检索结果-内蒙古大学图书馆

世界最新医学信息文摘 2019年第76期18卷 120-122+131页

作者：姜倩倩李国才扬州大学医学院/转化医学研究院江苏省非编码RNA重点实验室江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心

毒素抗毒素系统(TA)由稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素(RNA或蛋白质)组成,二者协同表达,构成一个发挥多种功能的调控系统。持留菌是生长抑制、代谢减缓、但能够在致死性应激之后恢复生长的细菌。毒素抗毒素系统能够促进持留菌的形成,导... 详细信息

毒素抗毒素系统(TA)由稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素(RNA或蛋白质)组成,二者协同表达,构成一个发挥多种功能的调控系统。持留菌是生长抑制、代谢减缓、但能够在致死性应激之后恢复生长的细菌。毒素抗毒素系统能够促进持留菌的形成,导致细菌多药耐药性的增加,靶向TA系统的新型抗菌药物的需求日益增长。总结了近年来毒素抗毒素系统介导持留菌形成的分子机制,以期为设计新型抗菌药物提供参考和帮助。

关键词：毒素抗毒素系统持留菌抗菌靶向药物

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鸭疫里默氏杆菌RA-WH9菌株Ⅱ型TA系统的鉴定与功能研究

鸭疫里默氏杆菌RA-WH9菌株Ⅱ型TA系统的鉴定与功能研究

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作者：王文敬南华大学

学位级别：硕士

背景:毒素抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系统是广泛存在于细菌基因组和可转移元件中,由2个基因组成的共转录单元,其中1个基因编码不稳定的抗毒素分子,另一个基因编码稳定的毒素蛋白。鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)隶属于... 详细信息

背景:毒素抗毒素(Toxin-antitoxin,TA)系统是广泛存在于细菌基因组和可转移元件中,由2个基因组成的共转录单元,其中1个基因编码不稳定的抗毒素分子,另一个基因编码稳定的毒素蛋白。鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)隶属于黄杆菌科,是一种不形成孢子的革兰氏阴性细菌。目前,在RA中尚未见相关TA系统的研究报道。TA的存在能提高细菌适应外界多变环境的能力。同时,依据TA的生物学特性,也可以将其开发为阻断特定生物学过程(如翻译起始)的生物制品。目的:鉴定RA-WH9菌株所含961质粒中预测到的TA系统,探究其生物学特性,以期增加人们对TA系统的认识,为其他菌种TA系统的研究提供参考。同时,也为鸭疫里默氏杆菌的防控提供理论基础,丰富TA在作为抗菌药、抗病毒药或抗肿瘤药应用上的研发思路。方法:1.生物信息学方法预测RA-WH9菌株所含961质粒上潜在的TA系统。2.分子生物学实验确认基因共转录,鉴定TA所属类别,BLAST比对相似序列,绘制进化树,进行同源性分析。3.原核表达毒素抗毒素蛋白,测定细菌生长曲线,透射电镜观察细菌形态、检测外膜疏水性,探究TA系统对细菌生长性能的影响;比较生物膜形成能力、最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)、持留菌存在量和脂多糖表达模式的差异,解析TA对细菌生存性能的影响。4.链特异性差异转录组测序,比较诱导前后基因表达差异,明确TA系统调控网络。结果:*** finder预测结果表明,RA-WH9菌株所含质粒961上存在3个毒素同源蛋白,2个抗毒素同源蛋白,但只有一对组合满足TA系统中毒素与抗毒素相邻要求(命名为Xre-Rel E系统)。2.共转录实验结果,证实Xre-Rel E系统基因共转录,序列比对结果显示,Xre/Rel E蛋白种属内同源性较高,但未见文献报道与之相似的TA系统。3.原核表达菌株生长曲线结果表明:毒素蛋白Rel E的高表达可显著抑制宿主菌的生长,而高表达抗毒素蛋白Xre可逆转这一抑制;透射电镜结果显示:高表达的毒素蛋白Rel E显著减少了宿主菌表面胞外多糖的形成,增强了宿主菌的疏水性;Live/Dead实验结果证实:毒素蛋白Rel E高表达后,宿主菌生物膜形成能力增强;MIC检测结果发现,毒素蛋白Rel E表达后宿主菌对替加环素与美罗培南更敏感(MIC值下降2倍左右);体外持留菌检测结果显示:毒素蛋白Rel E可促进宿主菌的持留性。4.差异转录组分析结果表明:TA系统可调控宿主菌应激反应、生物膜形成、运动性、耐药性及毒力等相关基因。结论:RA-WH9菌株961质粒上存在新的II型TA系统:Xre-Rel E,原核表达实验结果显示:Xre-Rel E系统可显著影响宿主菌的生长状态及其生存能力。

关键词：鸭疫里默氏杆菌毒素抗毒素系统生物膜功能研究

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结核分枝杆菌毒素Rv2872促进重组菌耐受万古霉素和影响生物膜形成的分子机理

结核分枝杆菌毒素Rv2872促进重组菌耐受万古霉素和影响生物膜形成...

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作者：王小雨西南大学

学位级别：硕士

结核病是由结核分枝杆菌感染导致的一种严重危害公共健康具有高传染性和高死亡率的慢性传染病。近年来出现了越来越多的广泛耐药的结核菌(XDR)、耐多药的结核菌(MDR)、全耐药的结核菌(TDR),使得结核病的防治和治疗更加的困难,于是我们... 详细信息

结核病是由结核分枝杆菌感染导致的一种严重危害公共健康具有高传染性和高死亡率的慢性传染病。近年来出现了越来越多的广泛耐药的结核菌(XDR)、耐多药的结核菌(MDR)、全耐药的结核菌(TDR),使得结核病的防治和治疗更加的困难,于是我们急需探索治疗结核病的新方法,寻找新的治疗结核病的抗生素药物。最早研究人员是在质粒的稳定系统中发现毒素抗毒素系统的。在环境压力条件下,由于基因表达的抑制和蛋白酶的降解作用,不稳定的抗毒素减少,从而产生游离的稳定的毒素蛋白,导致细菌的生长抑制或者死亡。在结核分枝杆菌H37Rv中研究共确定了79对毒素抗毒素系统,VapBC毒素抗毒素系统在结核分枝杆菌中数量最多。毒素蛋白VapC具有核糖核酸酶共有的PIN区域(与PilT N-terminal区域同源),VapB是结构域的抑制剂。VapBC毒素抗毒素系统在结核分枝杆菌中的作用很大程度上是未知的,对结核病研究具有重大的意义。先前研究报道结核分枝杆菌Rv2872具有PIN结构域,是预测的VapC家族的毒素,在多种抗生素环境下上调表达,Rv2872可能与结核分枝杆菌持留和耐药相关并且可能具有RNA酶活性。为了探究Rv2872在结核分枝杆菌中的作用,我们构建了重组耻垢分枝杆菌(MSv2872)和空载菌(MSec)。我们发现过表达Rv2872能够抑制耻垢分枝杆菌的生长。这与我们之前发现的毒素作用是一致的。已有研究发现用不同浓度的万古霉素处理结核分枝杆菌后多个毒素基因上调表达,我们的研究结果证明MSv2872对万古霉素耐受,这说明Rv2872可能通过某些途径调控某些耐药基因的表达从而对万古霉素具有耐受性。先前研究报道万古霉素处理结核分枝杆菌后差异表达的基因包括100多个,我们通过荧光定量PCR检测了其中在耻垢分枝杆菌中具有同源基因的几个基因在重组菌MSv2872和MSec中的表达情况。我们发现Rv2872表达导致MSMEGv0051和MSMEG694两个基因转录水平上调,MSMEG424,MSMEG764,MSMEG979三个基因转录水平下调。之前研究发现MSMEG424,MSMEG764,MSMEG979三个基因在万古霉素处理条件下表现出不同程度的敏感。为了进一步探究MSMEGv0051和MSMEG694这两个基因是否与万古霉素敏感相关,我们构建了这两个基因在耻垢分枝杆菌中的的过表达菌株,用万古霉素处理这些重组菌后,发现这些过表达菌株均对万古霉素有不同程度的耐受。同时我们研究发现MSMEG916是万古霉素耐受基因MSMEG051的转录调控因子,MSMEG916可负调控MSMEG051。纯化的Rv2872毒素蛋白可以直接剪切MSMEG916的RNA,从而下调MSMEG916的转录水平,从而上调MSMEG051的转录水平,导致万古霉素耐受。Rv2872在重组耻垢分枝杆菌中也引起其他显著的表型改变,如改变细胞壁结构、改变体内氨基酸的含量和细菌生物膜的组成等。同时生物膜形成相关基因MSMEG092的RNA也能直接被Rv2872蛋白剪切,引起MSMEG092转录水平的下降,导致MSv2872的生物膜改变。研究发现,Rv2872表型的改变,都可能是由于Rv2872的特异核糖核酸酶活性导致相关基因转录水平的改变。Rv2782在细菌生理、遗传学和发病机制中,作为重要的因子,这种作用与已证明的毒素抗毒素系统的作用功能是一致的。同时我们的研究也第一次报道毒素Rv2872为一种特定序列的核糖核酸酶,涉及抗生素的应激反应和生物膜的形成。针对Rv2872毒素的抑制剂可能是万古霉素和其他针对细胞壁生物合成的抗生素的理想潜在药物。

关键词：结核分枝杆菌毒素抗毒素系统万古霉素

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四对结核分枝杆菌毒素-抗毒素基因功能的初步研究

四对结核分枝杆菌毒素-抗毒素基因功能的初步研究

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作者：刘静仪温州医科大学

学位级别：硕士

目的：　　结核病（Tuberculosis，TB）是由感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）而引起的传染性疾病。结核分枝杆菌具有潜伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的特点，约10％的LTBI患者最终会发展为活动... 详细信息

目的：　　结核病（Tuberculosis，TB）是由感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）而引起的传染性疾病。结核分枝杆菌具有潜伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）的特点，约10％的LTBI患者最终会发展为活动性结核（active tuberculosis）。结核分枝杆菌的潜伏感染是一个复杂的生物学过程，参与产生持留菌的毒素-抗毒素系统（toxin-antitoxin system，TAS）是导致结核分枝杆菌潜伏感染的原因之一。根据前期生物信息学研究发现，结核分枝杆菌“现代”谱系（modern lineage）具有远多于“古老”谱系（ancient lineage）的毒素基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）突变位点，这种基因多态性分布可能是导致结核分枝杆菌“现代”谱系相较于“古老”谱系更适应于不同宿主环境，并在传播力、耐药性等方面得到体现。结核分枝杆菌全基因组上已知有88个假定的TAS，其中有47个VapBC家族的同源位点。本研究选取结核分枝杆菌Ⅱ型毒素-抗毒素系统中的4个 VapBC家族同源位点（ VapBC12、VapBC37、VapBC38、VapBC47）作为研究对象，初步建立筛选有功能的毒素基因的方法，为探讨结核分枝杆菌的传播机制提供新的研究思路。　　方法：　　本实验根据前期生物信息学分析结果，选取结核分枝杆菌Ⅱ型TAS VapBC家族的四对具有一定谱系分化特征及蛋白功能预测的毒素-抗毒素基因（VapBC12、VapBC37、VapBC38、VapBC47）作为研究对象。首先，将 VapC毒素基因分别克隆入阿拉伯糖诱导质粒 pBAD33，构建了毒素基因在大肠杆菌(Escherichia coli,***)中的诱导表达体系;之后，将VapC毒素基因分别克隆入乙酰胺诱导的穿梭质粒pACE，构建毒素基因在耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,M. smegmatis）中的诱导表达体系;观察VapC毒素基因对两种不同细菌的生长是否具有抑制作用，同时构建VapB抗毒素基因在***与M. smegmatis的诱导表达体系，观察其对同源VapC毒素基因可能的抑菌作用是否存在消除抑制的功能。最后，对验证为具有毒素功能的VapC37构建原核表达与纯化体系，为进一步的体外生物学功能验证建立基础。　　结果：　　1.所选取的四个VapC基因仅VapC37（Rv2103c）在大肠杆菌中表现为可见的抑菌作用，同源的VapB37（Rv2104c）抗毒素基因具有消除其抑菌作用的抗毒素功能。　　2.所选取的四个VapC基因仅VapC37（Rv2103c）在耻垢分枝杆菌中表达为明显的抑制生长作用，同源抗毒素基因VapB37(Rv2103c)具有对此种生长抑制的中和作用。并且，所选毒素基因与抗毒素基因在大肠杆菌中的克隆表达结果同耻垢分枝杆菌中的实验结果一致。　　3.对以上不同菌种中均表现为功能性的毒素基因VapC37构建原核表达质粒，优化其诱导表达与纯化方案，目的蛋白最终以包涵体蛋白的形式由亲和层析的方法完成纯化，之后通过复性与透析处理，得到了较高纯度与浓度的可溶性目的蛋白。4.对前期生物信息学分析所得SNP筛选TAS相关突变位点进行非同义突变预测，所得结果表明我国广泛流行的北京谱系具有较多的TAS，同时 VapC37在北京谱系中具有更多的有功能的SNP位点，这可能间接导致该谱系具有较强的传播力与致病性。　　结论：　　结核分枝杆菌全基因组88个假定的TAS中，国外有报道78个毒素基因已在耻垢分枝杆菌中克隆并表达，其中30个被确认为功能性TAS;另有30个公认的结核分枝杆菌 TAS在大肠杆菌中表达为有功能的TAS。本实验中， VapC12（Rv1720c）在大肠杆菌的毒素验证实验中，表现为无毒素作用，与已有实验报道结果相符，其余3个毒素基因无相关实验结果;VapC37（Rv2103c）在耻垢分枝杆菌中验证为具有毒素功能，VapC12（Rv1720c）、VapC38(Rv2494)在耻垢分枝杆菌中验证为无毒素功能，与已有实验报道结果一致，但是VapC47（Rv3408）在已有报道中具有毒素功能，这种差异也有报道存在于MazEF同源家族。综上所述，为了继续研究北京谱系的广泛流行与毒素抗毒素系统是否存在联系，我们需要对已知为功能性TAS的再次鉴定。

关键词：结核分枝杆菌毒素抗毒素系统基因功能结核病传播机制

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结核分枝杆菌抗毒素higA的原核表达及多克隆抗体制备

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细胞与分子免疫学杂志 2015年第7期31卷 972-976,981页

作者：刘丹伊正君付玉荣李书轻杨珊珊潍坊医学院临床检验诊断学教研室山东潍坊261053 潍坊医学院附属医院检验科山东省临床检验诊断学高校重点实验室山东潍坊261031 潍坊医学院基础医学院病原生物学教研室山东潍坊261053 菏泽市第三人民医院检验科山东菏泽274031 中国人民解放军第401医院检验科山东青岛266000

目的克隆编码结核分枝杆菌抗毒素基因hig A并在大肠杆菌中表达,纯化hig A蛋白后,制备兔抗hig A的多克隆抗体。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增hig A基因;构建重组表达质粒p ET-32a(+)-hig A;筛选出阳性重组质粒后,转化大肠... 详细信息

目的克隆编码结核分枝杆菌抗毒素基因hig A并在大肠杆菌中表达,纯化hig A蛋白后,制备兔抗hig A的多克隆抗体。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增hig A基因;构建重组表达质粒p ET-32a(+)-hig A;筛选出阳性重组质粒后,转化大肠杆菌BL21,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western blot法鉴定目的蛋白的表达;以纯化的hig A蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗hig A的多克隆抗体并进行效价及特异性鉴定。结果成功扩增出了hig A基因,克隆于载体p ET-32a(+)质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后能成功诱导hig A蛋白[相对分子质量(Mr)36 630]的表达;利用纯化的hig A蛋白免疫新西兰大白兔后,能有效地刺激特异性hig A抗体的产生,抗体的效价达到1∶3200以上。结论成功在大肠杆菌中表达出hig A蛋白,并制备出效价及特异性良好的兔抗hig A多克隆抗体。

关键词：结核分枝杆菌毒素抗毒素系统 higA 多克隆抗体

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Nat Microbiol:科学家开发出抵御细菌感染的新疗法

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现代生物医学进展 2016年第9期 1803-1804页

在细菌中,毒素抗毒素系统包含着两个相互关联的基因,基因其位于相同的染色体上,其可以编码一种毒性蛋白和中和毒性的解毒蛋白;正常情况下,抗毒素蛋白会结合毒性蛋白并且抑制其发挥作用,但对环境压力产生反应时,抗毒素蛋白就会破碎,从而... 详细信息

在细菌中,毒素抗毒素系统包含着两个相互关联的基因,基因其位于相同的染色体上,其可以编码一种毒性蛋白和中和毒性的解毒蛋白;正常情况下,抗毒素蛋白会结合毒性蛋白并且抑制其发挥作用,但对环境压力产生反应时,抗毒素蛋白就会破碎,从而就使得细胞出现毒性作用。近日刊登于国际杂志Nature Microbiology上的一篇研究报告中,来自日内瓦大学的研究人员就对毒

关键词：细菌感染疗法 Nat Microbiol 毒素-抗毒素系统毒素抗毒素系统

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结核分枝杆菌中毒素-抗毒素系统的鉴定

结核分枝杆菌中毒素-抗毒素系统的鉴定

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作者：贤一博北京师范大学

学位级别：硕士

在饥饿和低氧等应激条件下,结核分枝杆菌可以自发的产生生长停滞,进入不增殖的持留状态,形成相当长的临床潜伏期。现有的抗结核药物不能快速有效地消灭持留结核分枝杆菌,而当机体免疫力下降(如营养不良、应用皮质激素或HIV感染等),持留... 详细信息

在饥饿和低氧等应激条件下,结核分枝杆菌可以自发的产生生长停滞,进入不增殖的持留状态,形成相当长的临床潜伏期。现有的抗结核药物不能快速有效地消灭持留结核分枝杆菌,而当机体免疫力下降(如营养不良、应用皮质激素或HIV感染等),持留结核分枝杆菌可以重新增殖,造成临床结核病的发生。目前人们对结核分枝杆菌持留现象产生的分子机制的认识还十分有限。近几年对细菌基因组上毒素-抗毒素系统的研究发现,该系统的多个家族在应激条件下(营养匮乏、抗生素药物等逆境条件)可以介导细菌的生长抑制,导致细菌的生长停滞。MazEF系统是在大肠杆菌染色体发现的第一个毒素一抗毒素系统,由两个可以共表达的抗毒素蛋白MazE和毒素蛋白MazF组成。MazF是一个具有序列特异性的核糖核酸内切酶,通过切割mRNA来调控细菌的生长。MazF同源蛋白广泛地存在于细菌中,构成一个新的蛋白家族被称为mRNA Interferase。\n 序列同源性分析表明,结核分枝杆菌H37Rv基因组含有38个可能的毒素-抗毒素位点,其中有九个是编码MazF同源蛋白的基因。这些同源基因分别与其上游相邻的基因,组成类似毒素-抗毒素系统的结构。我们主要鉴定了其中6个可能的MazF同源蛋白,和另外一个被命名为PemK的MazF同源蛋白。研究结果表明,MazF同源蛋白Rv1942c、Rv0659c、Rv1495对大肠杆菌和耻垢分枝杆菌的正常生长均无明显的影响作用,同时也不具备切割RNA的能力,因此它们不与其上游基因构成毒素.抗毒素系统;另外三种MazF同源蛋白Rv1102c、Rv1991c和Rv2801c在大肠杆菌中和耻垢分枝杆菌中都具有抑制细菌生长和生存的作用,并且毒素蛋白的毒性作用能够被其相应的抗毒素蛋白解除,这表明Rv1103c-Rv1102c、Rv1991a-Rv1991c和Rv2801a-Rv2801c是结核分枝杆菌基因组上的毒素-抗毒素系统,研究进一步证实这些系统中的毒素蛋白Rv1102c、Rv1991c和Rv2801c均通过切割RNA的机制发挥作用;另外,结核分枝杆菌PemK-PemI系统也被证实是毒素-抗毒素系统,即毒素蛋白PernK能够抑制大肠杆菌和耻垢分枝杆菌的生长或生存,同时表达抗毒素蛋白PemI能够解除此种抑菌或杀菌作用,但毒素蛋白PemK不具有切割RNA的活性,具体作用机制目前还不清楚。对上述七个系统的启动子活性测定结果表明,在正常生存环境下只有Rv2801c、Rv1991c和Rv0659c的启动子序列(分别记作P2801c、P1991c和P0659c)有活性,其中P2801c活性很高,其他四个系统Rv1942c、Rv1495、Rv1102c和PemK的启动子(分别记作P1942c、P1495、P1102c和PPemK)没有明显的活性。\n 我们进一步对Rv2801a-Rv2801c毒素-抗毒素系统进行了研究。在耻垢分枝杆菌中诱导表达毒素蛋白Rv2801c,随诱导时间的延长,活菌数Cfu显著下降,而及时诱导表达抗毒素蛋白Rv2801a可以在一定程度上恢复细菌的生长,使活菌数明显增加,这表明Rv2801c的抑制作用在一定时间内是可逆的,其对细菌生长的调节作用是抑菌而不是杀菌。抗毒素蛋白Rv2801a可以与毒素蛋白Rv2801c结合形成复合物,从而抑制Rv2801c切割RNA活性,消除Rv2801c对细菌生长的影响。在完全饥饿的情况下Rv2801a-Rv2801c系统的启动子活性显著增强,表明该系统可能与应激条件下生长调控相关,但这种启动子活性变化不依赖于Re1A模拟的营养匮乏,DosR模拟的缺氧应激以及D,L-正缬氨酸诱发的氨基酸缺乏,具体原因还有待深入研究。\n 本实验将毒素-抗毒素系统的研究拓展到结核分枝杆菌这一重要的病原菌,鉴定结核分枝杆菌中的毒素-抗毒素系统,阐明结核分枝杆菌中毒素-抗毒素系统的调控机理,这将有助于进一步了解结核分枝杆菌持留现象产生的分子机制,并为相关疾病的防治提供新的线索。

关键词：结核分枝杆菌毒素抗毒素系统 MazF同源蛋白持留状态序列同源性

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结核分枝杆菌毒素蛋白higB的原核表达及分析

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潍坊医学院学报 2015年第4期37卷 246-249页

作者：刘丹伊正君付玉荣李书轻杨珊珊潍坊医学院临床检验诊断学教研室山东潍坊261053 潍坊医学院附属医院检验科潍坊医学院病原生物学教研室菏泽市第三人民医院检验科中国人民解放军第401医院检验科

目的克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a(+)-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot... 详细信息

目的克隆编码结核分枝杆菌毒素基因higB并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增higB基因;构建重组表达质粒pET-32a(+)-higB;筛选出阳性重组质粒后转化大肠杆菌,诱导目的蛋白表达;利用SDS-PAGE与Western-blot鉴定目的蛋白的表达。结果成功扩增出了higB基因,克隆于载体pET-32a(+)质粒中,PCR筛选和酶切鉴定获得阳性克隆,测序证实正确;转化大肠杆菌BL21后higB蛋白没有发生表达。结论已成功构建结核分枝杆菌毒素基因higB的原核表达栽体,但大肠杆菌BL21不能表达出higB蛋白。

关键词：结核分枝杆菌毒素抗毒素系统蛋白表达

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加氏乳杆菌JDM511安全性分析

加氏乳杆菌JDM511安全性分析

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作者：叶露上海交通大学

学位级别：硕士

随着人们生活水平的提高,食品安全问题成为了热点民生话题,也有越来越多的科学研究涉足相关领域。食品安全是一个跨越多学科的科学问题,是保证人类生存质量和健康的重要议题。目前不管是国内还是国外,都有许多相关的保障政策或法律法规... 详细信息

随着人们生活水平的提高,食品安全问题成为了热点民生话题,也有越来越多的科学研究涉足相关领域。食品安全是一个跨越多学科的科学问题,是保证人类生存质量和健康的重要议题。目前不管是国内还是国外,都有许多相关的保障政策或法律法规。本文第一部分中,首先采用了454高通量焦磷酸测序技术对加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)JDM511进行了全基因组测序。加氏乳杆菌JDM511的基因组包括一个大小为1,788,466bp的环状染色体,一个大小为39,184bp的小质粒和一个大小为93,309bp的大质粒。染色体的GC含量为35.06%,共有1705个蛋白编码基因,66个t RNA和3套r RNA操纵子。与已完成测序的加氏乳杆菌ATCC33323相比较,JDM511的基因组略小,编码的蛋白量也少。JDM511中总预测蛋白的12%的蛋白被归类为碳水化合物代谢和转运相关蛋白。通过研究发现基因组上存在18个编码糖苷水解酶的基因,包括葡萄糖苷酶、淀粉酶、半乳糖酶和麦芽糖酶。其次,本研究采用已经得到的全基因组测序信息,结合传统的表型实验,对菌株进行了安全性评估。表型实验中,首先利用E-test的方法检测了16种常见抗生素对JDM511的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示:阿米卡星、杆菌肽、环丙沙星、链霉素和万古霉素的MIC都超过了试纸的最大检测范围,表明JDM511对其有较高程度的耐药性;JDM511对四环素、庆大霉素和利福平有中等程度的耐药性;对其余抗生素:头孢噻肟、阿莫西林、氨苄西林、甲基苄胺嘧啶、头孢噻吩、亚胺培南、红霉素和氯霉素则表现敏感。JDM511的抗生素表型结果符合乳杆菌的耐药谱。其次,利用添加前体氨基酸的平板观察JDM511对生物胺的合成能力。结果表明JDM511不具有产生组胺、腐胺、尸胺、精胺、色胺和酪胺的能力。通过对基因组的搜索后发现,其基因组中也不含有除乙酰辅酶A脱羧酶以外的氨基酸脱羧酶编码基因,再一次验证了其不含有产生生物胺的能力。将JDM511的全基因组信息与抗生素耐药基因数据库(ARDB)、致病因子数据库(VFDB)和已知的有害代谢产物相关基因进行比对,发现了43个抗生素耐药相关基因,152个潜在致病因子和11个与有害代谢产物相关的基因。JDM511的全基因组不含有完整的前噬菌体,仅存在1个可能的噬菌体相关片段、1个可能的CRISPR重复序列和9个插入序列。虽然在JDM511的基因组上发现了多种抗生素耐药性基因、致病因子和有害代谢产物相关基因,但其并不含有侵袭性致病因子和高毒性蛋白编码基因,这些安全性相关基因也不存在于可移动元件上。本研究采取了将传统表型试验与基因组学相结合的方法对一株加氏乳杆菌进行了安全性评估。相较于传统方法,这种结合的方法更为全面,可以最大程度地揭示菌株的潜在安全性和相关的分子机制,为菌株的安全应用、功能研究和后续研究提供了基础和证据。本文的第二部分验证了Clp蛋白酶可降解抗毒素蛋白812,表明其参与长双歧杆菌JDM301Ⅱ型毒素-抗毒素系统的激活,毒素-抗毒素系统对调节细菌的生长具有重要作用。本文的第三部分对上海市区内出售的大米样本进行黄曲霉素B1含量的测定,并分析不同样本黄曲霉素B1含量的差别。黄曲霉素是黄曲霉、寄生曲霉、黑曲霉等真菌所产生的具有生物活性的次级代谢产物。实验结果表明市场上大米黄曲霉素含量总体较低,情况良好。东北地区的大米黄曲霉素含量高于苏北大米。散装粮食店来源的大米与大型超市来源大米含量存在差异。且散装店和中型超市中购买的样品中出现黄曲霉素含量不合格样品。

关键词：乳杆菌益生菌基因组焦磷酸测序黄曲霉素毒素抗毒素系统

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球形芽胞杆菌C3-41中毒素抗毒素体系的研究

球形芽胞杆菌C3-41中毒素抗毒素体系的研究

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作者：乔永超中国科学院研究生院

学位级别：硕士

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TA)由两个共表达的基因组成,其中一个基因编码不稳定的抗毒素蛋白,另一个基因编码稳定的毒素蛋白.毒素-抗毒素系统最早发现于一些低拷贝的质粒,用来维持低拷贝质粒在菌群中的稳定存在.随后发现... 详细信息

毒素-抗毒素系统(toxin-antitoxin system,TA)由两个共表达的基因组成,其中一个基因编码不稳定的抗毒素蛋白,另一个基因编码稳定的毒素蛋白.毒素-抗毒素系统最早发现于一些低拷贝的质粒,用来维持低拷贝质粒在菌群中的稳定存在.随后发现毒素抗毒素体系普遍存在于很多原核生物,是原核生物调节自身生理功能的一种特有的体系,但是对于球形芽胞杆菌(Bacillus sphaericus,B.s)还没有人做过.对球形芽胞杆菌中毒素抗毒素系统的研究,有助于充分的了解TA体系在芽胞杆菌中的作用机理.\n 本课题通过对球形芽胞杆菌菌群中进行毒素抗毒素基因的检测,并选择有代表性的菌株进行PCR扩增、测序,并构建进化图,查看毒素-抗毒素基因在球形芽胞杆菌中的进化情况.结果表明,TA体系普遍存在于球形芽胞杆菌中,并且有毒菌株比起无毒菌株相对保守.另外,构建毒素基因和抗毒素基因的表达载体,转化大肠杆菌BL21,分析毒素蛋白和抗毒素蛋白对原核生物(大肠杆菌)生长状况的影响.结果显示,毒素蛋白能够很大程度上抑制大肠杆菌的生长.再者,表达毒素和抗毒素蛋白,并且纯化、透析得到活性的蛋白.利用活性的蛋白进行MTT试验,分析它对真核细胞(Vero和BHK)生长的影响,结果表明,纯化的有活性的毒素蛋白对真核细胞的生长影响不大.为了分析野生菌球形芽胞杆菌C3-41中毒素蛋白和抗毒素蛋白的表达情况,用纯化的蛋白制得的抗体进行Western Blotting检测,发现在野生菌中任何时间段毒素蛋白和抗毒素蛋白表达量及其低或者没有表达.同时,用同源重组的方式构建了抗毒素基因敲除菌株,并比较了它在抗性LB和无抗性LB中的生长曲线,和野生型B.s.C3-41相比,发现没有多大的变化,用Western blotting检测了不同时间段的毒素蛋白的表达,没有发现毒素蛋白的表达.\n 本研究是第一次对球形芽胞杆菌的TA体系进行研究.通过检测确定了球形芽胞杆菌中普遍存在毒素抗毒素体系.并通过异源表达、纯化B.s.C3-41的毒素蛋白,检测到它对真核细胞的生长没有多大的影响.构建的抗毒素基因缺失菌株也没有对它的生长有明显的影响.本研究对球形芽胞杆菌中的TA体系有了初步的认识,为进一步的研究提供理论数据.

关键词：球形芽胞杆菌毒素抗毒素系统作用机理基因检测

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