检索结果-内蒙古大学图书馆

吉林大学学报（医学版） 2017年第4期43卷 720-724页

作者：刘微罗晓华陈文婧董媛朱洁郭健姜勇张磊孟桂先王会岩吉林医药学院检验学院生物技术教研室吉林吉林132013

目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4... 详细信息

目的:在昆虫细胞中表达2型单纯疱疹病毒(HSV-2)糖蛋白D(gD2)胞外区基因,检测其免疫原性。方法:以HSV-2病毒基因组为模板,PCR扩增得到gD2片段,构建至杆状病毒质粒Bacmind中,转染sf9细胞,包装重组杆状病毒,收集后连续感染sf9细胞,收获第4代重组杆状病毒(P4),通过Western blotting法鉴定蛋白表达情况,采用空斑实验检测重组病毒滴度,将P4代重组病毒作为种子大量感染sf9细胞,上清经镍柱亲和层析进行纯化,将纯化后的蛋白在第0、2和4周免疫BALB/c小鼠(gD2组),以PBS作为阴性对照(PBS组),ELISA检测小鼠血清中gD2特异性IgG滴度。结果:PCR鉴定和DNA测序,重组表达质粒gD2-Bacmind构建正确,空斑实验检测重组病毒滴度为2.0×109 pfu·mL-1,纯化的gD2重组蛋白在相对分子质量37 000处出现目标条带,纯度达90%以上。第6周gD2组小鼠免疫血清中gD2特异性IgG抗体滴度Log10平均值达到4.34,与PBS组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:利用昆虫-杆状病毒表达系统表达的gD2胞外区蛋白具有良好的免疫原性,可作为HSV-2疫苗的候选。

关键词：生殖器疱疹疱疹病毒2型人糖蛋白D 昆虫-杆状病毒表达系统

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ENO1蛋白及其相关活性位点缺失的蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达与鉴定

ENO1蛋白及其相关活性位点缺失的蛋白在昆虫杆状病毒系统中的表达...

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作者：代鹏钰甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的通过昆虫杆状病毒系统表达糖酵解途径关键酶ENO1（Enolase 1,ENO1）及其活性位点缺失的ENO1蛋白。为后续研究其具体活性位点及宫颈癌的代谢治疗方面提供新的思路。方法1.参照人ENO1基因序列（Gene Bank:NM＿001428）,利用Swiss-mode... 详细信息

目的通过昆虫杆状病毒系统表达糖酵解途径关键酶ENO1（Enolase 1,ENO1）及其活性位点缺失的ENO1蛋白。为后续研究其具体活性位点及宫颈癌的代谢治疗方面提供新的思路。方法1.参照人ENO1基因序列（Gene Bank:NM＿001428）,利用Swiss-mode、Pymol软件（http://***）等进行蛋白二级结构预测;后通过Alpha Fold2模拟蛋白的三维结构,用Py MOL2.5.5软件进行可视化分析。 2.穿梭载体Bacmmid-ENO1和Bacmid-M1、Bacmid-M2、Bacmid-M3的构建。首先将ENO1目的基因序列根据昆虫细胞密码子偏好性进行优化、合成,在C端添加gp64信号肽（ATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCT GCCTTTGCG）,在N端加gslinker、His标签设计目的蛋白。利用分子克隆技术将其插入p Fast BacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒p Fast Bac-ENO1。而ENO1发挥糖酵解酶功能的活性位点有三个（PSGASTGI、GSHAGNK和SPDDPSRY）,分别缺失其活性位点,同样进行优化后将其插入p Fast BacTM1载体,获得三个活性位点缺失的重组质粒p Fast Bac-M1、p Fast Bac-M2、p Fast Bac-M3。然后将重组质粒转化至DH10BacTM感受态细胞,在转座酶的作用下,通过蓝白斑筛选及PCR验证,分析获得重组杆粒Bacmmid-ENO1和Bacmid-M1、Bacmid-M2、Bacmid-M3。 3.表达和鉴定ENO1蛋白及其活性位点缺失的蛋白以ENO1蛋白为例,提取重组杆粒Bacmmid-ENO1,然后通过转染Expi Sf9TM昆虫细胞,获得P0代重组杆状病毒,并将其再次感染Expi Sf9TM昆虫细胞,获得P1代重组杆状病毒。后将P1代杆状病毒再次感染Expi Sf9TM昆虫细胞,在Expi Sf Enhancer的作用下,产生重组蛋白ENO1,通过利用SDS-PAGE、Western blot等方法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。其他三个活性位点缺失的蛋白表达同上。结果1.成功构建ENO1二维结构;成功模拟ENO1的三维结构及重组质粒改造。 2.重组质粒p Fast Bac-ENO1和p Fast Bac-M1、p Fast Bac-M2、p Fast Bac-M3由华大公司合成,并且测序进行了验证;PCR验证重组杆粒Bacmmid-ENO1和Bacmid-M1、Bacmid-M2、Bacmid-M3构建成功。3.重组杆粒转染昆虫细胞Expi Sf9TM细胞获得重组杆状病毒,将其继续转染昆虫细胞成功获得重组蛋白ENO1及其活性位点缺失的重组蛋白。结论本课题成功模拟目的蛋白ENO1的三级结构,后通过昆虫-杆状病毒表达系统表达目的蛋白及其活性位点缺失的三个蛋白,为后续研究ENO1蛋白的具体活性位点,筛选高亲和力ENO1 mAb奠定基础。

关键词：昆虫-杆状病毒表达系统 ENO1 蛋白表达酶活性位点

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肠道病毒71型VP1蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2015年第9期31卷 1230-1233页

作者：赵培培孔枕枕刘海冰茅凌翔苏兆亮仝佳王胜军陈建国江苏大学检验医学研究所江苏镇江212013 江苏大学附属人民医院检验科江苏镇江212002 镇江市疾病预防控制中心检验科江苏镇江212001

目的利用昆虫杆状病毒表达系统表达肠道病毒71型VP1蛋白并对其进行纯化。方法首先通过化学合成法合成EV71 VP1基因,然后将EV71 VP1基因插入到供体质粒pFast Bac1中,构成重组质粒pFast Bac1-VP1,再转入JM190感受态细菌扩增,然后提取重组... 详细信息

目的利用昆虫杆状病毒表达系统表达肠道病毒71型VP1蛋白并对其进行纯化。方法首先通过化学合成法合成EV71 VP1基因,然后将EV71 VP1基因插入到供体质粒pFast Bac1中,构成重组质粒pFast Bac1-VP1,再转入JM190感受态细菌扩增,然后提取重组质粒pFast Bac1-VP1转入DH10BacTM感受态细胞,通过转座从而获得重组质粒bacmid-VP1,采用脂质体Cellfectin Reagent将重组质粒bacmid-VP1转染Sf9细胞。通过SDS-PAGE、Western blot法检测目的蛋白的水平,经镍离子亲和层析,纯化VP1蛋白。结果 SDS-PAGE及Western blot法检测获得蛋白的相对分子质量与预期结果一致。Bradford分析纯化后蛋白的浓度为70μg/m L,纯化度达90%。结论利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达EV71 VP1蛋白。

关键词： EV71 VP1蛋白昆虫-杆状病毒表达系统

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昆虫-杆状病毒表达重组戊型肝炎疫苗工艺的优化

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中国生物制品学杂志 2024年第12期37卷 1476-1483页

作者：张逸驰李媛媛边雅静吴清胜孙立影郭胜华白云鹏张占东佟雪莲姚春萍李静王昌昊国药中生生物技术研究院有限公司戊肝课题组北京101111

目的优化昆虫-杆状病毒表达系统培养工艺,进一步提高重组戊型肝炎类病毒颗粒(hepatitis E virus-like particles,HEV-LPs)蛋白表达量,并进行工艺放大及验证。方法对Sf9昆虫细胞进行无血清悬浮培养,通过摇瓶级联放大,建立7 L生物反应... 详细信息

目的优化昆虫-杆状病毒表达系统培养工艺,进一步提高重组戊型肝炎类病毒颗粒(hepatitis E virus-like particles,HEV-LPs)蛋白表达量,并进行工艺放大及验证。方法对Sf9昆虫细胞进行无血清悬浮培养,通过摇瓶级联放大,建立7 L生物反应器培养工艺,并对细胞接种重组戊型肝炎杆状病毒时的活细胞密度、培养温度及病毒接种比例等参数进行优化,观察细胞生长状态,分析目的蛋白表达量,对目的蛋白采用SDS-PAGE、Western blot、高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)、透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)检测,综合分析HEV-LPs颗粒形态及蛋白产量,确定适合的重组HEV-LPs培养表达参数,进行连续3批7 L规模重组戊型肝炎疫苗的制备。结果 7 L生物反应器对昆虫细胞最佳培养参数为:搅拌速度90 r/min,pH(6.2±0.1),培养温度27℃,接种重组杆状病毒的细胞密度6.0×10~6 cells/mL,溶氧90%。此时,表达的HEV-LPs目的蛋白相对分子质量约58 000,可与HEV鼠源单克隆抗体特异性结合;最终产量为60~70 mg/L,纯度大于95%;TEM镜下可见球形颗粒,直径约20 nm。应用优化参数制备的HEV-LPs重组蛋白产量稳定、颗粒形态均一。结论成功优化了重组戊型肝炎疫苗培养表达工艺,并进行了放大工艺的稳定性验证,为重组戊型肝炎疫苗生产工艺的研发奠定了基础。

关键词：戊型肝炎疫苗昆虫-杆状病毒表达系统生物反应器培养工艺优化类病毒颗粒

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基因Ⅶ型新城疫病毒样颗粒的制备与鉴定

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中国兽医学报 2016年第1期36卷 18-23页

作者：袁乾亮钱晶薛聪穆昱丁壮吉林大学动物医学学院吉林长春130062

利用Bac-to-Bac昆虫-杆状病毒表达系统分别构建了含有新城疫强毒株M、F、NP和HN等4个结构基因的单顺反子重组杆粒,经转染后,观察Sf9细胞病变以及PCR鉴定结果表明成功构建了4种重组杆状病毒;收集重组杆状病毒采用共感染策略,Sf9细胞上... 详细信息

利用Bac-to-Bac昆虫-杆状病毒表达系统分别构建了含有新城疫强毒株M、F、NP和HN等4个结构基因的单顺反子重组杆粒,经转染后,观察Sf9细胞病变以及PCR鉴定结果表明成功构建了4种重组杆状病毒;收集重组杆状病毒采用共感染策略,Sf9细胞上清经超速离心,蔗糖密度梯度纯化与浓缩后,利用Western blotting方法和透射电子显微镜技术检测,结果表明目的蛋白均正确表达且组装成具有完整囊膜形态的病毒粒子。

关键词：新城疫病毒样颗粒新型疫苗昆虫-杆状病毒表达系统

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PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究

PPRV病毒样颗粒的构建、制备及免疫原性研究

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作者：闫飞虎中国人民解放军军事医学科学院

学位级别：硕士

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)俗称羊瘟,又被称为小反刍兽假性牛瘟,是一种由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的急性或亚急性传染病。世界动物卫生组织(The World Organization for Animal Health,OIE)将其列为必须通报疫病,我国将其列为一类动物疫病。2007年7月在我国西藏阿里地区出现了中国首例小反刍兽疫,2014年我国大面积爆发小反刍兽疫,波及20余省份,给当地养羊业造成巨大经济损失。此外,小反刍兽疫经空气传播,最易感的是小反刍动物,尤其野生小反刍动物不受国界限制,很容易造成全球性蔓延,所以有效的预防显得尤为重要。弱毒疫苗是OIE规定的唯一允许使用的小反刍兽疫病毒疫苗,然而PPRV对热非常敏感,疫苗在保护和运输过程中保持冷链状态相对较为困难。此外,减毒活疫苗还存在毒力返强的风险,这就限制了PPR弱毒疫苗的大规模田间使用,因此迫切需要开发一种安全有效、热稳定性好的疫苗候选。相比弱毒疫苗与灭活疫苗,病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)疫苗成为安全稳定的疫苗候选者之一,病毒样颗粒是由病毒一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒。在形态上,VLPs类似于真实的病毒粒子,但是由于缺乏具有感染性的核酸,故无复制和感染能力。虽然病毒样颗粒不具有感染性,但VLPs具有类似于天然病毒的理化性质,能被抗原提呈细胞摄取加工提呈,激发细胞免疫反应和体液免疫应答,具有安全性高和免疫原性好的优点。流感VLPs疫苗、乙型肝炎VLPs疫苗及猪圆环病毒2型VLPs疫苗都已进入临床试验或者已被比准上市。但目前为止,有关小反刍兽疫病毒病毒样颗粒(PPRV VLPs)构建研究的报道较少。因此,本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统构建生产不同毒株的PPRV VLPs,并对其免疫原性进行研究比较,选取免疫原性好的毒株的病毒样颗粒进行本动物免疫,为开发安全、有效的小反刍兽疫病毒样颗粒候选疫苗奠定基础。第1章:小反刍兽疫M、F和H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备本研究以PPRV疫苗株Nigeria 75/1株为研究对象,分别针对其M、F和H蛋白的主要抗原表位区设计克隆引物,通过RT-PCR扩增去除跨膜区和信号肽序列而保留主要抗原表位区片段,将编码序列大小分别为1005 bp PPRV M基因片段克隆至原核表达载体p ET-30a(+)中,将编码序列大小分别为1653 bp和1245 bp的PPRV F、H基因片段分别克隆至原核表达载体p GEX-4T-1中,构建重组质粒p ET-30a(+)-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H。将各表达质粒转化宿主菌Transetta(DE3),表达条件经优化后最终确定为0.4m M IPTG和37℃条件下诱导表达4h,经SDS-PAGE分析结果显示重组质粒p ET-30a(+)-M、p GEX-4T-1-F和p GEX-4T-1-H在大肠埃希菌中分别诱导表达出分子质量为61 k D、66 k D和60 k D的重组蛋白,大小与预期相符,主要以不溶性包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示M、F、H重组蛋白均能被绵阳抗PPRV多克隆抗体特异性识别。以经Ni-NTA亲和层析纯化后的M、F和H重组蛋白分别免疫昆明鼠,经3次免疫后采血,分离血清,制备鼠抗PPRV M、F和H蛋白多克隆抗体,为后期鉴定重组杆状病毒奠定了基础。第2章:小反刍兽疫病毒Nigeria 75/1株病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了Nigeria 75/1株M、F和H基因,构建了含有双目的基因的重组杆状病毒rp FB-2M、rp FB-2F和rp FB-2H。以鼠抗M、H蛋白的主要抗原表位区多克隆抗体与绵羊抗PPRV阳性血清对重组杆状病毒感染细胞进行间接免疫荧光(IFA)鉴定,可见特异性荧光;以三种重组杆状病毒共感染昆虫细胞Sf9的方式组装病毒样颗粒,放大培养后进行病毒样颗粒纯化。电镜下可以到80-100nm左右的病毒样粒子,且表面纤突明显。Western blot检测纯化后样品可见相对分子质量为38k D,59k D和68k D左右的条带,表明基质膜蛋白与两种囊膜糖蛋白成功组装出病毒样颗粒,且免疫小鼠可诱导产生保护性中和抗体。第3章:China/tibet/geg/07-30株PPRV病毒样颗粒的构建及其免疫原性研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,本研究扩增了PPRV China/tibet/geg/07-30株(Gen Bank Access ***905304.1)M、F、H和N基因,构建

关键词：小反刍兽疫病毒多克隆抗体昆虫-杆状病毒表达系统病毒样颗粒共表达共感染中和抗体滴度

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杆状病毒系统表达EV71 VP1蛋白及其在ELISPOT检验的应用

杆状病毒系统表达EV71 VP1蛋白及其在ELISPOT检验的应用

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作者：赵培培江苏大学

学位级别：硕士

目的:应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中表达EV71 VP1蛋白，用表达纯化的VP1蛋白作为包被抗原建立ELISPOT检测EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞的方法，并评价该方法在检测EV71感染诊断中的应用价值。　　方法:(1)利用RT... 详细信息

目的:应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在sf9昆虫细胞中表达EV71 VP1蛋白，用表达纯化的VP1蛋白作为包被抗原建立ELISPOT检测EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞的方法，并评价该方法在检测EV71感染诊断中的应用价值。　　方法:(1)利用RT-PCR技术从EV71基因组扩增VP1基因。将VP1基因插入到供体质粒pFastBac1中，构建重组质粒pFastBac1-VP1，再转入***5 a感受态细胞进行扩增。然后提取重组质粒pFastBac1-VP1，将其转入DH10BacTM（含有杆状病毒质粒和辅助质粒）感受态细胞，通过转座作用将目的基因VP1整合到杆状病毒质粒中，再通过抗性和蓝白斑筛选出重组杆状病毒质粒Bacmid-VP1，提取重组的杆状病毒质粒，以M13通用引物进行PCR鉴定。　　(2)采用脂质体Cellfectin Reagent将鉴定正确的重组杆状病毒质粒Bacmid-VP1转染sf9细胞，显微镜观察细胞变化。收获P1代病毒，用P1代病毒感染sf9细胞，观察细胞病变效应。PCR鉴定目的基因是否整合到杆状病毒质粒中。　　(3)通过SDS-PAGE及Western blot法鉴定目的蛋白的表达。经镍离子亲和层析，纯化VP1蛋白，并进行浓度及纯度测定。　　(4)用纯化的VP1蛋白作为包被抗原，建立ELISPOT检测方法，优化实验方案，包括最佳蛋白包被浓度、细胞浓度、HRP标记抗体工作浓度等。　　(5)应用ELISPOT方法检测EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞，评估重组VP1蛋白在检测EV71感染中的应用价值。　　结果:(1)RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，成功获得VP1目的基因。构建重组质粒pFastBac1-VP1转化DH10BacTM感受态细胞，阳性Bacmid-VP1重组子经M13通用引物PCR验证获取3227 bp大小的目的片段，与理论大小相符，表明成功构建了杆状病毒质粒。　　(2)重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，48h后，细胞变大，裂解死亡，表明杆状病毒质粒转染成功。P1代病毒感染sf9细胞，诱导重组VP1蛋白表达，用VP1基因特异引物经PCR鉴定可以扩增出目的基因，表明目的基因成功整合到杆状病毒质粒中。　　(3)SDS-PAGE及Western blot检测，在36 kDa出现特异性条带，与目的蛋白大小一致，表明目的蛋白成功表达。纯化的VP1蛋白纯度为90％，浓度为70μg/ml。　　(4)用纯化的VP1蛋白作为包被抗原，建立ELISPOT检测方法，优化后的实验方案为:蛋白包被浓度为20μg/ml，细胞浓度为5×106/ml，HRP标记抗体稀释度为1∶10000。　　(5) ELISPOT结果提示，EV71感染者外周血抗VP1抗体分泌细胞明显增加。ELISPOT敏感性为90.0％，特异性96.7％。与ELISA检测抗EV71抗体方法比较，ELISPOT优于ELISA。　　结论:用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了EV71 VP1蛋白，以VP1蛋白作为包被抗原建立ELISPOT方法检测EV71感染患者外周血特异性抗体分泌细胞，有较高的特异性和灵敏度，有望成为诊断EV71感染的一种理想方法。

关键词：肠道病毒71型感染 VP1蛋白昆虫-杆状病毒表达系统酶联免疫分析技术诊断价值

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重组MICA 08蛋白制备及其预存抗体对大鼠肾移植的影响

重组MICA 08蛋白制备及其预存抗体对大鼠肾移植的影响

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作者：李恩春苏州大学

学位级别：博士

肾移植后随着新型针对T细胞强效免疫抑制剂的广泛联合应用，使急性细胞性排斥反应得到了很好的控制，也大大减少了早期移植肾的丢失。然而，近年研究表明移植肾长期存活并没有随之得到很好改善，这使人们开始重视HLA（Human leukocytean... 详细信息

肾移植后随着新型针对T细胞强效免疫抑制剂的广泛联合应用，使急性细胞性排斥反应得到了很好的控制，也大大减少了早期移植肾的丢失。然而，近年研究表明移植肾长期存活并没有随之得到很好改善，这使人们开始重视HLA（Human leukocyteantigen，HLA）抗体介导的急、慢性体液性排斥反应对移植肾长期存活的意义。尽管在抗体介导排斥反应中，多数情况是由于HLA抗体的缘故，但在一些HLA抗体阴性的患者中也发生了肾移植失功，这表明除HLA抗体外还存在其它抗体也介导移植肾失功。主要组织相容性复合物-Ⅰ类相关链A（Major histocompatibility complex classI–related chain A，MICA）基因位于人第6号染色体的MHC-I类区域中，具有高度多态性，其编码MICA分子表达在内皮细胞表面。功能上MICA分子不结合β2微球蛋白，缺乏与CD8受体特定结合的残基，没有抗原肽递呈能力；其系通过与NKG2D（Naturalkilling cells receptor G2D，NKG2D）受体结合实现生物学功能。NKG2D是为NK细胞活化性受体，除表达于NK细胞外，还表达在γδT、CD8+T细胞上。MICA分子与NKG2D结合后不仅能激活NK细胞和T细胞毒性作用，分泌大量细胞因子及细胞毒介质，造成移植物破坏；而且能促使B细胞产生相应MICA抗体，参与体液免疫应答。由于MICA分子通常不表达在淋巴细胞表面，在肾移植时通常采用的淋巴细胞交叉反应无法检测到MICA抗体。近年随着MICA抗体检测技术的进步，多个器官移植中心在移植受者、排斥反应前、发生排斥反应切除的移植物中及其洗脱液中都检测到MICA抗体，使MICA抗体的体液免疫作用备受关注，成为移植免疫研究的热点。一系列研究表明，MICA抗体与排斥反应相关，对移植物的长期存活存在负面效应，这种负面效应在HLA良好配型无或少量HLA抗体的受体中更为明显。虽然有研究认为MICA抗体可以通过补体依赖的细胞毒途径造成内皮细胞损伤，引起移植物失功；但对MICA抗体引起急、慢性排斥反应的确切分子免疫作用机制及系统干预措施目前仍不十分清楚，也缺乏特异性MICA抗体介导的体液性排斥反应动物模型相关方面研究。因此，我们设想采用蛋白重组技术制备具有免疫活性的重组MICA08蛋白免疫大鼠，建立预存特异性MICA抗体动物模型。通过对预存特异性MICA抗体动物进行肾移植诱导建立特异性MICA抗体介导的排斥反应并观察其对大鼠移植肾的影响，探讨新型免疫剂利妥昔单抗在干预MICA抗体介导的排斥反应中的价值。研究分三个部分：第一部分：应用昆虫-杆状病毒表达系统制备重组MICA08蛋白目的：应用昆虫-杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf-9)中表达人MICA﹡008胞外结构域。方法：采用昆虫-杆状病毒表达系统，构建重组转移载体pFastBac-MICA﹡008，并将其转化到E. coliDH10Bac感受态细胞中进行转座，通过蓝白斑筛选和测序鉴定后，获得重组杆状病毒Bacmid-MICA﹡008；应用脂质体转染Sf9细胞进行目的蛋白表达，并对表达产物进行镍柱亲和层析纯化、Western blot和考马斯亮兰染色鉴定。结果：在重组病毒感染第四天后收集P3代病毒上清液，P3代上清液经镍柱亲和层析纯化，最后获得纯化重组MICA08蛋白量约为1.4-1.5mg/L。纯化MICA08蛋白经Westernblot和考马斯亮蓝染色鉴定，可见一条分子量约为37kDa的特异性条带与目的蛋白大小相符。结论：应用昆虫-杆状病毒表达系统可在昆虫细胞中成功表达重组人MICA08蛋白，为下步预存抗体模型的建立奠定了物质基础。第二部分显微外科微血管吻合技能训练及大鼠原位肾移植模型建立目的：探讨快速建立大鼠原位肾移植模型的显微外科训练方法，为开展肾移植基础研究奠定基础。方法：设计并实施循序渐进式显微外科训练项目，以快速突破微血管吻合技术瓶颈。训练项目包括镜下纱布缝合、大鼠颈动脉吻合、大鼠股血管吻合及大鼠尾动脉吻合训练。然后采用30例同系SD大鼠供体双肾切除原位移植训练积累手术经验，克服学习曲线；术中肾血管重建采用端-端吻合法，尿路重建运用膀胱瓣技术或输尿管-输尿管端端吻合。模型稳定后，再行20例SD→Wistar大鼠异系移植建立急性排斥反应模型，并将其随机分排斥组和MMF治疗组，MMF治疗组给予MMF20mg/kg/d灌胃，×10d。在术后第3d、7d、14d、21d采血，行血清肌酐检测。结果：通过2个月强化显微外科培训，完成了200根以上微血管吻合练习，大鼠肾移植模型趋于稳定，术后一周成活率达90%。在行20例异系移植中，平均手术时间为72.9±4.18min，

关键词：昆虫-杆状病毒表达系统重组MICA蛋白预存MICA抗体肾移植大鼠利妥昔单抗

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PRRSV分子流行病学分析及其主要结构蛋白的真核表达

PRRSV分子流行病学分析及其主要结构蛋白的真核表达

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作者：张冠群华南农业大学

学位级别：硕士

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的以怀孕母猪的流产、死胎、弱胎以及仔猪高死亡率等为特征的传染病。2006年以来，在我国多个省份相继爆发的由PRRSV变异株引起的“高热病”，该变异株在全国范围内大规模流行，造成各年龄段猪群的高热、高发病率和高死亡率，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。本研究对2007～2010年广东省内的73株PRRSV的NSP2、ORF5基因进行序列测定，又挑选了其中变异较大的两个毒株进行全基因组序列测定，对测序结果进行生物信息学分析，为全面系统地了解广东省内PRRSV的流行情况和进化趋势提供依据。同时，将2007年毒力较弱的GDB6株的主要结构蛋白基因构建到杆状病毒基因组上，探索其在昆虫Sf9细胞中的表达，为研制新型疫苗提供基础。\n NSP2、ORF5基因测序结果表明，73株PRRSV中Yg株为经典株，其余72株为NSP2基因有30个非连续氨基酸缺失的变异株，2007～2010年广东省内流行的PRRSV既有经典株又有变异株，但仍以变异株的广泛流行为主，经典株零星存在。序列相似性和系统进化树分析表明，美洲型PRRSV主要可以分为四个亚群，Yg株NSP2基因与美洲原型株VR-2332的核苷酸序列相似性为99.3%，与变异株的核苷酸序列相似性只有78.8%～80.7%，在进化关系树上与VR-2332同处亚群Ⅰ分支，而ORF5基因与美洲原型株VR-2332和变异株的核苷酸序列相似性分别为88.4%和96.8%～98%，在进化关系树上与变异株同处亚群Ⅳ分支，Yg株可能为疫苗株与野毒变异株重组的结果。本研究的72株变异株GP5蛋白有强毒株的第13、151位特征性氨基酸位点，在进化关系树上与国内变异株JXA1等同处亚群Ⅳ分支，进化关系很近，部分毒株GP5蛋白诱骗表位的氨基酸替换和第二个潜在糖基化位点往PNE的迁移很可能预示着病毒正采取一种更有利于逃逸机体免疫应答的方式进化。\n 本研究JP、YD和DC株在变异株NSP2基因原有第481、532～560位30个非连续氨基酸缺失的基础上，又分别在第494～512位、第489～510位和第153位(以VR-2332为标准)有新的19个、22个和单氨基酸的缺失，表明NSP2基因可以容纳不同程度的缺失，这些缺失能否成为病毒进化或者毒力改变的关键位点有待进一步的研究。对YD、DC两个毒株的全基因组序列测定结果显示，这两个毒株与变异参考毒株相比，核苷酸序列相似性分别为98.5%～99.1%和97.5%～97.9%，变异分布于整个基因组，但主要集中在NSPiβ、NSP2、NSP3、NSP7、NSP8、GP2a、GP5基因，表明PRRSV的变异进程仍在继续，但这些变异对病毒的特性和毒力的影响，还有待进一步的研究。\n 通过基因克隆技术，将GDB6株的ORF5、ORF6、ORF7基因插入到转移质粒载体pFastBacHTA中，获得重组转移质粒pFastBacHTA-ORF5、-ORF6、-ORF7，并将其转化DH10Bac感受态细胞，与Bacmid发生位点特异性转座作用，经筛选获得重组穿梭质粒Bacmid-ORF5、-ORF6、-ORF7，再将其转染昆虫Sf9细胞获得含有这三个基因的重组杆状病毒。重组杆状病毒可以在Sf9细胞中增殖和稳定遗传，对P3代培养物进行重组杆状病毒基因组DNA提取以及重组杆状病毒感染Sf9细胞72h后总RNA提取，可以初步断定这三个基因已经正确插入到杆状病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游，并能启动转录，对表达产物的Western Blot检测结果进一步证明ORF5、ORF6基因在Sf9细胞中分别得到了表达。对重组杆状病毒进行蚀斑纯化和滴度测定，测定结果含有这三个基因的重组杆状病毒的滴度分别为6×107、8×106、1×1010pfu/mL，基本满足蛋白大量表达的需要，可以进行下一步PRRSV病毒样颗粒构建的研究。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒相似性系统进化树昆虫-杆状病毒表达系统真核表达

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人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究

人源抗EV71病毒基因工程抗体的研究

引用

作者：张黎中国疾病预防控制中心

学位级别：硕士

肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒A属,主要引起婴幼儿的手足口病,重症者出现病毒性脑炎、脑膜炎、肺水肿、肺出血,个别病例进展快速,迅速导致死亡。EV71病毒从1969年在美国加尼福尼亚最早被发现以来,至今一... 详细信息

肠道病毒71型(Enterovirus 71, EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒A属,主要引起婴幼儿的手足口病,重症者出现病毒性脑炎、脑膜炎、肺水肿、肺出血,个别病例进展快速,迅速导致死亡。EV71病毒从1969年在美国加尼福尼亚最早被发现以来,至今一共引起了10多次的世界范围的爆发和流行,其中又有四次大的流行。从2008年安徽阜阳爆发EV71以来,卫生部发布《手足口病预防控制指南》并将手足口病纳入丙类传染病来管理。在丙类传染病中手足口病发病数位于第三,而死亡数为第一位。对EV71的感染临床上主要采用广谱抗病毒药物以及对症治疗,但目前没有针对EV71特效抗病毒药物,疫苗正处于研制阶段。所以研究EV71作为一种微生物致病原所引发的机体免疫应答,对明确发病机制、制定预防诊治策略具有重要意义。在EV71抗体的研究方面,目前仅有鼠源的单克隆中和性抗体的报道,而鼠源抗体本身就存在很多缺陷,从而限制了其很多的应用。本文采用了pHAL14系统,构建了人源抗EV71病毒sc-Fv单链抗体基困库,并利用原核表达纯化的VP1蛋白筛选获得了1株抗EV71病毒特异性人源sc-Fv单克隆抗体,并将其分别构建表达成为单链-Fc和IgG形式的全抗体,为进一步研究病毒免疫和抗体结合表位奠定了基础。本研究以噬菌体表面展示技术为平台,筛选人源抗EV71病毒抗体,实验有以下两部分：一,人源抗EV71病毒scFV(?)笨菌体抗体库的构建与筛选采集9位EV71引起的手足口病患儿恢复期外周全血,分离淋巴细胞,然后提取总RNA并反转录成cDNA,接着用特异性的PCR引物经过两轮扩增特异性轻链和重链可变区基因,在对PCR产物鉴定和纯化后,用轻链基因与噬菌粒pHAL14构建了轻链库,随后将重链基因克隆入轻链库中构建scFv噬菌体抗体库。最后使用辅助噬菌体对scFv噬菌体抗体库进行包装,检测库容量,结果表明我们所构建scFV(?)噬菌体抗体库的容量为4.0×108,轻链插入率和重链插入率均为100%,满足筛库的需要。在成功构建scFv噬菌体抗体库的基础上,用原核表达纯化的VP1蛋白对噬菌体抗体库进行富集筛选,利用ELISA、IFA以及Western Blot对所获人源单克隆抗体的功能特性进行鉴定,并通过序列测定确定所获抗体的基因序列,然后与Genebank报道的抗体序列进行比较,根据抗体基因序列推断出其氨基酸序列,与vbase database中抗体序列信息比较,确定其CDR区。结果获得1株scFv抗体,一系列功能试验均证明该抗体是特异针对EV71 VP1蛋白。二,人源抗EV71病毒全抗体表达及功能鉴定在原核表达scFv抗体的基础上,分别利用哺乳动物瞬时表达系统和昆虫杆状病毒载体技术平台实现了全抗体的真核分泌表达。将该EV71抗体的轻链和重链的可变区基因插入杆状病毒载体pCMX2.51和pAc-L-CH3R,然后将构建好的重组质粒转染293T细胞和与杆状病毒重组后转染昆虫细胞,通过IFA检测转染效果,接着对昆虫细胞表达上清进行纯化。利用SDS-PAGE、ELISA、IFA、Western Blot等方法检测纯化的抗EV71病毒IgG全抗的功能活性,结果表明该人源单克隆抗体特异性针对EV71病毒VP1蛋白。在和A型以及两株C4亚型EV71病毒进行中和试验,结果显示该抗体没有中和活性。综上所述,本研究运用噬菌体抗体库技术,成功构建了人源抗EV71病毒scFv噬菌体抗体库,筛选获得了1株特异性针对EV71病毒VP1蛋白的人源单链抗体。将该抗体构建为IgG全抗体,经IFA、Western Blot检测显示具有功能活性,与A型和C4亚型的病毒中和试验结果显示没有中和活性。

关键词： EV71病毒人源基因工程抗体噬菌体展示技术昆虫-杆状病毒表达系统

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