重要作用。P47,DNA Polymerase和DNA Helicase作用于病毒DNA的复制,影响病毒增殖。Cystein Protease,Chitinase和p35调节宿主细胞状态,病毒在宿主体内复制及组装完成后,需要借助于前两者对宿主机体的降解和液化来把释放子代病毒,而受感染的细胞为保护同伴,会启动“自杀”程序——细胞凋亡来阻止病毒大量扩增,p35则作用于抑制细胞凋亡过程,帮助病毒为所欲为地在宿主体内扩增,并且研究发现p35在AcMNPV中的同源基因是RNAi的抑制子。P33、orf4和P48作用于BV增殖、ODV组装及成熟子代病毒产生,PIF1介导ODV进入宿主细胞膜,P43功能未知。另外,用VSR预测网站对BmNPV的总蛋白进行预测,筛选出5个预测值最高的蛋白,分别是DNA Polymerase,ODV-E66,以及作用于病毒基因的复制和表达过程的IE-1和LEF-3,包膜蛋白orf14。3.抑制子候选基因对RNAi的抑制研究及BmAGO2-PIWI domain的表达本次研究对预测的14个基因进行克隆及表达载体的构建,分别是BmNPVp35、LEF-3、IE1、GP64、Chitinase、Cystein prot

关键词：家蚕核型多角体病毒 RNA沉默 RNA干扰抑制子 GW/WG motif AGO蛋白

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家蚕核型多角体病毒FGF 的细胞和组织定位研究

家蚕核型多角体病毒FGF 的细胞和组织定位研究

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作者：宋志秀江苏大学

学位级别：硕士

成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factors,FGFs)大都发现于脊椎动物(包括人),是一种具有广泛生物活性的蛋白分子。已有研究表明,FGFs对机体发育、组织的结构与功能的维持、损伤的愈合与修复都有作用,还与肿瘤的发生和转移等多种... 详细信息

成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factors,FGFs)大都发现于脊椎动物(包括人),是一种具有广泛生物活性的蛋白分子。已有研究表明,FGFs对机体发育、组织的结构与功能的维持、损伤的愈合与修复都有作用,还与肿瘤的发生和转移等多种病理过程有关。本研究分离纯化了柞蚕多角体病毒(Antheraea pernyi nuclear polyhedrin virus,ApNPV),并在对该病毒DNA序列分析时,发现了一个与人源fgf基因相似的基因。该基因存在于所有已公布的杆状病毒全序列中,但功能未知。为了解该基因在病毒感染中所起的作用,本文在家蚕—杆状病毒的模型中对fgf基因进行了初步研究,包括对家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrin virus,BmNPV)的fgf基因进行了克隆、表达和功能的研究,主要结论如下: 1.克隆了柞蚕多角体病毒ApNPV中的fgf基因。该基因大小为558bp,其读码框含有185aa,是一个新基因。该基因已在GenBank上登录(登录号为AY641527)。 2.克隆和表达了家蚕核型多角体病毒中fgf基因。构建了原核表达载体pET28a-fgf,通过IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示在27kDa左右有一特异条带,与预测的蛋白质分子量大小一致。该蛋白在大肠杆菌中含量较高并以包涵体的形式存在,表达产物含有6个组氨酸残基,用Ni-NTA亲和层析柱高效纯化了表达产物。 3.以绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)作为融合基因,构建真核表达载体pCDNA3.1-gfp-fgf。该基因在高等哺乳动物细胞COS-7细胞中表达,并定位在细胞核内,可能影响COS-7细胞中DNA复制或基因的转录。 4.杆状病毒表达系统中,FGF在不同细胞系中表达定位不尽相同。构建重组转座载体Bacmid-gfp-fgf DNA,转染细胞获得重组病毒Ac-gfp-fgf,分别感染TN5和Sf9细胞使FGF在这两种细胞中过量表达,发现该蛋白定位于细胞膜。构建重组转移载体pBacPAK8-gfp-fgf与线性化的Bm-pBacPAK6 DNA共转染BmN细胞,该蛋白定位于BmN细胞的细胞核中。FGF在不同细胞中定位不同,

关键词：家蚕核型多角体病毒成纤维细胞生长因子绿色荧光蛋白表达定位

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家蚕核型多角体病毒云南株(Bm NPV-YN1)对不同龄期家蚕的侵染致病效应

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蚕业科学 2018年第5期44卷 692-697页

作者：唐芬芬陈松邵榆岚朱峰张永红白兴荣云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所云南蒙自661101 云南农业大学植物保护学院昆明650201

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是主要的家蚕病毒病病原之一,由其侵染家蚕引发的家蚕核型多角体病(血液型脓病)严重影响云南的蚕业生产。测定分离自云南蚕区的BmNPV株系(BmNPV-YN1)对家蚕1~5龄幼虫的毒力,并运用“时间-剂量-死亡率”模型模... 详细信息

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是主要的家蚕病毒病病原之一,由其侵染家蚕引发的家蚕核型多角体病(血液型脓病)严重影响云南的蚕业生产。测定分离自云南蚕区的BmNPV株系(BmNPV-YN1)对家蚕1~5龄幼虫的毒力,并运用“时间-剂量-死亡率”模型模拟分析该病毒株对家蚕各龄幼虫的感染致病力。结果表明,以浓度为1×10^8~1×10^5mL^-1的BmNPV-YN1多角体悬液添食处理后,家蚕各龄幼虫的感病死亡率随添食病毒多角体悬液浓度的降低而下降,添食1×10^7mL^-1BmNPV多角体悬液后第7天,家蚕1~5龄幼虫的累积死亡率分别为100%、76.67%、72.22%、56.67%和26.67%。BmNPV-YN1对家蚕幼虫的致病力与龄期相关,其敏感程度从高到低排序依次为1龄、2龄、3龄、4龄、5龄。用BmNPV-YN1多角体悬液添食家蚕1~5龄幼虫后第7天,致死中浓度(LC50)估计值分别为4.78×10^4mL^-1、5.38×10^5mL^-1、2.22×10^6mL^-1、7.95×10^6mL^-1和3.92×10^8mL^-1。在1×10^8~1×10^5mL^-1浓度范围内,BmNPV-YN1对家蚕幼虫的致死中时(LT50)与添食浓度相关,对1~4龄幼虫的LT50值随着BmNPV-YN1添食浓度的降低而增加。研究结果表明,BmNPV-YN1对家蚕具有较强的侵染致病效应,提示云南蚕区对血液型脓病的防控应以小蚕期为主,同时密切关注各龄期的眠初期。

关键词：家蚕家蚕核型多角体病毒时间—剂量—死亡率模型

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家蚕核型多角体病毒GD株空斑克隆株系的建立

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湖北农业科学 2010年第4期49卷 785-787页

作者：庞敏孙翰昌周泽扬重庆文理学院生命科学与技术学院重庆402168 重庆师范大学生命科学学院重庆400047

以家蚕胚胎细胞系(Bm E-SWU1)为病毒培养载体,利用中性红染色的方法对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)GD株进行了空斑克隆,经扩大培养,获得了GD株空斑克隆株系。根据Bm NPV CQ1株基因组序列的单核苷酸多态性(SNP)分析,选出其中SNP位点较多的... 详细信息

以家蚕胚胎细胞系(Bm E-SWU1)为病毒培养载体,利用中性红染色的方法对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)GD株进行了空斑克隆,经扩大培养,获得了GD株空斑克隆株系。根据Bm NPV CQ1株基因组序列的单核苷酸多态性(SNP)分析,选出其中SNP位点较多的gcn 2(General control nonderepressible 2)基因,用于验证BmNPVGD株空斑克隆株系的纯粹性。分别从BmNPVGD株和空斑克隆株的基因组中扩增gcn2基因,经pMD18-T克隆后测序;将两株病毒的gcn2基因分别进行SNP位点分析,发现GD株gcn2基因的潜在SNP位点有2个,而空斑克隆后的病毒株5条gcn2基因序列比较后均未发现多态性位点,说明空斑克隆株经纯化后,病原基因组的纯粹性获得了提高,病原得到了纯化。

关键词：家蚕核型多角体病毒空斑克隆 SNP位点纯粹性

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家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶BmNPV-POL的酶学特性分析

家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶BmNPV-POL的酶学特性分析

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作者：宋慧芳江苏大学

学位级别：硕士

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是杆状病毒的模式病毒之一，由该病毒所引起的家蚕核型多角体病毒病是导致我国夏秋季蚕茧减产的重要原因之一。生命有机体在生长繁殖过程中的一个主要事件就是遗传信息的传递，母代的遗传信息经过DNA的精确复... 详细信息

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是杆状病毒的模式病毒之一，由该病毒所引起的家蚕核型多角体病毒病是导致我国夏秋季蚕茧减产的重要原因之一。生命有机体在生长繁殖过程中的一个主要事件就是遗传信息的传递，母代的遗传信息经过DNA的精确复制得以传递给子代，在此过程中DNA聚合酶发挥着重要作用。由BmNPV ORF53编码的家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶(BmNPV-POL)就扮演着这一重要角色。但是国内外对BmNPV-POL的研究较少，无法获得高纯度的活性蛋白可能是其原因之一。\n 本研究首先采用***表达系统来尝试表达目的蛋白。通过对该基因序列进行密码子的优化以促进蛋白的表达效率，经全序列合成之后成功构建到pGEX-4T-2载体上，经诱导表达后用GST亲和层析柱和Mono Q离子交换柱纯化出了高纯度的融合蛋白GST-BmNPV-POL，经Western Blot分析和质谱检测结果正确，但所纯化出的酶活性较低，无法满足后续酶学功能分析的要求。因此，本课题研究又利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统来制备带His标签的融合蛋白。首先构建带目的基因的重组病毒并感染Sf-9昆虫细胞，利用Ni-NTA亲和层析柱从感染后的细胞粗纯化目的蛋白，再利用Mono Q离子交换柱进行进一步纯化，获得的目的产物经质谱鉴定结果正确。\n Superose6分子筛层析分析结果表明，真核系统表达的BmNPV-POL是以单聚体的形式在细胞内表达和装配，分子量约为110 KDa，与理论分子量一致。通过以poly(dA)/oligo(dT)为引物/模板的DNA聚合酶活性分析，获得了最佳的反应条件，在27℃，pH为8.0的条件下，反应30min左右，酶活性达最佳，其酶的比活性高达15，126.3 U/mg。研究发现KCl对BmNPV-POL的DNA聚合酶活性有一定的抑制作用，在0-50 mM浓度范围内酶活性几乎不受影响，但盐浓度超过50mM后，随着KCl浓度的升高，酶活性迅速降低。DMSO也会抑制酶的活性，随着DMSO浓度的升高，酶活性逐渐减低，在20％的DMSO存在的条件下，酶活性降至原来的三分之一。此外，该酶对Aphidicolin比较敏感，0.125μg/mL浓度的Aphidicolin就能使得酶活性急速下降。在以单链环状M13为模板的“M13”DNA活性分析时发现，BmNPV-POL在DNA复制过程中不依赖PCNA和RFC，但SSB可以促进病毒DNA的复制进程。\n 本论文研究结果为家蚕杆状病毒DNA复制机制的研究打下理论基础，也为由于BmNPV引起的家蚕脓病的生物防治以及利用家蚕作为生物反应器制备外源蛋白提供理论基础。

关键词：家蚕核型多角体病毒 DNA聚合酶 DNA复制蛋白表达酶学特性

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家蚕核型多角体病毒BmNPV orf59基因的功能研究

家蚕核型多角体病毒BmNPV orf59基因的功能研究

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作者：蒋磊浙江理工大学

学位级别：硕士

杆状病毒(Baculovirus)是目前已知昆虫病毒中类群最大且最有实用价值的病毒之一。杆状病毒是一类专一性感染节肢动物病毒,在感染周期中有两种表型不同但基因型完全一致的病毒形态,即出芽型病毒(Budded virus,BV)和包涵体衍生型病毒(Occl... 详细信息

杆状病毒(Baculovirus)是目前已知昆虫病毒中类群最大且最有实用价值的病毒之一。杆状病毒是一类专一性感染节肢动物病毒,在感染周期中有两种表型不同但基因型完全一致的病毒形态,即出芽型病毒(Budded virus,BV)和包涵体衍生型病毒(Occlusion-derived virus,ODV),杆状病毒基因组大小在80～180Kb之间。其中家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)大部分基因的功能在之前已被研究报道,但还有一些基因的功能是未知的。本文以BmNPV orf59(Bm59)为研究对象,研究该基因对BmNPV复制、转录、表达及组装的影响。Bm59是家蚕核型多角体病毒的核心基因之一,但在病毒生活周期过程中的作用尚未可知。本实验利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型重组病毒wtBacmid-polh-egfp、缺失型重组病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型重组病毒Bm59re-Bacmid-polh-egfp,并将3种重组病毒分别转染家蚕细胞BmN。病毒滴度测定结果表明3种重组病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值显著低于其他两种重组病毒(P<0.05),表明Bm59的缺失不能使杆状病毒彻底失去感染能力,但降低杆状病毒的增殖水平和感染能力。电镜分析结果发现Bm59ko-Bacmid-polh-egfp感染的细胞中只有少量细长的杆状结构,而其他两种重组病毒感染细胞后能够产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子,说明Bm59的缺失干扰病毒的增殖和包装。Q-PCR实验结果显示Bm59缺失型重组病毒基因组的复制能力显著低于其他两种重组病毒(P<0.05),qRT-PCR结果显示Bm59缺失型重组病毒早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平均显著低于其他两种重组病毒(P<0.05)。为研究Bm59基因的表达时相,构建了Bm59的原核表达载体,表达Bm59蛋白,纯化后制备多克隆抗体。Western Blot分析显示Bm59编码的蛋白在转染家蚕细胞(BmN)48 h后开始表达,且表达量随之增加,说明Bm59基因可能为晚期表达基因。综上所述,Bm59基因是病毒复制的非必需基因,但显著影响病毒的繁殖速度和组装;对病毒各个时期的基因转录也具有重要下调作用,且Bm59基因可能是一种晚期表达基因。

关键词：家蚕核型多角体病毒 Bm59基因 λRed重组系统 Bac-to-Bac系统 Q-PCR 多克隆抗体

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家蚕核型多角体病毒ORF4的研究

家蚕核型多角体病毒ORF4的研究

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作者：苏武杰江苏大学

学位级别：硕士

根据NCBI同源比对,发现BmNPV ORF4(Bm4)与AcMNPV ORF11同源性最高,达96%,两者长度皆为1020bp。在29种已测序的杆状病毒中,还有另外三种杆状病毒中有Bm4的同系物,这三种病毒分别是Plutella xylostella multiplenucleopolyhedrovirus,Rachplusia ou multiple nucleopolyhedrovirus和Maruca vitrataMNPV。在Bm4的启动子区有早期启动子基序。然而,目前Bm4的功能完全未知。为了研究Bm4基因产物在病毒感染环境下在细胞中的定位,我们用融合到Bm4 3'端的EGFP作为报告基因,以BmNPV杆粒作为载体来表达Bm4-EGFP。用共聚焦扫描显微镜观察发现:荧光信号主要集中在细胞核内,然而在细胞膜上也有较弱的信号。通过用SnaBI和BamHI酶切pFastBacl,切除多角体启动子,置换上iel启动子和Bm4启动子,我们成功构建了在iel启动子和Bm4启动子驱动下表达外源基因的重组病毒,为构建Bm4缺失病毒的拯救病毒奠定了基础。同时,用我们构建的pFastbac-4p-EGFP(EGFP在Bm4启动子驱动下的重组转座载体)转染家蚕细胞发现:在没有病毒因子作用下,EGFP在Bm4启动子的驱动下就能表达,说明Bm4是一个立即早期基因。为了缺失Bm4,构建了Bm4转移载体,并将其与BmNPV杆粒共转染家蚕细胞。所得病毒连续感染家蚕3遍,之后,纯化病毒一次。然后提取病毒DNA,并将其转化进感受态DH10B细菌。然后将感受态DH10B细菌涂到含有卡那抗生素、X-gal和IPTG的平板上。挑取蓝色菌落,用Bm4引物做PCR鉴定。鉴定出一个含有Bm4缺失的杆粒的菌落。提取Bm4缺失的杆粒,并将其转染进家蚕细胞,转染后5天,发现细胞有感染症状。收集上清再感染另一瓶细胞,发现有感染症状,说明Bm4在家蚕细胞中不是病毒繁殖的必需基因。为了排出第二位点突变的可能,我们利用Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统,以及多角体启动子被iel启动子和Bm4启动子替换的重组转座载体,构建了在Bm4缺失杆粒的多角体基因座位表达Bm4的拯救病毒。为研究Bm4基因产物的具体功能奠定了基础。总之,根据我们的实验结果,可知Bm4是一个其蛋白产物主要定位于核内的立即早期、非必需基因。

关键词：家蚕核型多角体病毒读码框4(ORF4) Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统亚细胞定位 ie1启动子基因敲除拯救实验

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家蚕核型多角体病毒埃及株p10基因的克隆及结构特征分析

引用

农业生物技术学报 2003年第5期11卷 483-487页

作者：姜丽华钟万芳蔡平钟徐兴耀阎文昭吴杰四川省农业科学院生物技术育种工程中心成都610066 华南农业大学蚕丝科学系广州510642 四川省农业科学院生物技术育种工程中心成都610066 四川省农业科学院生物技术育种工程中心成都610066 四川省农业科学院生物和核技术研究所成都610066 华南农业大学蚕丝科学系广州510642

根据BmNPV T3株中p10基因侧翼保守序列设计一对特异性引物,以家蚕核型多角体病毒埃及株(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus strain Egyptian,BmNPVEg)基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增得到p10基因(GenBank登录号:AF533970).扩增片段全长为877bp,含有1个213bp的开放阅读框(ORF)、编码70个氨基酸,推测其分子量为7.5kD.序列分析表明:与苜蓿银纹夜蛾(Autographa califomica)核型多角体病毒(AcMNPV)p10基因及张耀洲得到的BmNPVp10基因相比,BmNPV埃及株及BmNPVT3株的p10基因由于在ORF的第209nt后缺失了1个Datp,从而导致他们的编码区减少了24个氨基酸残基.与BmNPV T3p10相比,BmNPVEgp10又缺失了终止密码子TAA后66～67nt的1个10bp的序列,其中包括poly(A)信号序列.

关键词：家蚕核型多角体病毒埃及株 p10基因 PCR 序列分析

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