检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：华丽莎华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分、大鼠DMRT1基因慢病毒过表达载体的构建　　目的：探索构建大鼠骨髓间充质干细胞中DMRT1过表达慢病毒载体的技术方法。　　方法：提取SD大鼠睾丸组织总RNA通过RT-PCR获取cDNA文库;据Genebank获得大鼠DMRT1编码区全长序列，按... 详细信息

第一部分、大鼠DMRT1基因慢病毒过表达载体的构建　　目的：探索构建大鼠骨髓间充质干细胞中DMRT1过表达慢病毒载体的技术方法。　　方法：提取SD大鼠睾丸组织总RNA通过RT-PCR获取cDNA文库;据Genebank获得大鼠DMRT1编码区全长序列，按照慢病毒载体酶切位点，设计DMRT1上下游引物，通过聚合酶链反应（PCR）获得DMRT1基因片段;与双酶切线性化的慢病毒载体质粒（Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP）连接，完成过表达DMRT1的慢病毒载体质粒的构建;然后经过氨苄青霉素抗性筛选、阳性转化子PCR鉴定，进行阳性克隆测序鉴定。通过重组病毒质粒与包装质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装并获取慢病毒液，采用定量PCR测定慢病毒滴度。　　结果：PCR以及测序结果显示成功构建含有大鼠DMRT1基因的重组慢病毒表达质粒;重组质粒转染293T细胞可观察到明显的绿色荧光，经Western blot检测，Flag标签蛋白阳性，说明重组质粒转染正常、重组质粒荧光标记基因GFP表达正常。包装并检测慢病毒浓缩滴度为2.0×108 TU/mL。　　结论：成功构建DMRT1基因慢病毒过表达载体，获得DMRT1基因过表达慢病毒，为后续实验提供病毒支持。　　第二部分、DMRT1基因过表达慢病毒转染雄性大鼠的骨髓间充质干细胞　　目的：建立稳定过表达DMRT1基因的SD雄性大鼠骨髓间充质干细胞群。　　方法：通过全骨髓培养法得到SD雄性大鼠骨髓间充质干细胞,并使用成骨和成脂诱导方法对其进行分化鉴定。将获得的DMRT1基因过表达慢病毒转染第三代生长状态良好的骨髓间充质干细胞。使用Real-PCR和Western Blot技术检测骨髓间充质干细胞中DMRT1 mRNA和蛋白水平的过表达情况。　　结果：慢病毒有效感染SD雄性大鼠骨髓间充质干细胞，可观察到明显的绿色荧光。与阴性病毒对照组和正常大鼠骨髓间充质干细胞组相比，慢病毒过表达组在mRNA水平上表达明显增高（P＜0.01），采用2-ΔΔCT法分析CT值，过表达慢病毒组的DMRT1基因的mRNA的相对表达量为正常rBMSCs组的512倍。过表达慢病毒组的DMRT1蛋白相对表达量为正常rBMSCs组的6倍。　　结论：SD雄性大鼠骨髓间充质干细胞中成功稳定过表达DMRT1基因。为进一步研究DMRT1基因在骨髓间充质干细胞中的作用机制，对精子发生以及骨髓间充质干细胞向雄性生殖细胞诱导分化具有重要意义。　　第三部分、过表达DMRT1对大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化作用　　目的：探讨转录因子DMRT1对雄性大鼠骨髓间充质干细胞多能性因子以及减数分裂相关因子的调节作用。　　方法：将实验分为三组，第一组：只添加培养基的未处理组;第二组：在培养基内添加RA全反式维甲酸进行体外诱导的正常组;第三组：阴性对照病毒组，先用阴性对照病毒转染细胞，然后在培养基内添加RA全反式维甲酸进行体外诱导;第四组：DMRT1过表达慢病毒组，先用慢病毒转染细胞，然后在培养基内添加RA全反式维甲酸进行体外诱导。每组细胞分别诱导培养1d、7d、14d、21d，收集细胞。通过Real-PCR技术检测内源多潜能因子、减数分裂相关因子的表达情况，Western Blot技术用于检测DMRT1过表达对STRA8蛋白表达的影响。　　结果：未处理组rBMSCs只表达内参β-actin和低水平的DMRT1、OCT4基因，并不表达STRA8、SYCP3、DDX4、SOX2和NANOG基因。RA诱导过表达DMRT1的BMSCs第7天和第14天过表达慢病毒组STRA8的mRNA相对表达量低于正常组和阴性对照组，第14天STRA8的蛋白相对表达量也低于正常组和阴性对照组。（P<0.05）。诱导第7天和第14天过表达组OCT4 mRNA表达量低于正常组和阴性对照组，但无统计学差异。三组细胞在诱导第21天均出现了DDX4 mRNA的表达，均未检测出SYCP3、SOX2和NANOG基因的表达。　　结论：在BMSCs中DMRT1具有抑制减数分裂相关因子STRA8的表达的功能，但是并未发现DMRT1对多能性相关因子的调节作用。

关键词：慢病毒过表达 DMRT1基因骨髓间充质干细胞成骨分化成脂诱导减数分裂

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长链非编码RNA(lncRNA)-MSTRG.22610.1对BHV-1体外复制影响的研究

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中国预防兽医学报 2024年第3期46卷 278-284,299页

作者：姜坤生王禹淳马金柱于立权宋佰芬黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院黑龙江大庆163319 中国农业大学动物医学院北京100193

本研究室前期将牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)感染牛肾细胞(MDBK),通过转录组测序筛选到了转录显著差异的长链非编码RNA-MSTRG.22610.1(lncRNA-MSTRG.22610.1),为了探究其在MDBK中对BHV-1复制的影响,本研究采用CCK-8法筛选对细胞无毒性的聚凝... 详细信息

本研究室前期将牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)感染牛肾细胞(MDBK),通过转录组测序筛选到了转录显著差异的长链非编码RNA-MSTRG.22610.1(lncRNA-MSTRG.22610.1),为了探究其在MDBK中对BHV-1复制的影响,本研究采用CCK-8法筛选对细胞无毒性的聚凝胺、嘌呤霉素的最佳浓度;将重组慢病毒r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和r ZHLV-U6-Zs Green1-puro(对照慢病毒)按照不同的MOI分别感染MDBK细胞,48 h后观察荧光,采用Image J软件检测并计算各慢病毒感染细胞后出现绿色荧光细胞的比率,出现绿色荧光细胞的比率达80%的细胞对应的MOI即为最佳MOI。筛选结果显示聚凝胺与嘌呤霉素的最佳工作浓度分别为5μg/mL及3μg/m L,慢病毒感染的最适MOI为80。将r ZHLV-U6-Zs Green1-puro-MSTRG.22610.1和对照慢病毒分别以最佳条件感染MDBK细胞并培养及传代,传至8~10代,每代均观察细胞形态及细胞中的绿色荧光,并通过RT-q PCR检测第6、8、10代细胞中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平,以构建并鉴定稳定表达lncRNA-MSTRG.22610.1的MDBK细胞系1T及对照细胞系1NC。结果显示,每代1T细胞、1NC细胞的状态均良好并均与阴性对照MDBK细胞的形态无差别,且每代1T及1NC细胞均出现绿色荧光。RT-q PCR结果显示,与1NC及阴性对照细胞相比,1T细胞系中lncRNA-MSTRG.22610.1的转录水平极显著升高(P<0.0001)。表明获得了高水平表达lncRNA-MSTRG.22610.1却不影响细胞增殖的细胞系,且该细胞系的遗传稳定性较强。将BHV-110倍倍比稀释后分别感染传至10代的1T与1NC细胞,24 h后采用Reed-Muench法计算各组细胞中的病毒滴度。结果显示,1T、1NC及MB细胞(感染BHV-1的MDBK细胞)的病毒滴度分别为105.15 TCID50/0.1 m L、104.41TCID50/0.1 m L及104.58 TCID50/0.1 m L。与MB和1NC细胞相比,1T细胞中的病毒滴度显著升高(P<0.05),表明lnc RNA-MSTRG.22610.1表达后促进BHV-1在MDBK细胞中的复制。本研究为进一步探究lncRNA-MSTRG.22610.1促进病毒复制的分子机制及深入了解BHV-1感染的分子机制提供参考依据。

关键词：长链非编码RNA 牛肾细胞牛疱疹病毒I型慢病毒过表达病毒增殖

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IL-10表达对小鼠脾脏CD4+T细胞亚群相关细胞因子的影响

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宁夏医学杂志 2023年第10期45卷 878-882页

作者：李东杰薛永平刘丽媛陆思敏程锁利宁夏回族自治区人民医院临床医学检验诊断中心宁夏银川750002 宁夏回族自治区人民医院关节外科宁夏银川750002 宁夏医科大学第三临床医学院宁夏银川750004

目的研究应用T细胞特异性慢病毒过表达白细胞介素10(IL-10)或siRNA片段抑制IL-10后对小鼠脾脏CD4+T细胞亚群的影响。方法磁珠分选试剂分离小鼠初始CD4+T细胞,通过IL-10过表达特异性慢病毒侵染CD4+T细胞,应用qRT-PCR检测IFN-γ、IL-4、IL... 详细信息

目的研究应用T细胞特异性慢病毒过表达白细胞介素10(IL-10)或siRNA片段抑制IL-10后对小鼠脾脏CD4+T细胞亚群的影响。方法磁珠分选试剂分离小鼠初始CD4+T细胞,通过IL-10过表达特异性慢病毒侵染CD4+T细胞,应用qRT-PCR检测IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的mRNA表达量,应用流式细胞术分别检测IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3在CD4+T细胞中的分泌比率。应用siRNA干扰片段抑制IL-10,应用qRT-PCR检测IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3的mRNA表达量,应用流式细胞术分别检测IFN-γ、IL-4、IL-17A、Foxp3在CD4+T细胞中的分泌比率。结果过表达IL-10后,IFN-γ、IL-4、IL-17A mRNA水平明显下降(P<0.05),Foxp3 mRNA表达明显上升(P<0.05);IFN-γ、IL-4、IL-17A分泌量均明显降低(P<0.05),Foxp3分泌量明显增高(P<0.05)。IL-10抑制后,IFN-γ和IL-17A mRNA表达明显上升(P<0.05);IFN-γ和IL-17A分泌量均明显升高(P<0.05)。结论过表达IL-10后抑制Th1、Th2、Th17亚群中的IFN-γ、IL-4、IL-17A的表达,对Treg细胞Foxp3的分泌具有促进作用。IL-10抑制能明显促进IFN-γ、IL-17A的表达。

关键词： CD4+T细胞 IL-10 慢病毒过表达 siRNA抑制

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ANKRD49过表达促进非小细胞肺癌转移和侵袭的初步研究

ANKRD49过表达促进非小细胞肺癌转移和侵袭的初步研究

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作者：孙佳山西医科大学

学位级别：硕士

目的:、肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)占肺癌的40%以上,是临床最难治愈的肿瘤,鉴定在LUAD发生发展中起作用的蛋白质将有助于阐明发病机理并提供新的预后生物标志物。课题组前期构建了高表达ANKRD49的慢病毒载体LV5-ANKRD49,将其感染... 详细信息

目的:、肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)占肺癌的40%以上,是临床最难治愈的肿瘤,鉴定在LUAD发生发展中起作用的蛋白质将有助于阐明发病机理并提供新的预后生物标志物。课题组前期构建了高表达ANKRD49的慢病毒载体LV5-ANKRD49,将其感染H1299细胞后,发现其不参与调节细胞增殖,但是可以促进H1299细胞的迁移和侵袭。为研究ANKRD49在H1299细胞迁移和侵袭中发挥的作用,应用Realtime q PCR和Western blotting检测迁移和侵袭相关蛋白的表达,为下一步研究ANKRD49在NSCLC中的功能奠定基础。方法:本研究利用组织芯片和免疫组织化学技术,在肺腺癌(LUAD)与成对的非肿瘤肺组织中分析ANKRD49蛋白的表达情况;使用χ2检验和Spearman相关分析研究ANKRD49表达与肺腺癌患者临床病理特征之间的相关性;ANKRD49与患者生存率之间的关联使用Kaplan-Meier方法和对数秩检验进行分析;使用Cox比例风险模型评估ANKRD49在肺腺癌患者的预后价值;使用Real-time q PCR和Western blotting检测ANKRD49过表达NCI-H1299细胞系中MMP-2/9,TIMP-1/2的m RNA和蛋白质表达水平;明胶酶谱实验检测ANKRD49过表达NCI-H1299细胞系中MMP-2/9酶活性;使用Western blotting检测ANKRD49过表达NCI-H1299细胞系中SAPK/JNK信号通路中相关蛋白的表达;提取细胞浆以及细胞核蛋白,研究相关转录因子的核易位。结果:LUAD中ANKRD49升高,与肿瘤淋巴结转移、远端转移和分化程度呈正相关;高水平表达的ANKRD49患者的生存率明显低于低水平ANKRD49患者;Cox模型表明,肺组织中较高的ANKRD49可以用作LUAD患者独立的预后指标;Real-time q PCR和Western blotting结果显示,与对照组相比,ANKRD49高表达组的NCI-H1299细胞中MMP-2/9的m RNA水平及蛋白质水平明显升高,而TIMP-1/2的m RNA水平及蛋白水平明显下降;明胶酶谱实验结果表明,ANKRD49高表达后可促进MMP-2/9的酶活性;Western blotting结果显示,ANKRD49过表达后,JNK、ERK、P38的总蛋白水平无明显变化,但JNK、P38的磷酸化水平明显升高;提取细胞浆、细胞核结果显示,ANKRD49过表达后转录因子ATF2、c-jun核易位增加。结论:临床标本通过组织芯片和免疫组织化学染色表明ANKRD49可以作为评估LUAD预后的潜在生物标志物,并可以作为LUAD治疗的潜在治疗靶标;体外细胞实验表明ANKRD49过表达后,对NCI-H1299细胞的增殖能力无影响。ANKRD49高表达组明胶酶A(MMP-2)、明胶酶B(MMP-9)的酶活性升高。ANKRD49过表达后,通过JNK-AP1/ATF2信号通路上调MMP-2、MMP-9促进NCI-H1299细胞的迁移和侵袭能力。

关键词：肺腺癌 ANKRD49 预后指标慢病毒过表达 MMP-2/9

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大鼠肝细胞系lncRNA NONRATT021477.2过表达及干扰表达条件优化

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中国兽医学报 2020年第8期40卷 1560-1565页

作者：牛春阳薛琳琳詹雪龙徐晶邵子益郭景茹甄莉计红李士泽杨焕民黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 黑龙江职业学院黑龙江双城150111

试验分别以带有目的基因的重组慢病毒质粒(pSllV-CMV-zsGreen-puro-lncRNA77.2)和3条反义核苷酸质粒转染BRL细胞,根据绿色荧光蛋白(GFP)表达情况评估转染效率;优化过表达慢病毒的最佳感染复数,并通过嘌呤霉素筛选以得到高表达稳转株。... 详细信息

试验分别以带有目的基因的重组慢病毒质粒(pSllV-CMV-zsGreen-puro-lncRNA77.2)和3条反义核苷酸质粒转染BRL细胞,根据绿色荧光蛋白(GFP)表达情况评估转染效率;优化过表达慢病毒的最佳感染复数,并通过嘌呤霉素筛选以得到高表达稳转株。应用荧光定量PCR方法检测lncRNA NONRATT021477.2的表达量,验证过表达效果及初步确定干扰效率最高的质粒,并进一步优化ASO质粒的转染浓度和时间曲线。结果显示,重组慢病毒以感染复数(MOI)=4转染BRL细胞48 h时,lncRNA NONRATT021477.2表达量比空病毒NC组极显著升高(P<0.01),过表达效果为17倍,成功获得高表达稳转株;并且确定了干扰质粒ASO-2以250 nmol/L浓度转染BRL细胞24 h时,对靶基因水平的干扰效率最高,为78%。本试验建立了lncRNA NONRATT021477.2过表达和干扰表达质粒转染BRL细胞的最佳条件,为后续深入研究lncRNA NONRATT021477.2的生物学功能奠定基础。

关键词： lncRNA NONRATT021477.2 慢病毒过表达 ASO干扰 BRL细胞

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Etk敲除及过表达细胞株构建并探讨Etk对细胞增殖的影响

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现代生物医学进展 2020年第5期20卷 801-807页

作者：苏宏李钊刘婷婷陈超飞王敏中山大学附属第一医院转化医学中心广东广州510000

目的:利用CRISPR-Cas9技术在人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中构建Etk(Epithelial and endothelial tyrosine kinase)敲除稳定细胞株以及利用慢病毒构建Etk过表达稳定细胞株,并初步探讨Etk基因对HUVECs细胞增殖的影响。方法:利用CRISPR-Cas9技术,使用在线工具设计针对Etk的sgRNA (https://***/)。将sgRNA利用连接酶整合到病毒载体中,包被病毒并感染HUVECs敲除HUVECs中的内源性Etk。利用嘌呤霉素筛选得到Etk敲除的稳定细胞株。PCR扩增Etk基因序列,将其整合到pLEX-MCS慢病毒过表达载体中构建Etk过表达重组质粒。包被病毒并感染HUVECs,在HUVECs中过表达Etk,利用嘌呤霉素筛选得到Etk过表达的稳定细胞株。利用qRT-PCR和Western-Blotting检测Etk的敲除和过表达情况。利用CCK-8盒子检测两种稳定细胞株细胞增殖情况。结果:利用CRISPR-Cas9技术有效的敲除HUVECs中内源性Etk,同对照相比,Etk的mRNA和蛋白水平显著地降低(P<0.01)。同时利用慢病毒在HUVECs中过表达Etk,同对照相比,在过表达Etk稳定细胞株中Etk的mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.01)。CCK-8检测发现,Etk敲除降低细胞增殖能力;而Etk过表达增加细胞增殖能力。结论:通过CRISPR-Cas9技术成功在HUVECs中敲除Etk,利用慢病毒过表达系统成功的在HUVECs中过表达Etk,并且初步验证了Etk促进HUVECs细胞增殖。

关键词： Etk CRISPR-Cas9敲除慢病毒过表达细胞增殖

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过表达TFE3基因在Xp11.2易位性肾癌中的作用及其分子机制研究

过表达TFE3基因在Xp11.2易位性肾癌中的作用及其分子机制研究

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作者：方媛南方医科大学

学位级别：博士

研究背景和目的:Xp11.2易位性肾癌是WHO新分类的一种肾癌,发病年龄轻、预后较差,主要特征为TFE3基因发生易位,导致其过表达。因目前尚无针对过表达TFE3建立的肾癌细胞学模型,故作用机制尚不明确,涉及的信号通路有待研究,其诊断及治疗缺... 详细信息

研究背景和目的:Xp11.2易位性肾癌是WHO新分类的一种肾癌,发病年龄轻、预后较差,主要特征为TFE3基因发生易位,导致其过表达。因目前尚无针对过表达TFE3建立的肾癌细胞学模型,故作用机制尚不明确,涉及的信号通路有待研究,其诊断及治疗缺乏理论基础。目的:1.筛选出适合构建过表达TFE3慢病毒感染的肾癌细胞系,构建并鉴定特异性慢病毒载体颗粒。2.建立慢病毒过表达TFE3稳定感染的肾癌细胞系,研究过表达TFE3对其生物学影响。3.明确mTOR及pS6在Xp11.2易位性肾癌及过表达TFE3细胞系中的表达,探讨PI3K/AKT/mTOR通路在该类肿瘤中的作用。***基因芯片检测Xp11.2易位性肾癌相关的差异基因,筛选出更多精确的靶基因。方法:*** time PCR和Western blot方法检测8种肾源性的细胞系中TFE3的表达水平,筛选一株进行后续实验,构建特异性慢病毒过表达载体颗粒并鉴定其感染效率。2.构建稳定感染过表达TFE3的肾癌细胞系,分为过表达组(OE),阴性对照组(NC)和空载对照组(CON),并用Western blot进行验证。***、平板克隆法检测不同实验组的细胞增殖和克隆形成;利用流式细胞仪检测其细胞周期。4.免疫组化方法检测12例Xp11.2易位性肾癌和27例非Xp11.2易位性肾癌中mTOR和pS6的表达情况,同时用Western blot方法检测不同细胞实验组中两者的差异。***基因芯片分析2例Xp11.2易位性肾癌患者癌组织与癌旁组织之间基因表达谱的差异。结果:***-time PCR结果显示TFE3基因在ACHN中表达丰度为中,Western blot结果显示在ACHN中无目的条带,因此选取ACHN细胞系作为靶细胞进行慢病毒感染。成功构建人TFE3特异性慢病毒过表达载体并获得相应高效率慢病毒。2.在实验组中,OE组病毒滴度=2×108TU/ml,MOI=10,Western blot结果显示OE组中检测到95KD的目的条带,表明过表达TFE3稳定感染ACHN细胞成功。OE组的细胞增殖水平和克隆数较NC组显著升高(P<0.05),说明过表达TFE3能够促进ACHN细胞的增殖和克隆形成。细胞周期结果显示,OE组较NC组的S期延长(P<0.05),说明过表达TFE3能够调控ACHN细胞的周期从而促进细胞增殖。3.免疫组化法检测石蜡标本中的mTOR和pS6在Xp 11.2易位性肾癌较非Xp 11.2易位性肾癌中阳性率显著升高(P<0.05),两种蛋白在OE组中表达显著增高(P<0.05),说明该肿瘤在组织学和细胞学层面都存在PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活。***基因芯片检测Xp11.2易位性肾癌患者相关差异表达的基因。共筛选出差异表达基因1479个,癌组织中上调基因790个,下调基因689个。其中泛素化相关的RNF180基因下调5倍以上,提示该种肿瘤可能与泛素化有关。结论:1.过表达TFE3能够促进ACHN细胞的增殖,调控其细胞周期。2.在Xp 11.2易位性肾癌中存在PI3K/AKT/mTOR通路的过度激活。***11.2易位性肾癌可能与泛素化途径相关。

关键词： TFE3 慢病毒过表达 Xp11.2易位性肾癌 ACHN细胞 mTOR pS6

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ATF3在肠癌细胞HCT116中生物学作用及蛋白酶体抑制剂Carfilzomib对ATF3的调节

ATF3在肠癌细胞HCT116中生物学作用及蛋白酶体抑制剂Carfilzomib...

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作者：廖锦容福建医科大学

学位级别：硕士

【目的】全球范围内，结直肠癌致死位居肿瘤死因第四位，尽管如今结直肠癌的诊断以及治疗水平有所提高，其5年生存率也只有53.8-65.2%。ATF3蛋白属于ATF/CREB转录因子家族成员具有碱性亮氨酸拉链结构（bZip）,作为一种转录活化因子在肿... 详细信息

【目的】全球范围内，结直肠癌致死位居肿瘤死因第四位，尽管如今结直肠癌的诊断以及治疗水平有所提高，其5年生存率也只有53.8-65.2%。ATF3蛋白属于ATF/CREB转录因子家族成员具有碱性亮氨酸拉链结构（bZip）,作为一种转录活化因子在肿瘤中起着致癌基因还是抑癌基因作用存在争论。本研究通过慢病毒介导ATF3在结直肠癌细胞HCT116中过表达，探讨ATF3在HCT116细胞中对其增殖、肿瘤起始能力、转移侵袭以及上皮间质转化（EMT）生物学作用，并初步探讨可能的分子机制,探讨蛋白酶体抑制剂Carfilzomib对HCT116的细胞毒作用以及对ATF3的调节。【方法】构建慢病毒介导的ATF3表达载体并感染HCT116，puro筛选出稳定ATF3过表达的HCT116细胞株HCT116/ATF3和阴性对照HCT116/Control。应用MTS细胞活性分析、FACS细胞周期检测、FACS AnexinⅤ-7-AAD、克隆形成实验来检测细胞增殖能力；应用细胞球囊形成实验以及FACS检测细胞肿瘤起始能力；应用划痕实验、Transwell转移分析和Transwell侵袭分析来检测细胞转移侵袭能力；应用光学显微镜观察细胞形态变化鉴定细胞EMT；用Western Bloting和real-time qPCR来检测相关基因的mRNA及蛋白表达情况。【结果】MTS细胞活性检测增殖能力以及克隆形成实验克隆数在HCT116/ATF3细胞明显低于对照细胞HCT116/Contro（lp<0.05）；real-time qPCR和Western Blot检测到HCT116/ATF3细胞survivin、cyclinD1、PCNA表达下调以及PARP表达上调。HCT116/ATF3细胞形成的细胞球囊平均直径和数量以及CD133+CD24+细胞群的百分比明显低于对照细胞（p<0.05）；qRT-PCR和Western Bloting检测到HCT116/ATF3细胞CD133、 CD24、Ep-CAM、 CD166、 ID1、beta-catenin和EZH2表达下调。HCT116/ATF3细胞创伤愈合划痕实验创伤愈合程度、Transwell迁移分析与Transwell侵袭实验的细胞穿过数明显低于对照细胞（p<0.05）；real-time qPCR和Western Blot检测到HCT116/ATF3细胞MMP2和MMP9表达下调以及TIMP2和TIMP1表达上调。光学显微镜观察细胞形态HCT116/ATF3细胞形态由间质细胞向上皮细胞转化（MET）；Western Blot检测到HCT116/ATF3细胞E-cadherin表达上调和snail、slug和twist表达下调。通过MTS细胞活性检测HCT116生长随Carfilzomib剂量增加而受到抑制，细胞周期检测Carfilzomib作用后HCT116主要停滞在G0/G1期；FACS AnexinⅤ-7-AAD检测HCT116凋亡随Carfilzomib剂量增加而增加。通过real-time qPCR和Western Blot检测到Carfilzomib诱导ATF3表达具有时间依赖性。【结论】应用慢病毒介导基因转染成功构建ATF3稳定表达HCT116细胞模型HCT116/ATF3和对照细胞HCT116/Control；ATF3通过下调survivin、cyclinD1、PCNA以及上调PARP来抑制HCT116细胞增殖； ATF3通过下调CD133、 CD24、Ep-CAM、 CD166、 ID1、beta-catenin和EZH2来抑制HCT116肿瘤起始能力；ATF3通过下调MMP2和MMP9以及上调TIMP1和TIMP2来抑制HCT116细胞迁移侵袭能力； ATF3通过上调E-cadherin和下调snail、slug和twist逆转HCT116EMT；蛋白酶体抑制剂Carfilzomib可上调HCT116中ATF3的表达并抑制HCT116细胞生长。

关键词： HCT116 ATF3 慢病毒过表达增殖肿瘤起始能力迁移侵袭 EMT Carfilzomib

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Fbln5-RPE对AMD脉络膜新生血管的阻抑作用及其机制研究

Fbln5-RPE对AMD脉络膜新生血管的阻抑作用及其机制研究

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作者：李付亮第三军医大学

学位级别：博士

背景和目的老年黄斑病变(age-related macular degeneration, AMD)是全球范围内导致不可逆视力损伤的最常见原因，其中湿性AMD为国内外50岁以上人群低视力和致盲的重要原因，发病率不断增加。脉络膜新生血管(choroidal neovascularaziti... 详细信息

背景和目的老年黄斑病变(age-related macular degeneration, AMD)是全球范围内导致不可逆视力损伤的最常见原因，其中湿性AMD为国内外50岁以上人群低视力和致盲的重要原因，发病率不断增加。脉络膜新生血管(choroidal neovascularazition, CNV)形成是其危害视功能的主要病理基础和首要原因。在触发CNV的机制中，VEGF与抗血管生成因子之间的失衡尤为重要。VEGF是一种分泌性蛋白质，它可诱发血管生成，增加血管渗透性，引发炎症，而这些因素又与湿性AMD的发展进程密切相关。因此，众多学者在开发湿性AMD治疗药物时，都将VEGF当作潜在的治疗靶标，比如以适配子或者抗VEGF抗体片段形式出现的哌格太尼、兰尼单抗、Avastin等。而这些方法存在的问题主要包括不能在患部长效存在，即使应用各种缓释技术，由于局部微环境病理性VEGF长时间分泌，因此仍无法满足抑制VEGF的需求；尤为重要的是这些药物与VEGF结合后，由于代谢的困难，存在加重drusen的危险，所以抑制VEGF的产生将比降解或拮抗它更有利于AMD的治疗。同时脂褐质过载的RPE细胞功能障碍始终是AMD的一个重要的不利因素，在CNV的形成和发展中起着重要的作用。Bruch’s膜的粗糙，弹力纤维层变薄甚至断裂，RPE和Bruch’s膜粘附力下降，为CNV的生长提供了有利条件和促进因素，或者是诱因之一。因此，虽然目前血管内皮生长因子(vascular enthothelial growth factor，VEGF)抗体和光动力疗法等对CNV具有短期疗效，但对视功能恢复作用甚微。目前尚无能同时有效阻抑CNV和修复脉络膜-Bruch’s-RPE膜复合体的治疗措施。作为一种多功能的细胞外基质蛋白，Fibulin5(Fbln5)基因在AMD病程发展中，尤其在CNV形成过程中发挥重要作用。首先，在体内可调节细胞生长、运动及粘附，并且具有明显抑制新生血管的作用，虽然目前不能完全了解其对抗新生血管形成及VEGF作用的机制，但许多体内和体外研究证实了FBLN5可以从多个环节中对抗新生血管的形成，并且是通过RGD基序起作用的抑制新生血管形成的机理。其次，FBLN5能防止弹性蛋白病变的发生，同时充当载脂蛋白A和整合素的配体，FBLN5可通过钙依赖结合弹性蛋白的方式，促进弹性纤维组装并结合到微纤维系统中。FBLN5缺乏时由于深部弹力纤维结构的破坏，可引起皮肤、肺和脉管系统显著的异常。FBLN5的这两个重要作用恰好可以用来从不同环节抑制CNV，已有研究表明在眼部FBLN5可由RPE分泌，参与Bruch’s膜及部分玻璃膜疣的组装。另外，有系列研究发现在Fbln5基因突变与AMD具有相关性，并认为是其致病基因之一。Fbln5的突变改变了与弹性蛋白原的连接特性，可能导致Bruch’s膜正常弹性纤维的组装及稳定性异常；同时Fbln5的突变干扰了RPE与Bruch’s膜的正常粘附关系，这与AMD的血管模型的发病机制相符。因此，本课题假设：过表达FBLN5的RPE(Fbln5-RPE)视网膜下移植既能抑制VEGF产生又能补充RPE修复脉络膜-Bruch’s-RPE膜复合体，可能是治疗AMD的新手段。本研究内容是构建Fbln5慢病毒表达载体并转染RPE；体外检测其对脉络膜血管内皮细胞(Coroidal Endothelial Cells)增殖、迁移功能的影响及分子机制；将Fbln5-RPE移植到CNV动物模型的视网膜下腔，通过手术前后眼底血管荧光造影检测研究对CNV的抑制作用，由此，探讨RPE转染Fbln5后移植治疗CNV的效果和作用机制。研究方法 1.应用Rat Fbln5全长cDNA质粒(pExpress-1-Fbln5)，构建pZlen-Fbln5-IRES-GFP慢病毒表达载体，转染原代培养Long Evans(LE)大鼠RPE，采用Quantitative real-timePCR(Q-PCR)方法，从基因水平检测慢病毒FBLN5的过表达。提取培养上清液，进行FBLN5的Western-Blot检测，检测分析所构建慢病毒FBLN5过表达和分泌至细胞外的能力。 2. Fbln5-RPE对CECs增殖和迁移抑制作用及其机制的研究，实验分为三组，即单纯RPE组(空白对照)、GFP空载转染RPE(GFP-RPE)组(阴性对照)和Fbln5-RPE组(实验组)。采用Transwell共培养体系将上述三种RPE细胞分别与RF/6A猴脉络膜血管内皮细胞系(choroidal endothelial cells，CECs)进行共培养。按迁移模式共培养24小时后，检测穿透小室底膜的CECs数量和OD值，研究FB

关键词：老年性黄斑变性脉络膜新生血管视网膜色素上皮细胞脉络膜血管内皮细胞 Fibulin5 激光诱导大鼠脉络膜新生血管模型慢病毒过表达视网膜色素上皮移植 Long Evans大鼠

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