检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：林宇宁广西医科大学

学位级别：硕士

研究背景及目的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属于禽类病毒,可引起禽类爆发性感染,给家禽业造成严重的经济损失,被列为必须报告的A类传染病之一;同时NDV还是一种溶瘤病毒,对人类基本不致病,是很有潜力的肿瘤生物治疗候选病... 详细信息

研究背景及目的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属于禽类病毒,可引起禽类爆发性感染,给家禽业造成严重的经济损失,被列为必须报告的A类传染病之一;同时NDV还是一种溶瘤病毒,对人类基本不致病,是很有潜力的肿瘤生物治疗候选病毒株。NDV能感染肿瘤细胞,直接诱导肿瘤细胞膜融合,引起肿瘤细胞坏死及凋亡,是该病毒抗肿瘤的主要机制之一。血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)位于病毒包膜上,是NDV主要的抗肿瘤蛋白。慢病毒(lentivirus)为二倍体RNA逆转录病毒,其载体以慢病毒的基因组为基础,去除多个与病毒致病性相关的基因序列,然后在载体基因组中插入实验所需目的基因片段。因转染效率高,慢病毒载体可感染细胞种类多,而且能容纳较大目的基因片段,因此该载体在研究上应用较广。Micro RNA是一由20-24个核苷酸组成的小RNA,在肿瘤的发展进程中具有重要作用,研究表明micro RNA-204与肺癌细胞凋亡有关;Bcl-2是一种癌基因,具有抑制凋亡的作用,与肺癌细胞凋亡有关。研究发现,转染有NDV-HN基因的肝癌细胞株细胞凋亡与NDV-HN有关,表明NDV可通过HN致肝癌细胞凋亡而起抗癌作用。本实验拟通过构建过表达HN蛋白的人肺腺癌A549细胞株,研究HN诱导肺腺癌A549细胞的凋亡情况,以及细胞micro RNA-204的表达和抗凋亡基因Bcl-2的表达,为NDV7793-HN用于抗肿瘤生物治疗的基础研究提供理论依据。方法1.由本实验室保存的带有NDV7793-HN基因全长的质粒pc DNA3.1-HN,送公司构建sf GFP-HN载体,测序鉴定NDV7793-HN。2.将sf GFP-HN质粒和辅助质粒PH1、PH2共转染于293V细胞进行慢病毒包装,收集上清液,浓缩病毒颗粒,将实验组慢病毒命名为Lv-sf GFP-HN;同时设置质粒空载对照组,同样的方法进行空载组慢病毒包装和浓缩,将空载组慢病毒命名为Lv-sf GFP。3.将所得慢病毒颗粒10倍梯度稀释,感染293V细胞,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况,同时利用嘌呤霉素(Puromycin)进行慢病毒滴度测定,同时进行药物筛选,挑选出稳定转染的单克隆细胞株293V-sf GFP-HN和293V-sf GFP。4.将所得慢病毒颗粒感染人肺腺癌A549细胞,感染72 h后于荧光显微镜下观察GFP表达,并更换含有Puromycin的筛选培养基进行药筛,挑选稳定转染的A549-sf GFP-HN细胞和A549-sf GFP细胞单克隆细胞株。5.流式细胞仪检测293V-sf GFP-HN细胞、293V-sf GFP细胞、A549-sf GFP-HN细胞和A549-sf GFP细胞的转染率。***-PCR检测293V-sf GFP-HN细胞、293V-sf GFP细胞、293V细胞、A549-sf GFP-HN细胞和A549-sf GFP细胞转染人A549细胞后HN的m RNA的表达。*** blot检测A549-sf GFP-HN细胞、A549-sf GFP细胞和A549细胞HN蛋白的表达。***-PCR检测A549-sf GFP-HN细胞、A549-sf GFP细胞和A549细胞micro RNA-204的表达。***-PCR和Western blot检测A549-sf GFP-HN细胞、A549-sf GFP细胞和A549细胞中Bcl-2的表达。*** blot检测A549-sf GFP-HN细胞、A549-sf GFP细胞和A549细胞中Bcl-2蛋白的表达。11.流式细胞仪检测A549-sf GFP-HN细胞和A549细胞的凋亡及其在加顺铂后的凋亡情况。结果1.测序显示,本实验成功构建载体质粒sf GFP-HN,与实验室保存的pc DNA3.1-HN序列一致。*** GFP-HN转染293V细胞48 h后,荧光显微镜下观察到细胞有GFP表达,表明质粒共转染成功。*** GFP-HN转染293V细胞72 h后,荧光显微镜下观察到细胞有GFP表达,表明慢病毒包装成功,Puromycin滴度测定显示Lv-sf GFP-HN浓缩病毒滴度为1×10～6 TU/ml,Lv-sf GFP浓缩病毒滴度为1×10～7 TU/ml。*** GFP-HN转染人A549细胞72 h后,荧光显微镜下观察到人A549细胞有GFP表达,表明慢病毒成功转染人A549,用Puromycin筛选出稳定转染的A549-sf GFP-HN细胞株和A549-sf GFP细胞株。5.流式细胞仪检测293V-sf GFP-HN细胞、293V-sf

关键词： NDV 血凝素神经氨酸酶(HN) A549 慢病毒过表达载体 microRNA-204 Bcl-2

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Vasohibin-2慢病毒过表达载体的构建及相关增殖功能研究

引用

南京医科大学学报（自然科学版） 2013年第6期33卷 732-737页

作者：孙杰涂敏卫积书高文涛苗毅南京医科大学第一附属医院胆胰外科江苏南京210029 南京医科大学第一附属医院普外科实验室江苏南京210029

目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响。方法:通过逆转录、PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ... 详细信息

目的:构建Vasohibin-2(VASH2)慢病毒过表达载体,获得稳定表达的肝癌细胞株HepG2,并观察其对HepG2增殖的影响。方法:通过逆转录、PCR技术从细胞总RNA中获得VASH2目的基因,引入NheⅠ和PstⅠ酶切位点,连接到pTA2 vector中,经NheⅠ和PstⅠ双酶切后再连接到Lv-CMV-EGFP vector中,并对重组后的质粒进行双酶切和测序分析;VASH2过表达载体、pVSV-G及delta8.91 3个质粒共转染293T细胞,获得慢病毒感染肝癌细胞株HepG2,经流式细胞仪分选阳性细胞;提取细胞总RNA和总蛋白,利用real-time PCR和Western blot鉴定稳转细胞株中VASH2的表达,用MTT法和细胞周期法检测各组HepG2的增殖能力。结果:成功构建VASH2慢病毒过表达载体,感染肝癌细胞株HepG2后能够稳定高表达VASH2;稳定高表达VASH2的HepG2增殖能力明显增强(P<0.05)。结论:成功构建了VASH2慢病毒过表达载体,并发现VASH2可以促进HepG2的增殖能力,这为进一步研究VASH2在肝癌中的功能及作用机制奠定了基础。

关键词： Vasohibin-2 慢病毒过表达载体细胞增殖

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小鼠miR-125b慢病毒过表达载体构建与鉴定

引用

江苏医药 2013年第14期39卷 1616-1618,F0002页

作者：顾玉青孙杰李占军高文涛钱祝银南京医科大学第一附属医院胆胰外科江苏省210029

目的构建小鼠胰腺β细胞NIT-1中miR-125b慢病毒过表达载体。方法从小鼠基因组DNA中用PCR扩增miR-125b的前体序列,经NheⅠ和PstⅠ酶切后连接到Lv-CMV-GFP载体中,并对重组质粒进行双酶切鉴定和测序分析。将miR-125b过表达载体、pVSV-G和de... 详细信息

目的构建小鼠胰腺β细胞NIT-1中miR-125b慢病毒过表达载体。方法从小鼠基因组DNA中用PCR扩增miR-125b的前体序列,经NheⅠ和PstⅠ酶切后连接到Lv-CMV-GFP载体中,并对重组质粒进行双酶切鉴定和测序分析。将miR-125b过表达载体、pVSV-G和delta8.91质粒共转染293T细胞,收获慢病毒感染NIT-1细胞,流式细胞术分选阳性细胞,RT-PCR鉴定稳转细胞株中miR-125b的表达。结果成功构建了miR-125b慢病毒表达载体,感染小鼠胰腺β细胞NIT-1后能够成功过表达miR-125b。结论成功构建miR-125b慢病毒过表达载体,为进一步研究其功能建立了实验基础。

关键词： miR-125b 慢病毒过表达载体胰腺β细胞

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Ngn3过表达对诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响

Ngn3过表达对诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响

引用

作者：孔吟皓贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨神经元素3(neurogenin3,Ngn3)的过表达能否促进人脐带间充质干细胞(human umbilical-cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)向胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs)的诱导分化。方法:分离培养hUCMSCs,通过流式细胞术鉴定CD90,CD105,CD45,CD34的表达情况,通过成脂、成骨诱导分化鉴定细胞的多向分化潜能。使用分阶段联合诱导法诱导hUCMSCs分化为IPCs,诱导过程包括10天的低糖诱导(含EGF)和11天的高糖诱导(含激活素A和尼克酰胺)。在此基础上,分别尝试在不同时间感染Ngn3过表达慢病毒载体,确定最佳感染时间;按照确定的时间,在分阶段联合诱导过程中感染病毒,Western blot法检测Ngn3过表达情况。同时进行分阶段诱导和Ngn3过表达的诱导细胞作为实验组,仅进行分阶段诱导的细胞作为对照组。21天诱导完成后,透射电镜观察诱导前后两组细胞的结构变化;收集两组细胞的mRNA和蛋白质,通过Real-Time PCR和Western blot法比较诱导后两组细胞的胰岛素和MafA表达情况;收集培养上清液,ELISA法测定C肽分泌量。结果:成功分离hUCMSCs,细胞具有成脂、成骨分化潜能,细胞高表达CD90、CD105,低表达CD34、CD45。通过分阶段联合诱导法成功将hUCMSCs诱导为IPCs。在诱导开始前过表达Ngn3细胞出现凋亡;在诱导的第1周末,病毒载体进入细胞且Ngn3成功过表达,细胞活性稳定(该组确定为实验组);在诱导第2周末病毒载体感染失败。电镜观察实验组诱导细胞结构较对照组更为成熟;Real-Time PCR和Western blot结果显示实验组细胞阳性表达胰岛素和MafA且表达量明显高于对照组;ELISA结果显示实验组细胞在诱导中后期C肽分泌量一直略高于对照组且在诱导21天出现明显上升。结论:在分阶段诱导第1周末感染Ngn3过表达慢病毒,可促进hUCMSCs向IPCs的诱导分化。

关键词：神经元素3 胰岛素分泌细胞慢病毒过表达载体

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小鼠脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化研究

引用

中国兽医学报 2015年第5期35卷 755-764页

作者：赵天闯安星兰刘阳唐博张学明李子义吉林大学动物科学学院人类疾病动物模型国家地方联合工程实验室吉林长春130062 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100 吉林大学第一医院转化医学研究院吉林长春130061

为了通过特定转录因子将小鼠脂肪间充质干细胞(mADSCs)定向诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)。本研究分别构建Pdx1(胰十二指肠同源盒基因1)、MafA(V-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A)、NeuroD1(神经分化因子1)3种基因的慢病毒过表达载... 详细信息

为了通过特定转录因子将小鼠脂肪间充质干细胞(mADSCs)定向诱导分化为胰岛素分泌细胞(IPCs)。本研究分别构建Pdx1(胰十二指肠同源盒基因1)、MafA(V-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A)、NeuroD1(神经分化因子1)3种基因的慢病毒过表达载体,使用293T细胞对3种因子进行慢病毒包装,将3种慢病毒过表达载体以单因子侵染、双因子侵染、三因子联合侵染的方式对mADSCs进行定向分化诱导,于诱导分化第15天对不同方式诱导的IPCs进行检测鉴定,并对不同方式诱导组的IPCs进行高糖刺激,刺激后30~120min检测培养基中含糖量的变化。结果显示,构建的慢病毒过表达载体pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen-Pdx1、pHBLV-CMV-PGK-RFPMafA、pHBLV-CMV-PGK-RFP-NeuroD1所含目的片段基因序列与小鼠全基因编码序列完全一致,三种基因慢病毒过表达载体构建成功;诱导分化第15天,三因子联合诱导组所形成的IPCs克隆双硫腙(DTZ)染色呈阳性,并可表达胰岛素生物合成及分泌相关基因;在高糖刺激条件下,三因子联合诱导组糖分解速度、分解量远优于单因子或双因子诱导组。结果表明,Pdx1、MafA、NeuroD1 3种因子联合作用,可以将小鼠脂肪间充质干细胞定向诱导分化为胰岛素分泌细胞,并可在高糖刺激下,有效发挥降糖作用。

关键词：脂肪间充质干细胞(ADSCs) 胰岛素分泌细胞(IPCs) 慢病毒过表达载体诱导分化小鼠

来源：评论

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小鼠脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化研究

小鼠脂肪间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的诱导分化研究

引用

作者：赵天闯吉林大学

学位级别：硕士

胰β细胞移植是目前治疗糖尿病的最有效方法，然而这种疗法需要大量的供体细胞，因此在取材上存在一定难度。另一种有效的治疗方法是利用与胰β细胞同源的胰腺干细胞，将其增殖分化为胰β细胞。间充质干细胞同样具有分化为多种细胞类型... 详细信息

胰β细胞移植是目前治疗糖尿病的最有效方法，然而这种疗法需要大量的供体细胞，因此在取材上存在一定难度。另一种有效的治疗方法是利用与胰β细胞同源的胰腺干细胞，将其增殖分化为胰β细胞。间充质干细胞同样具有分化为多种细胞类型的分化潜能[12,13]，且对宿主细胞具有免疫逃避特性[14]，因此本实验选择了小鼠脂肪间充质干细胞做为诱导分化的细胞材料。本实验分别构建了Pdx1（胰十二指肠同源盒基因1）、MafA（V-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A）、NeuroD1（神经分化因子1）三种基因的慢病毒过表达载体，并分别将其转染入293T细胞，进行慢病毒包装。之后将所得慢病毒颗粒进行浓缩，并分别以单因子侵染、双因子侵染、三因子联合侵染的方式对mADSCs进行定向分化诱导。于诱导后第15天，对不同诱导方式的IPCs进行双硫腙（DTZ）鉴定和特异性标记物（Pdx1, MafA, NeuroD1, Ngn3及Insulin2）检测，并加以高糖刺激，刺激后30-120min检测培养基中含糖量的变化。实验结果显示：（1）慢病毒过表达载体pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen-Pdx1、pHBLV-CMV-PGK-RFP-MafA、pHBLV-CMV-PGK-RFP-NeuroD1所含目的片段基因序列与小鼠全基因编码序列完全一致，三种基因慢病毒过表达载体构建成功；（2）诱导分化第15天，三因子联合诱导组所形成的IPCs克隆双硫腙（DTZ）染色呈阳性，并可表达胰岛素生物合成及分泌相关基因；（3）在高糖刺激条件下，三因子联合诱导组糖分解速度、分解量远优于单因子或双因子诱导组。本实验通过慢病毒过表达载体，将三种在血糖调控、胰岛素基因表达、胰β细胞功能维持方面起重要作用的基因转入小鼠脂肪间充质干细胞（mADSCs）内，旨在通过以上三种因子提高诱导mADSCs定向诱导分化为胰岛素分泌细胞（IPCs）的效率。实验发现，三种因子联合应用诱导与二因子或单因子诱导相比，可以更高效率地获得IPCs，并可有效起到抑糖作用。

关键词：脂肪间充质干细胞（ADSCs）胰岛素分泌细胞（IPCs）慢病毒过表达载体诱导分化小鼠

来源：评论

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