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中国蚕学会2018年学术年会

作者：沈运旺冯敏张健家王海萍许伟凡吴小锋浙江大学动物科学学院家蚕病毒与基因工程实验室

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的orf133(bm133)和orf134(bm134)是苜蓿银纹夜蛾核型多角体(AcMNPV)ac4和ac5的同源物。它们是两个相邻的基因,转录方向相反,并且在已测序的groupINPV中高度保守。为了能够研究单个或者同时研究两个基因的功能... 详细信息

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的orf133(bm133)和orf134(bm134)是苜蓿银纹夜蛾核型多角体(AcMNPV)ac4和ac5的同源物。它们是两个相邻的基因,转录方向相反,并且在已测序的groupINPV中高度保守。为了能够研究单个或者同时研究两个基因的功能,构建了一种bm133和bm134同时敲除的bacmid。与野生型和双修复病毒相比,在转染的细胞中,同时敲除bm133和bm134不影响BV的产生和病毒DNA的复制。电镜分析表明双敲除不影响核衣壳的组装,病毒诱导的核内微泡的形成和ODV的产生,但是被包埋进多角体的病毒粒子的数量显著下降。进一步分析表明,干扰任一基因均不能恢复ODV包埋的缺陷表型,表明Bm133和Bm134在ODV被包埋进多角体的过程中是缺一不可的。共聚焦显微镜观察发现在病毒感染期间,Bm133和Bm134同时分布在整个细胞。在裂解的细胞中,Bm134聚集在多角体上。这些结果表明,虽然Bm133和Bm134不是BV和ODV产生必需的,但是它们在多角体的形态发生过程中发挥重要作用。

关键词：家蚕核型多角体病毒 ORF133 ORF134 ODV包膜

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家蚕核型多角体病毒利用网格蛋白和动力蛋白依赖性的内吞途径进入BmN细胞

家蚕核型多角体病毒利用网格蛋白和动力蛋白依赖性的内吞途径进入...

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中国蚕学会2018年学术年会

作者：冯敏张健家许伟凡王海萍吴小锋浙江大学动物科学学院家蚕病毒与基因工程实验室

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是导致恶性蚕病并造成蚕业巨大经济损失的主要病原。BmNPV出芽型病毒粒子(BV)进入宿主细胞是启始感染的一个基本过程。然而对于BV入侵宿主机制的了解仍然有限,并且BV是否通过网格蛋白介导的内吞作用进入BmN细... 详细信息

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是导致恶性蚕病并造成蚕业巨大经济损失的主要病原。BmNPV出芽型病毒粒子(BV)进入宿主细胞是启始感染的一个基本过程。然而对于BV入侵宿主机制的了解仍然有限,并且BV是否通过网格蛋白介导的内吞作用进入BmN细胞也仍然未知。本研究利用抑制实验、透射电镜分析(TEM)、小RNA干扰(siRNA)敲低实验证明了BV是通过网格蛋白介导的内吞作用进入BmN细胞。更进一步,通过动力蛋白抑制剂处理后,BmNPV的入侵显著下降,表明动力蛋白也参与BmNPV的入侵。此外,通过siRNA干扰Rab5、Rab7和Rab11的表达,表明BV感染BmN细胞的内吞作用依赖于早期内体和晚期内体。综上所述,BmNPV通过网格蛋白和动力蛋白依赖性的内吞作用进入BmN细胞,并且Rab5和Rab7参与其中,而Rab11不参与。

关键词：家蚕核型多角体病毒网格蛋白动力蛋白感染机制

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家蚕核型多角体病毒遍在蛋白及结合肽的研究

家蚕核型多角体病毒遍在蛋白及结合肽的研究

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首届长三角科技论坛：长三角生物医药发展论坛

作者：张文波林蓉张耀洲吴祥甫浙江大学杭州 310029 浙江理工大学生物化学研究所杭州 310018 浙江大学杭州 310029 浙江理工大学生物化学研究所杭州 310018 中国科学院上海生化与细胞研究所上海 200031

从家蚕核型多角体病毒镇江株(Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus Zhenjiang strain，BmNPV-ZJ)基因组DNA中克隆遍在蛋白(BmVUB)基因。序列分析结果显示，BmVUB基因长234bp，编码77个氨基酸;BmVUB氨基酸序列内有一致HTH序列;遍在蛋白保守序列LRLRGG;参与遍在蛋白-蛋白酶复合体形成的四个保守性功能位点：Lys-29、Cys-48、Cys-63、Gly-76及保守的Gly-Gly-X(X是疏水氨基酸残基)蛋白酶切信号序列;在遍在蛋白保守的Gly-Gly后多出由一个氢基酸组成的延伸肽。原核诱导表达表明BmVUB主要以可溶性形式存在，表达量占总菌蛋白的50％以上。纯化的遍在蛋白浓度为1.03-2.46 mg/ml，制备抗体，效价在3.2 × 10-5以上。用噬菌体表面展示技术筛选遍在蛋白的结合肽，所筛选的结台肽可与遍在蛋白特异性结合，其中结台肽VAPHHAYAPMRT对细胞增殖有明显的浓度调控作用，即低浓度促进细胞生长，高浓度强烈抑制细胞的生长。

关键词：家蚕核型多角体病毒遍在蛋白噬菌体肽库结合肽基因克隆

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家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38及其宿主互作蛋白的研究

家蚕核型多角体病毒极早期蛋白PE38及其宿主互作蛋白的研究

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中国蚕学会第八届青年学术研讨会

作者：付绪亮唐旭东徐莉肖圣燕乐亚杰沈中元江苏科技大学中国农业科学院蚕业研究所

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是引起家蚕血液型脓病的病原体,主要寄生在血细胞和体腔内各种组织的细胞核中。PE38作为BmNPV侵染宿主的极早期蛋白,对于病毒的生长繁殖以及侵染性来说都具有极其重要的意义。本实验中采用酵母双杂交系统成... 详细信息

家蚕核型多角体病毒（BmNPV）是引起家蚕血液型脓病的病原体,主要寄生在血细胞和体腔内各种组织的细胞核中。PE38作为BmNPV侵染宿主的极早期蛋白,对于病毒的生长繁殖以及侵染性来说都具有极其重要的意义。本实验中采用酵母双杂交系统成功地反向验证了BmNPV PE38与宿主家蚕Bm ppm、BmSpk蛋白之间的相互作用。同时我们对Bm ppm、Bm Spk这两个家蚕基因运用实时定量PCR（RT-PCR）的方法分析了它们在BmNPV感染家蚕BmN细胞各个时期的时相表达,为进一步了解BmNPV与家蚕之间复杂的相互作用机制提供一定的分子基础。

关键词：家蚕核型多角体病毒 PE38 极早期蛋白酵母双杂交实时定量PCR

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家蚕核型多角体病毒ORF75基因的克隆及表达

家蚕核型多角体病毒ORF75基因的克隆及表达

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华中三省（河南、湖北、湖南）昆虫学会2006年学术年会

作者：尹新明江志伟安世恒河南农业大学植物保护学院河南农业大学植物保护学院河南农业大学植物保护学院

根据GenBank发表的序列(L33180)设计引物,以家蚕核型多角体病毒为材料,利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopol yhedr ovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段,将其克隆至pMD18-Tvector上,获得了该基因成熟蛋白阅读... 详细信息

根据GenBank发表的序列(L33180)设计引物,以家蚕核型多角体病毒为材料,利用PCR技术扩增了编码家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopol yhedr ovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段,将其克隆至pMD18-Tvector上,获得了该基因成熟蛋白阅读框序列。利用设

关键词：家蚕核型多角体病毒 ORF75 BmNPV

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家蚕核型多角体病毒囊膜糖蛋白GP64的研究进展

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广西蚕业 2019年第3期56卷 25-32页

作者：龙羽燕郭望蓝黄丽屈达才梁湘徐开遵广西大学农学院

为了探索GP64蛋白在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵和感染宿主细胞的作用机制,通过对BmNPV GP64蛋白的结构、功能、对病毒毒力的影响及其应用的研究进展进行综述,简述了GP64 蛋白与病毒致病力及病毒... 详细信息

为了探索GP64蛋白在家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)入侵和感染宿主细胞的作用机制,通过对BmNPV GP64蛋白的结构、功能、对病毒毒力的影响及其应用的研究进展进行综述,简述了GP64 蛋白与病毒致病力及病毒宿主域的相关性,以及BmNPV GP64 蛋白在基因工程领域的相关研究进展,旨在为BmNPV致病性的进一步研究,以及家蚕血液型脓病的防治研究提供参考,为杆状病毒研究以及新领域的开发应用提供研究依据。

关键词：家蚕核型多角体病毒 GP64蛋白家蚕血液型脓病

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可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分析

可用作生物杀虫剂的家蚕核型多角体病毒orf65、orf91的基因功能分...

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作者：唐琦江苏大学

学位级别：博士

家蚕是经济昆虫,它除了抽丝结茧,制造丝绸外,目前用家蚕作为食品及副产物的综合利用越来越多。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)是家蚕的主要病原体,每年,对我国的桑蚕业造成了巨大损失。然而,经过改造的... 详细信息

家蚕是经济昆虫,它除了抽丝结茧,制造丝绸外,目前用家蚕作为食品及副产物的综合利用越来越多。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)是家蚕的主要病原体,每年,对我国的桑蚕业造成了巨大损失。然而,经过改造的重组杆状病毒作为生物杀虫剂却能够减少农作物、食品中农药的残留及保护环境,因而已经逐渐取代传统的化学农药,广泛应用于农林防护。目前,越来越多的杆状病毒基因相继被研究报道。BmNPV基因组中还有部分基因功能未知,对这些未知功能的基因进行研究,有助于我们更加深入、全面地了解病毒自身增殖和侵染宿主的机制。基于这些理论,从分子水平上改造、修饰或替换掉某些基因,构建重组型的杆状病毒,从而更好地利用杆状病毒表达系统,或作为生物杀虫剂防治农林害虫。本研究选取了家蚕核型多角体病毒的早期基因(Bm65)和晚期基因(Bm91)为研究对象,分别从转录水平、表达水平、亚细胞定位、病毒结构定位等方面来探讨这些基因的基本特性。通过同源重组构建了相应的基因缺失型病毒,进一步对基因功能进行了研究。研究的结果主要如下：一.Bm65基因功能 1.生物信息学分析发现Bm65在鳞翅目核型多角体病毒基因组中高度保守。序列分析发现一个典型的早期转录基序TATA位于起始密码子上游,预示Bm65可能为早期基因。Bm65编码一个含有104个氨基酸残基,理论分子量为12.2kDa的蛋白。InterProScan软件分析结果显示,Bm65蛋白属于一个功能未知的GIY-YIG核酸内切酶超家族,推测该基因可能与病毒DNA复制有关。 2.利用大肠杆菌表达系统表达Bm65蛋白,制备了抗血清。此外,利用AcMNPV在sf9细胞中真核表达Bm65蛋白,为下一步该蛋白的纯化及体外内切酶活性的鉴定提供基础。 3.转录时相分析显示Bm65的转录从病毒感染宿主细胞6h后开始到感染后72h.5'RACE分析显示Bm65只有一个位于ATG上游14个核苷酸处的转录起始位点。荧光共聚焦显微镜观察发现Bm65既位于感染后宿主的细胞质又位于细胞核。 4.利用Red重组系统,用Cm基因成功地取代了Bm65后,通过抗性筛选得到缺失型病毒,并通过转座的方式获得带有polh和gfp的野生型、Bm65缺失型、补回型病毒。利用重组型病毒转染细胞后,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,结果显示Bm65缺失后不能产生有感染性的病毒粒子。荧光定量PCR结果进一步证明Bm65缺失后不影响病毒DNA的复制。以上结果表明Bm65为病毒增殖的必需基因,但对于病毒DNA的复制而言是非必需的。二.Bm91基因功能 ***91被预测是一个包含105个氨基酸残基、理论分子量为11.8kDa的蛋白,在鳞翅目核型多角体病毒中高度保守。一个典型的晚期转录基序TAAG位于起始密码子上游13个核苷酸处,预示Bm91可能为晚期基因。软件分析结果显示,Bm91属于一个功能未知的杆状病毒11kDa蛋白家族,推测该基因可能与病毒粒子的形成有关。 2.原核表达Bm91蛋白,制备多克隆抗体。转录分析表明,Bm91在病毒感染宿主细胞12h后开始转录,一直持续到感染后96h,且只有一个位于起始密码子ATG上游12个核苷酸处的转录起始位点。从病毒感染BmN细胞后24h开始到96h都能在病毒感染的细胞中检测到Bm91的表达。亚细胞定位显示Bm91定位于病毒感染后的BmN细胞的细胞质和细胞核。免疫印迹实验结果表明Bm91是ODV囊膜上的特异性蛋白。N-糖基化抑制实验显示Bm91未经过N-糖基化修饰。 3.成功构建了Bm91缺失型病毒,通过转座得到带有polh和gfp的Bm91缺失型、补回型重组病毒。进一步的转染和感染实验发现,Bm91缺失后不影响有感染性的病毒粒子的产生,且该基因缺失后产生的BV较野生型病毒相比,滴度没有明显的变化。幼虫生物学测试实验显示缺失该基因不影响重组病毒感染宿主幼虫的半数致死剂量LD50,却使得宿主幼虫的半数致死时间LT5o延长了24h,提示Bm91为病毒增殖的非必需基因,但该基因可能与病毒毒力有关。以上结果在分子水平上补充和丰富了BmNPV基因功能的研究情况,为全面了解病毒的感染和增殖机制打下基础,也为该病毒的改造和利用提供理论依据。

关键词：杆状病毒家蚕核型多角体病毒 Bm65 Bm91 基因敲除囊膜组分

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ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

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蚕业科学 2008年第2期34卷 250-256页

作者：薛仁宇曹广力王崇龙刘波沈卫德贡成良苏州大学基础医学与生物科学学院江苏苏州215123

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕Bm... 详细信息

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。

关键词： RNA干扰转基因家蚕核型多角体病毒家蚕细胞 ie-1基因 lef-1基因

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Bm59基因缺失对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制、转录及组装的影响

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蚕业科学 2016年第2期42卷 266-273页

作者：蒋磊田星巩成见于威舒建洪吴银丽童富淡浙江理工大学生物化学研究所杭州310018 浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室杭州310018 宁海县动物卫生监督所浙江宁海315600

Bm59是家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)的核心基因之一。利用λRed重组技术和Bac-to-Bac系统构建野生型病毒wt Bacmid-polh-egfp、缺失型病毒Bm59ko-Bacmid-polh-egfp以及补回型病毒Bm59re-Bacmidpolh-egfp,并分别转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,研究Bm59基因在病毒侵染、增殖和组装中的功能。对病毒滴度的检测结果表明3种类型病毒都能产生有活力的子代病毒并使细胞感染发病,但Bm59ko-Bacmid-polh-egfp在各个时相的滴度值均显著低于其他2种类型病毒(P<0.05)。电子显微镜下观察Bm59ko-Bacmid-polh-egfp转染的细胞中只有少量细长的杆状病毒粒子,而其他2种类型病毒转染细胞后则能产生大量具有囊膜包裹的成熟病毒粒子。qRT-PCR检测结果显示,Bm59缺失型病毒基因组DNA的复制能力显著降低(P<0.05),早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平显著低于野生型病毒(P<0.05)。综上所述,Bm59基因虽然是家蚕核型多角体病毒复制的非必需基因,但会显著影响病毒的增殖速度和病毒粒子的组装,对病毒各个时期的基因转录水平具有下调作用。

关键词：家蚕核型多角体病毒 Bm59基因 λRed重组系统 Bac-to-Bac系统 qRT-PCR

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家蚕核型多角体病毒对家蚕酚氧化酶活性及其基因表达的影响

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中国农学通报 2016年第32期32卷 25-28页

作者：唐芬芬杨伟克朱峰邵榆岚张永红白兴荣云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所云南蒙自661101 云南农业大学植物保护学院昆明650201

为明确家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染对家蚕血淋巴酚氧化酶活性及其基因表达的影响,以5龄起蚕为实验材料,经口添食BmNPV,采用实时荧光定量PCR的方法检测了血淋巴酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表达情况,同时测定了酚氧化酶的活性。结果表... 详细信息

为明确家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染对家蚕血淋巴酚氧化酶活性及其基因表达的影响,以5龄起蚕为实验材料,经口添食BmNPV,采用实时荧光定量PCR的方法检测了血淋巴酚氧化酶原基因PPO1和PPO2的表达情况,同时测定了酚氧化酶的活性。结果表明,PPO1和PPO2基因均是在添食BmNPV后6 h和9 h出现上调表达,但相对表达量有一定差异;另外,酚氧化酶活性在添食BmNPV后6 h和9 h显著高于对照组,而在24 h急剧下降,显著低于对照组。酚氧化酶作为一类体液免疫因子,很可能参与了家蚕对抗BmNPV侵染的免疫防御反应。

关键词：家蚕核型多角体病毒血淋巴酚氧化酶活性基因表达

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