检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：朱庆庆华东理工大学

学位级别：硕士

绿豆环氧水解酶能对映归一性水解消旋环氧化物生成单一构型的二醇,在手性合成领域具有重要的应用前景。绿豆中至少存在两种选择性不同环氧水解酶（mbEH A和mbEH B）,本课题组已获得mbEH A （VrEH1）的编码基因vrehl,并对重组酶mbEH A进... 详细信息

绿豆环氧水解酶能对映归一性水解消旋环氧化物生成单一构型的二醇,在手性合成领域具有重要的应用前景。绿豆中至少存在两种选择性不同环氧水解酶（mbEH A和mbEH B）,本课题组已获得mbEH A （VrEH1）的编码基因vrehl,并对重组酶mbEH A进行了表征。本论文成功地克隆了另两个环氧水解酶基因vreh2和vrehg。vreh2的开放阅读框（ORF）含957 bp,编码318个氨基酸和一个终止子,编码产物与大豆环氧水解酶（Glycine max, XP003554634.1,87%）和苜蓿环氧水解酶（Medicago truncatula, XP003626245.1,86%）高度同源,但与VrEH1（ADP68585.1）和土豆环氧水解酶(Solanum tuberosum, AAA81892.1的同源性仅有72%和57%。vrehg与vrehl高度相似,均编码319个氨基酸,基因水平同源性为99%,蛋白水平同源度为98%。成功构建了vreh2和vrehg的表达载体并在大肠杆菌BL21（DE3）进行了表达,IPTG浓度为0.1mM条件下,15℃诱导16小时,VrEH2和VrEHg表达量占菌体总蛋白的25-35%,且主要以不溶的包涵体表达为主。降低诱导剂IPTG浓度、改变菌体破碎用缓冲液pH、更换含可溶性标签的载体和／或表达菌株均不能明显改变vreh2不溶性包涵体表达的状态。Ni-亲和层析一步纯化了重组VrEH2,纯化倍数为925,酶活回收效率为40%。重组VrEH1和VrEH2的最适pH和最适反应温度分别为7.7,45℃和6.5,30℃。VrEH2对表面活性剂和金属离子不敏感。10%异辛烷对重组VrEH2酶活力没有大的影响,并能明显提高产物的对映体过量值（eep=89%）。VrEH1优先水解（S）-pNSO,其KM, S, KM, R和kcat,S,kcat,R分别为5.5,1.4 mM和6.2,0.42s-1；相对应,VrEH2优先水解（R）-pNSO,其KM, S, KM, R和kcat, S, kcat, R分别为1.44,0.019 mM和0.13,1.76 s-1。VrEH1和VrEH2均优先进攻pNSO的a碳原子,VrEH1的选择性系数为α（R）/β（R） =13/87, α（S）/β（S）=83/17;VrEH2的选择性系数为α（R）/β（R）=7/93, α（S）/β（S）=72/28。VrEH1和VrEH2对多种含苯环的环氧底物（BGE, PGE等）有活性,活力均比对pNSO高。除VrEH2对3M-PGE有对映会聚性外,VrEH1和VrEH2对其他底物均表现为对映选择性。

关键词：绿豆环氧水解酶对映归一性对硝基苯乙烯氧化物表征

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新型菜豆环氧化物水解酶的异源表达及对映归一性催化特性

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中国生物工程杂志 2016年第10期36卷 21-27页

作者：叶慧华胡蝶李闯程建青邓超邬敏辰江南大学药学院无锡214122 生物工程学院无锡214122 无锡医学院无锡214122

为挖掘新型环氧化物水解酶(EH),探讨其对映归一性催化特性,以菜豆(Phaseolus vulgaris)总RNA为模板,采用RT-PCR扩增了一种菜豆EH(Pv EH1)的编码基因pveh1,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。一级和三维结构分析表明,Pv EH1与绿豆... 详细信息

为挖掘新型环氧化物水解酶(EH),探讨其对映归一性催化特性,以菜豆(Phaseolus vulgaris)总RNA为模板,采用RT-PCR扩增了一种菜豆EH(Pv EH1)的编码基因pveh1,并将其在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。一级和三维结构分析表明,Pv EH1与绿豆和苜蓿EHs的同源性分别为85.7和81.1%,其催化三联体为Asp^(101)-His^(299)-Asp^(264),属于α/β水解酶超家族。当Pv EH1催化外消旋环氧苯乙烷水解的转化率达99.1%时,产物(R)-苯乙二醇的对映体纯度为33.6%e.e.p。Pv EH1对(S)-和(R)-SO的区域选择性系数α_S和β_R分别为91.1和53.3%。Pv EH1的挖掘及其对映归一性催化特性的分析不仅增加了此类植物EHs的数目,而且为其归一性催化机制的研究和区域选择性的改造奠定了基础。

关键词：菜豆环氧化物水解酶表达对映归一性

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绿豆环氧水解酶VrEH2催化性质研究及分子改造的初步探索

绿豆环氧水解酶VrEH2催化性质研究及分子改造的初步探索

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作者：吴燕雯华东理工大学

学位级别：硕士

环氧水解酶(epoxide hydrolase, EH)能够立体选择性催化一分子水加成到环氧底物分子上,促使环氧底物开环水解生成其相应的二醇产物。由于环氧水解酶催化水解时无需辅因子的参与,且具有高立体和位置选择性的特点,因此,近年来环氧水解酶... 详细信息

环氧水解酶(epoxide hydrolase, EH)能够立体选择性催化一分子水加成到环氧底物分子上,促使环氧底物开环水解生成其相应的二醇产物。由于环氧水解酶催化水解时无需辅因子的参与,且具有高立体和位置选择性的特点,因此,近年来环氧水解酶作为一种有效的生物催化剂被广泛应用于环氧化物及二醇的手性合成。绿豆(Vigna radiata)环氧水解酶能对映归一性地催化外消旋的对硝基苯乙烯氧化物(rac-pNSO)水解生成单一构型R-邻位二醇((R)-pNPG),故备受关注。本课题组早前己从绿豆(Vigna r adiata)中克隆得到两种环氧水解酶VrrEH1和VrEH2。而本论文利用发酵罐获得了大量VrEH2。的粗酶粉；在进一步考察VrEH2酶学性质的基础上,建立了化学-酶法偶联制备光学纯(R)-pNPG的新工艺；拓展了VrEH2的底物谱,优化了VrEH2催化制备光学纯(R)-2,3-二甲基苯基缩水甘油醚的条件；结合同源建模与分子改造,改善了VrH2的可溶性表达,筛选出影响VrEH2活力的关键氨基酸,为后续VrEH2的分子改造和应用奠定了基础。具体内容包括：1、用3-L发酵罐培养获得了14 g的VrEH2粗酶冻干粉(44 U/g)；经一步Ni柱亲和层析,所得纯酶对rac-pNSO的比活力为1.95 U/mg,提高了44倍,活力回收率为31.9%；重组VrEH2的最适反应条件分别为pH6.5和30-C,优先催化水解(R)-pNSO; VrEH2可以同时亲核攻击rac-pNSO环氧环上的两个碳原子,对(S)-pNSO (87.2% to Cα)和(R)-pNSO (98.4% to Cβ)有相反的位置选择性,以对映体汇聚的方式催化水解rac-pNSO并形成单一构型的产物(R)-pNPG。2、考虑到VrEH2对(S)-pNSO Cα的位置选择性为87.2%,而酸催化水解(S)-pNSO比起酶水解有更好的位置选择性(91.5% to Cα)和催化速率,因此设计建立了化学-酶法组合催化rac-pNSO对映归一性水解的新工艺。与单独酶催化相比,不仅产物(R)-pNPG的光学纯度由84.8% ee提高到89.4% ee,还显著加快了反应进程,时间缩短到原来的四分之一。利用化学-酶法工艺扩大制备了(R)-pNPG,所得产品的对映体过量值(eep)为89.9%,分离得率为91.1%；经氯仿重结晶精制之后,终产品的ee值达到99%,产率为71.5%。3、选择2种苯乙烯环氧化物衍生物和10种苯基缩水甘油醚类底物测定了VrEH1和VrEH2的底物谱；两种酶对苯基缩水甘油醚类底物的活力均高于苯乙烯氧化物衍生物,但除2,3-二甲基苯基缩水甘油醚(8a)之外,对其它苯基缩水甘油醚类底物的立体选择性较差；吐温-80的存在能提高VrEH2的立体选择性；反应条件优化后,在100 ml反应体系中利用VrEH2催化制备了光学纯(R)-2,3-二甲基苯基缩水甘油醚(8a),终产品产率为27.5%,ee值达到98%。4、结合同源建模与定点突变实验,获得可溶性表达改善的VrEH2突变体Ml(G3E/V4I);突变体酶M1的最适pH、最适温度、底物选择性、活力等与VrEH2母本差别不大,但热稳定性有所提高；以催化三联体中Asp101为中心,选择了活性中心周围12个氨基酸位点进行了丙氨酸扫描,确定了对蛋白活力影响较大的3个位点P185,L261和F298,为后续的蛋白的分子改造奠定基础。

关键词：绿豆重组环氧水解酶对映归一性底物谱生物催化化学-酶法组合催化分子改造

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菜豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及定向改造

菜豆环氧化物水解酶基因的克隆、表达及定向改造

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作者：王瑞江南大学

学位级别：硕士

手性环氧化物和邻二醇是合成手性化合物的重要中间体,在功能材料、医药和农药等的合成中有着重要的应用价值。环氧化物水解酶（epoxide hydrolases,EHs）能催化外消旋环氧化物的选择性开环生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化... 详细信息

手性环氧化物和邻二醇是合成手性化合物的重要中间体,在功能材料、医药和农药等的合成中有着重要的应用价值。环氧化物水解酶（epoxide hydrolases,EHs）能催化外消旋环氧化物的选择性开环生成相应的手性邻二醇或选择性保留手性环氧化物。区域选择性高且互补的单一EH催化外消旋环氧化物对映归一性水解是制备手性邻二醇的理想途径,但目前仅有少数EHs具有此特性。本论文从菜豆（Phaseolus vulgaris）基因组中扩增了一种编码PvEH3的基因pveh3,并将其在大肠杆菌*** BL21（DE3）中成功实现异源表达;采用定点和迭代突变技术对PvEH3进行分子改造,以获得高活力和高区域选择性的PvEH3突变体;通过构建双相催化体系解除底物对最优突变体PvEH3G170E/F187L/P237L的抑制作用。以菜豆总RNA为模板,采用逆转录PCR和巢式PCR技术扩增了一条新型环氧化物水解酶的编码基因pveh3,其长度为957 bp,编码318个氨基酸。一级和三维结构分析表明PvEH3属于α/β水解酶超家族,其催化三联体为D101-H297-D262,两个保守质子供体为Y150和Y232。SDS-PAGE结果显示PvEH3的表观分子量为36.1 kDa,催化特性研究表明PvEH3能催化对氯环氧苯乙烷（pCSO）的对映归一性水解,产物（R）-对氯苯乙二醇（pCPED）的对映体过量值（eep）为85.1%。PvEH3对（S）-和（R）-pCSO的区域选择性系数αS和βR分别为87.0%和98.0%。通过镍离子亲和层析柱对目的蛋白进行纯化,PvEH3的比活力为1.36 U·mg-1,针对pCSO的动力学参数Km和kcat/Km分别为6.60mM和0.583 mM-1·s-1。基于PvEH3与（R）-pCSO的分子对接模拟分析和与植物EHs的氨基酸序列比对结果对PvEH3的7个非保守氨基酸位点进行定点突变。其中突变体PvEH3G170E全细胞比活力最高为12.86 U·g-1 wcw,是PvEH3的3.7倍;PvEH3F187L和PvEH3P237L对映归一性最好,eep分别从PvEH3的85.1%提高至90.0%和91.2%。随后经组合点突变和迭代饱和突变获得最优突变体PvEH3G170E/F187L/P237L,其全细胞比活力从3.45提高至20.31 U·g-1wcw,区域选择性系数αS和βR分别为95.0%和98.0%。纯化后PvEH3G170E/F187L/P237L催化pCSO的Km和kcat/Km分别为4.86 mM和1.81 mM-1·s-1。在环己烷的体积比为5%、全细胞催化剂与底物的重量比为12:1（w/w）的双相催化体系中,PvEH3G170E/F187L/P237L全细胞催化200 mM pCSO对映归一性水解5.5 h后,产物（R）-pCPED的eep和产率分别为96.1%和98.0%,时空产率STY为6.16 g·L-1·h-1。底物谱分析表明,PvEH3能催化环氧苯乙烷（SO）及其4种衍生物的水解,取代基的类型和位置均影响其活力和对映归一性,PvEH3G170E/F187L/P237L对5种底物的催化活力较PvEH3均有提高,是PvEH3的2.1～5.9倍。

关键词：环氧化物水解酶异源表达对映归一性定向改造双相催化体系

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菜豆环氧化物水解酶PvEH1的催化性质及分子改造研究

菜豆环氧化物水解酶PvEH1的催化性质及分子改造研究

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作者：叶慧华江南大学

学位级别：硕士

环氧化物水解酶（EHs）能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解,保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。对映归一性水解可实现底物的完全转化,获得具有高对映体纯度和理论产率为100%的手性邻二醇。酶促对映归一性... 详细信息

环氧化物水解酶（EHs）能够催化外消旋环氧化物的水解动力学拆分或对映归一性水解,保留单一构型环氧化物或转化为手性邻二醇。对映归一性水解可实现底物的完全转化,获得具有高对映体纯度和理论产率为100%的手性邻二醇。酶促对映归一性水解可以通过单酶法、双酶法和化学酶法实现,其中单酶法途径最为理想,但是仅有少数酶对不同构型的对映体存在互补的区域选择性。为挖掘新型EH并探讨其对映归一性催化性质,本研究扩增了一种菜豆EH（Pv EH1）的编码基因pveh1,将其在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了表达。在此基础上,对该酶进行了对映归一性的定向改造和工艺应用的初步研究,主要研究成果如下:（1）通过RT-PCR技术扩增了Pv EH1的编码基因pveh1,其开放阅读框长963 bp,编码320个氨基酸。一级和三维结构分析表明,Pv EH1与其他EHs的最高同源性为85.7%,其催化三联体为Asp101-His299-Asp264,属于α/β水解酶超家族。利用Ni-NTA柱纯化Pv EH1,其表观分子量为35.7 k Da,比酶活力为2.30 U/mg。酶学性质分析表明,Pv EH1的最适反应温度和p H分别为30°C和7.5。Pv EH1可催化外消旋环氧苯乙烷（rac-1a）的对映归一性水解,底物完全转化后获得对映体纯度为33.6%eep的（R）-苯基乙二醇（1b）。对于（S）-1a,Pv EH1的区域选择性系数αS为91.1%,Km和Vmax值分别为22.8 mmol/L和6.43 U/mg;对于（R）-1a,其区域选择性系数βR为53.3%,Km和Vmax值分别为11.3 mmol/L和2.38 U/mg。（2）基于Pv EH1的三维结构及其与（R）-1a的分子对接进行了定向改造:单点突变实验发现,L105、M160和M175对改善Pv EH1的催化性质有着显著效果;经组合点突变和迭代饱和突变,获得最优突变体Pv EH1L105I/M160A/M175I。Pv EH1L105I/M160A/M175I催化rac-1a水解的比酶活力和对映归一性分别为10.5 U/mg和87.8%eep,其对（S）-和（R）-1a的区域选择性系数αS和βR分别为99.9和86.4%。与Pv EH1相比,Pv EH1L105I/M160A/M175I具有更广泛的底物谱,其催化环氧苯乙烷衍生物rac-2a/3a/4a/5a所获得的邻二醇（R）-2b/3b/4b/5b的对映体纯度为52.3～70.9%eep,提高了0.286～68.7倍。（3）以Pv EH1L105I/M160A/M175I全细胞为催化剂,其在纯水相中最高可催化200 mmol/L的rac-1a,所获产物（R）-1b的eep、产率以及时空产率依次为80.0%、90.0%和3.04 g/h/L。实验发现,产物抑制是限制其底物浓度的主要原因:当产物浓度高于25 mmol/L时出现抑制现象,高于200 mmol/L时催化剂活性损失约一半,超过400 mmol/L时催化剂基本失活。遗憾的是,由于催化剂对醇类有机溶剂的耐受性较差,双相反应体系实验未能取得预期结果。在纯水相体系中,利用Pv EH1L105I/M160A/M175I催化0.5 g rac-1a的水解以制备（R）-1b,经重结晶后获得产物0.232 g,其eep和最终得率分别为98.9%和40.4%。

关键词：菜豆环氧化物水解酶对映归一性定向改造应用

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半理性设计改造环氧水解酶PvEH1的立体选择性

半理性设计改造环氧水解酶PvEH1的立体选择性

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作者：宗迅成江南大学

学位级别：硕士

环氧水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)可对映选择性催化外消旋环氧化物开环,形成相应的光学纯邻二醇和保留未反应的环氧化物,或区域选择性开环,将底物完全转化为手性邻二醇。手性邻二醇是一类药物的手性砌块,例如R型间氯苯基... 详细信息

环氧水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)可对映选择性催化外消旋环氧化物开环,形成相应的光学纯邻二醇和保留未反应的环氧化物,或区域选择性开环,将底物完全转化为手性邻二醇。手性邻二醇是一类药物的手性砌块,例如R型间氯苯基乙二醇(wCPED)可用于合成一种β3-肾上腺素受体激动剂。本实验室前期从菜豆(Phaseolus vulgaris)基因组扩增了一种新型EH的编码基因(pvehl),并在*** BL21(DE3)中表达。研究表明,PvEH1对间氯环氧苯乙烷(mCSO)催化特性不理想。本研究以PvEH1为对象,拟借助分子对接、定点突变等技术分析其底物结合口袋对催化特性的影响。通过定向改造PvEH1改善其催化特性并进行机制分析。最后,优化反应条件并规模制备(R)-mCPED。对PvEH1进行同源模拟,构建了其3D结构模型。分别以(R)-与(S)-mCSO为模式底物,通过分子对接,确认了 23个底物结合口袋上与mCSO发生相互作用的位点(除催化位点)。再结合PvEH1与多个高对映归一性EHs序列比对的结果和文献报道确认了16个位点的拟取代氨基酸,剩余7个位点分别以亮氨酸取代。分别构建了 23个单点突变体,其中酶活性显著提高的单点突变体包括PvEH1V1061、PvEH1M129L、PvEH1M160A、PvEH1M175I和PvEH1S178T等5个,其中最优为PvEH1M129L,酶活性是PvEH1的1.6倍;对映归一性显著提高的单点突变体包括PvEH1W102L、PvEH1L105I、PvEH1Y149L和PvEH1P84L等4个,对映归一性最高为PvEH1W102L(80.6%eep),是PvEH1 的 80.6倍。将9个提高PvEH1催化特性的位点分为两类:5个位点提高酶活性(106、129、160、175和178)和4个位点提高对映归一性(102、105、149和184),分别进行单点饱和突变以筛选各位点上的最优氨基酸。结果表明,5个提高酶活性的位点最优氨基酸分别为I、L、A、I和T,并构建5位点随机组合突变文库并筛选获得了酶活性最优突变体PvEH1Z4(包含V106I、M160A、M175I和S178T)酶活性为野生型的3.1倍。4个提高对映归一性的位点最优氨基酸分别为L、I、L和W。以PvEH1Z4为模板,构建4位点随机组合突变文库并筛选获得了最优突变体PvEH1Z4X4-59(包含V106I、M160A、M175I、S178T、L105I和P184W),与PvEH1相比,酶活性和对映归一性分别提高了 2.6倍和92.6 倍。测定了 PvEH1和其突变体区域选择性系数和对映体比率(enantiomeric ratio,E),并结合分子动力学模拟技术分析其提高机理。意外发现,W102L可大幅提高突变体的对映选择性,例如***/pveh1W102L对mCSO的E值为30,不利于其对映归一性水解rac-mCSO。另外,***/pvehlW102L对与mCSO相似的底物对氯环氧苯乙烷(pCSO)E值为89。这意味着***/pvehlW102L可应用于动力学拆分rac-pCSO。这可能是由于102位被亮氨酸取代抑制了PvEH1W102L活性中心与(R)-pCSO结合,却未影响其结合(S)-pCSO,优先催化(S)-pCSO水解,进而提高了 PvEH1W102L对pCSO的对映选择性。另一方面,184位被色氨酸取代、105位被缬氨酸取代后的PvEH1Z4X4-59区域选择性系数αS和βr均大于96%。根据分子动力学模拟结果,PvEH1Z4X-59上W184的侧链基团与(S)-mCSO上氯基发生相互作用,使后者的Cα优先受到攻击而生成(R)-mCPED,同时与(R)-mCSO结合方式保持不变,赋予了PvEH1Z4X4-59对rac-mCSO的对映归一性。优化了 E coli/pvehlW102L动力学拆分rac-pCSO初始反应浓度和反应时间。***/pvehlW102L催化150 mM rac-pCSO 4 h后,可同时获得高纯度的(R)-pCSO和(R)-pCPED,(R)-pCSO的产率为45.62%,ees为96.3%;(R)-pCPED 的产率为50.91%,eep为90.26%。另外,优化了***/pvehlZ4X4-59对映归一性水解rac-mCSO 反应介质和rac-mCSO的浓度。在含5%吐温20的磷酸缓冲液中,水解2.7 g rac-mCSO制备了2.51g(R)-mCPED,eep为93.1%,时空产率为6.32g·h-1.L-1。

关键词：环氧水解酶对映归一性饱和突变定点突变间氯苯基乙二醇

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海洋红酵母环氧化物水解酶基因的克隆、表达及定向改造

海洋红酵母环氧化物水解酶基因的克隆、表达及定向改造

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作者：徐雄峰江南大学

学位级别：硕士

环氧化物水解酶（epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-）,是一种不依赖辅助因子的水解酶,普遍存在于自然界中,能够通过将活化的水分子立体选择性的加成在环氧化物上形成相应的邻二醇,并且底物谱较为广泛,被认为是制备手性化合物有吸引力... 详细信息

环氧化物水解酶（epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-）,是一种不依赖辅助因子的水解酶,普遍存在于自然界中,能够通过将活化的水分子立体选择性的加成在环氧化物上形成相应的邻二醇,并且底物谱较为广泛,被认为是制备手性化合物有吸引力的生物催化剂。但高催化活力且高立体选择性的EHs较为稀少。因此,挖掘一种可以在高底物浓度、低催化剂负载量的条件下,以高时空产率生产高对映体纯度手性环氧化物/邻二醇的新型EH是十分具有吸引力的。本研究以一株在本实验室分离保藏的红酵母菌株（Rhodotorula sp.）为出发菌株,使用26S rDNA分析技术进行菌种鉴定;通过生物信息学手段挖掘得到RpEH的编码基因;在大肠杆菌表达系统中进行RpEH的异源表达;对RpEH的底物谱和各项性质进行研究;构建全细胞催化制备（R）-8a的体系;使用定向进化技术进一步优化RpEH对于rac-1a的区域选择性。（1）通过比对菌株26S r DNA的D1/D2区域序列鉴定保藏菌株为Rhodotorula paludigena。使用RT-PCR技术以总RNA为模板克隆RpEH的编码基因（Rpeh）,使用相同引物以总DNA为模板克隆包含内含子的全长基因,Rpeh的CDS长度为1236 bp编码412个氨基酸,DNA全长序列长度为1600 bp。（2）使用表达载体pET28a（+）在*** BL21（DE3）中实现RpEH的异源表达。***/Rpeh对于环氧苯乙烷（1a）有着高达2132 U/g wcw的全细胞比活力。利用组氨酸标签纯化RpEH并测定其动力学参数和酶学性质。RpEH的表观分子量为48.4 kDa,经测定它的最适反应温度和pH分别为30℃和pH 7.0。而RpEH对于rac-1a的纯酶比酶活力为21.7 U/mg,动力学参数Km、Vmax、kcat和kcat/Km分别为7.87 mM、26.2 U/mg、21.1s-1、2.7 mM-1 s-1。（3）经底物谱分析,***/Rpeh对于1a和5a～12a都具有很高的活性（743～9081 U/g wcw）,但对于硝基取代的环氧苯乙烯2a～4a的活性较低（24～276 U/g wcw）。对映选择性方面,***/Rpeh对1a（E=3.5）、11a（E=1.6）和12a（E=2.3）的对映选择性较低,对于4a（E=19）的对映选择性中等,对于2a（E>200）、3a（E=64）和5a～10a（E=49～160）则有着很高的对映选择性。选定1a为归一性水解研究的模式底物,8a为动力学拆分研究的模式底物。（4）实现了在高达1000 mmol/L的底物浓度下以非常低的酶载量,实现了接近完美的动力学拆分,在2.5 h内以46.7%的产率拆分得到了ees>99%的（R）-8a同时以51.4%的产率生产eep高达93.2%的（S）-8b,（R）-8a和（S）-8b的STY分别为30.6和37.3 g/L/h。在25 mL的磷酸钾缓冲液放大体系中使用0.25 g ***/Rpeh湿细胞作为生物催化剂,实现了rac-8a的克级动力学拆分,经过分离纯化得到1.89 g（R）-8a（ees>99.0%;分离产率46.0%;透明油状物）和2.2 g（S）-8b（eep 92.8%;分离产率48.2%;白色固体）。（5）通过同源建模与多序列比对找到RpEH底物结合口袋中9个关键氨基酸位点,理性选择Val、Asn、Phe和Trp四种氨基酸残基作为构建单元,构建四密码子饱和突变文库,筛选得到RpEHY152F、RpEHP335W、RpEHH336V、RpEHL360V四个优良突变体,再经组合突变得到最优突变体RpEHL360V-H336V。最优突变体对于rac-1a的区域选择性趋近完美（αS由72.5%提升到94.6%,βR由92.3%提升到99.9%）,催化产物eep由65.7%提升到94.6%,全细胞比活力提升为野生型的1.3倍（2814 U/g wcw）。

关键词：环氧化物水解酶动力学拆分对映归一性饱和突变

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