检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：吴桂春南京农业大学

学位级别：博士

由黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae ***,Xoo）引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产上一种重要的细菌病害,该病害的流行会造成水稻产量损失达10-20%,严重时达50%以上,甚至绝产。水稻白叶枯病菌通过水孔或者伤口侵入,在水稻维管... 详细信息

由黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae ***,Xoo）引起的水稻白叶枯病是世界水稻生产上一种重要的细菌病害,该病害的流行会造成水稻产量损失达10-20%,严重时达50%以上,甚至绝产。水稻白叶枯病菌通过水孔或者伤口侵入,在水稻维管束中吸收营养、扩散增殖并产生大量胞外多糖使维管束堵塞,从而导致叶片产生黄褐色或者灰白色的病斑。大量研究表明,水稻白叶枯病菌的侵染致病过程高度依赖其蛋白质外泌系统的运转和致病相关基因的表达,其中,Ⅱ型分泌系统及其分泌的胞外酶、Ⅲ型分泌系统及其分泌的效应因子以及Ⅴ型分泌系统及其分泌的粘附因子等都已经被证实对提升Xoo的毒性具有重要作用。另外,越来越多的高通量组学研究发现一些重要的致病相关基因在Xoo与水稻的互作系统中被诱导表达,它们的功能与Xoo在水稻上的生存繁殖以及毒性因子的合成密切相关。对于Xoo的蛋白质外泌系统,本实验室在前期研究中发现突变Xo0细胞内膜上的双精氨酸转运（Tat）系统（twin-arginine translocation system）会显著降低Xoo的毒性,然而Tat系统调控Xoo毒性的分子机制尚未被完全阐明。对于Xoo中受寄主诱导表达的毒性因子,本实验室利用蛋白质组学方法在Xoo--水稻的互作系统中发现了一个受寄主诱导表达的毒性因子xanA,然而xanA受寄主诱导表达并调控Xoo毒性的分子机制仍缺乏深入的研究。基于以上研究背景,本文的研究目的在于解析Tat系统及其底物蛋白是如何影响Xoo的致病性的,同时探究Xoo中xanA受寄主诱导表达并调控Xoo致病性的初步机制。（1）我们以水稻白叶枯病菌PXO99A为研究对象,通过分析胞外比较蛋白组学数据（PXO99A-VS-ΔtatC）,筛选出10个在ΔtatC胞外含量下降5倍以上的TDTPs蛋白（Tat-dependent translocation proteins）。同时采用已报道的 PRED-TAT、TATFIND V1.4和TatP V1.0三种Tat底物预测程序分析了 PXO99A基因组,共预测鉴定出77个TDTPs。蛋白功能注释表明这87个TDTPs广泛地参与了 PXO99A的氧化还原反应、离子的摄取与平衡、碳源的转运与代谢、细胞膜的合成和环境适应等生命活动进程。后续对其中15个TDTPs进行系统突变和致病相关表型分析发现PXO02203、PXO 03477和PXO02523为新的毒性基因,同时发现多个TDTPs在PXO99A的侵染致病、毒性因子表达和逆境适应中扮演重要角色,这些结果暗示Tat系统可能通过控制不同TDTPs的生物学行为来影响病原菌的毒性和逆境适应能力。（2）首先,我们利用免疫印迹、荧光定量和GUS组织化学染色方法证实了 xanA是一个在水稻体外互作系统和水稻体内均能被诱导表达的毒性基因,通过XanA蛋白的原核表达和生化功能分析,我们证明了 XanA在Xoo中具有葡萄糖磷酸变位酶活性,它能够调节Xoo中1磷酸葡萄糖和6磷酸葡萄糖的动态平衡。多组学联用和致病表型分析发现xanA主要通过影响Xoo的碳源利用、EPS合成、生物膜形成、鞭毛运动和趋化性来调控致病性,FruA、CheY和FlhF可能是介导这种调控机制的关键因子。另外,细菌单杂交和基因表达分析结果表明,水稻中大量存在的木糖、半乳糖等碳源能够不同程度地诱导xanA的表达,同时xanA基因本身还受PXO06036等AraC家族转录因子的调控,这些结果暗示AraC家族转录因子可能在xanA调控致病性和受寄主诱导表达的过程中扮演重要角色。总之,本研究鉴定了 Xoo中15个依赖Tat系统转运的蛋白并评估了它们的致病相关生物学功能,揭示了 Tat系统调控Xoo毒性和逆境适应能力的可能工作机制。另外,通过致病表型分析和组学研究揭示了xanA在调控Xoo致病性和致病因子合成方面的新机制,同时,初步探明水稻中存在的碳源是诱导xanA表达的主要原因,多种AraC家族转录因子对xanA基因的表达具有调控作用。该研究结果丰富了水稻白叶枯病菌致病机制和互作机制研究的理论内涵,为通过阻断这种致病途径实现水稻白叶枯病的科学防控提供了理论依据和新的策略。

关键词：水稻白叶枯病菌受寄主诱导 xanA基因 AraC家族转录因子 Tat系统底物蛋白致病机制

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水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae ***）对链霉素和噻枯唑的抗药性监测和抗药性机制研究

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae ***）对链霉素和噻枯唑的抗...

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作者：徐颖南京农业大学

学位级别：博士

水稻白叶枯病是水稻上的重要病害之一。噻枯唑和链霉素是我国防治水稻白叶枯病最主要的两种药剂,这两种药剂在我国的使用历史均在三十年以上,开展抗药性监测工作和抗药性机制研究十分必要。本论文围绕上述目的进行了以下研究：(1)水稻... 详细信息

水稻白叶枯病是水稻上的重要病害之一。噻枯唑和链霉素是我国防治水稻白叶枯病最主要的两种药剂,这两种药剂在我国的使用历史均在三十年以上,开展抗药性监测工作和抗药性机制研究十分必要。本论文围绕上述目的进行了以下研究：(1)水稻白叶枯病菌实验室链霉素抗性菌株的诱导及其抗药性分子机制和风险研究；(2)水稻白叶枯和细菌性条斑病菌对链霉素田间抗药性监测；(3)水稻白叶枯病菌链霉素田间抗性菌株的抗性分子机制研究；(4)水稻白叶枯病菌对噻枯唑抗药性机制的初步研究；(5)水稻白叶枯病菌对噻枯唑田间抗药性监测。 1.水稻白叶枯病菌实验室链霉素抗性菌株的诱导及其抗药性分子机制和风险研究通过紫外光照射诱变获得了6株水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)链霉素抗药性突变体。链霉素对水稻白叶枯病菌敏感菌株ZJ173及其抗性突变体的最低抑制浓度(minimal inhibition concentration, MIC)分别为0.10μg/mL和600μg/mL；对敏感菌株ZJ173的有效中浓度(medium effective concentration, EC50)为0.03μg/mL,对抗性菌株的平均EC50为11.64(3.15-23.75)μg/mL,平均抗性倍数(resistance factor,抗药性突变体与敏感菌株的EC50的比值)为388倍。通过PCR扩增检测了可能会引起链霉素抗药性的基因,包括rpsL基因(编码S12蛋白)、rrs基因(编码16S rRNA)和strA基因(编码氨基糖苷-3-磷酸转移酶),测序结果表明被测的5株抗性菌株的rpsL基因均发生了突变,其中4株在43位(Lys→Arg)发生了突变,另外1株在88位(Lys→Arg)发生了突变；rrs基因与敏感菌株相比未发生突变,也未检测到strA基因。上述结果表明实验室诱变的水稻白叶枯病菌抗性菌株对链霉素的抗药性可能是由rpsL基因突变引起的。研究结果还表明抗性突变体的抗药性在无药剂压力下可稳定保持,致病性、生长速率与敏感菌株无明显差异,竞争性低于或略低于敏感菌株,抗药性自发突变率较高,且抗性突变为单一位点突变,病害循环为多循环,因此这一类型抗性突变体的抗药性风险较高。 2.水稻白叶枯和细菌性条斑病菌对链霉素田间抗药性监测本研究于2007-2008年从我国水稻主产区采集了534株水稻白叶枯菌株和827株水稻细菌性条斑菌株,并测定了它们对链霉素的敏感性。发现4株来自云南思茅普洱县的水稻白叶枯菌株对链霉素具有抗药性,占测定菌株的0.75%,平均抗药性倍数为226倍。本研究首次报道了水稻白叶枯病菌田间抗性菌株的存在。除了这4株高水平抗药性菌株外,来自云南的水稻白叶枯病菌中还存在敏感性显著降低的群体-亚敏感群体。对水稻细菌性条斑病菌的抗药性监测中未发现敏感性下降的菌株。 3.水稻白叶枯病菌链霉素田间抗性菌株的抗性分子机制研究已知在其它植物、动物或人类病原细菌中引起链霉素抗药性的的分子机制主要有rpsL(编码S12蛋白)和rrS(编码16S rRNA)基因突变以及strA-strB基因和aadAl基因的存在。本研究通过PCR扩增和基因测序,比较了抗性和敏感菌株的上述基因,发现抗性菌株的rpsL和rrS基因并未发生突变,也未发现strA基因的存在,而4株水稻白叶枯病菌链霉素田间抗性菌株中均含有Ⅰ型整合酶基因intⅠ和编码链霉素修饰酶的基因-氨基糖苷-3-羟基腺苷转移酶基因aadAl,而这两个基因在ZJ173和24个随机选取的田间敏感菌株中均不能扩增得到,这一结果表明4株抗性菌株的链霉素抗药性是整合子中的aadAl基因导致的。本研究首次报道了植物病原细菌中抗药性整合子的存在。对4株抗性菌株NA7-1、YNA10-2、YNA11-2、YNA12-2的整合子序列进行了扩增,分别得到4041、3173、3801、3251bp的扩增产物,之后对它们进行了基因测序和比对分析。同时对4株抗性菌株采用药敏纸片扩散法和最低抑制浓度法(MIC)对多种抗生素的抗药性进行了检测。结果表明,YNA7-1和YNA11-2的整合子中含有按如下顺序排列的基因盒：aac(6')-Ⅱ-arr-3-aadA1,其中aac(6)-Ⅱ编码对妥布霉素、庆大霉素、奈替米星和卡那霉素的抗药性,arr-3编码对利福平的抗药性,aadAl编码对链霉素和壮观霉素的抗药性；相比于YNA7-1,YNA10-2缺失了aac(6)-Ⅱ,只含有arr-3-aadA 1基因盒；YNA12-2缺失了包含部分intⅠ基因的550bp的中间序列,其整合子中仍含aac(6')-Ⅱ-arr-3-aadA1基因盒。除YNA7-1和YNA12-2未

关键词：水稻白叶枯病菌链霉素噻枯唑抗药性监测整合子

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水稻白叶枯病菌无毒新基因的功能鉴定以及Quorum Sensing相关基因的克隆和表达

水稻白叶枯病菌无毒新基因的功能鉴定以及Quorum Sensing相关基因...

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作者：梁斌复旦大学

学位级别：博士

1.用 IS-PCR 和 rep-PCR 法分析了 17 份分离自云南滇西高原粳稻区的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae )和 7 个其它地区的水稻白叶枯病菌的群体遗传多样性。 2 个适合中国水稻白叶枯病菌的引物 J3 和 ERIC 对这 24 个菌... 详细信息

1.用 IS-PCR 和 rep-PCR 法分析了 17 份分离自云南滇西高原粳稻区的水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae )和 7 个其它地区的水稻白叶枯病菌的群体遗传多样性。 2 个适合中国水稻白叶枯病菌的引物 J3 和 ERIC 对这 24 个菌系基因组 DNA 进行 PCR 扩增反应, J3 引物有 14 条条带,ERIC 引物有 13 条条带,2 个引物呈现 18 种谱型。用 PHYLIP Version 3.6 软件 UPGMA 聚类分析法分析白叶枯病菌系之间的遗传距离, 可将 24 个病原菌分为 4 簇,3 个来自菲律宾的白叶枯病菌与中国的菌系距离较远,云南高原粳稻区分离的菌系十分复杂,4 个簇中都有,但主要集中在两个簇中,共有 14 个菌系。 2.菲律宾白叶枯病菌株 PXO339 是 9a 生理小种的代表菌株,它对 Xa7,Xa4,Xa10 和 Xa14 等抗病基因表现毒性,而对隐性抗病基因 xa5 表现无毒。从 PXO339 中克隆到一个新的无毒基因,全长 2118bp, 编码 705 个氨基酸,分子量和等电点分别为 74.7 kDa 和 6.585。NCBI 网站 BLAST 表明,该基因属于 AvrBs3 基因家族,命名为 arp3(AvrBs3 related protein)。与所有 AvrBs3 基因家族成员的基因序列Alignment 分析发现,Arp3的N-端缺少了两个长度分别是144bp 和 45bp 的片断。进一步研究发现,在水稻白叶枯病菌中,Arp3N-端的特征很普遍,都缺少这两个片断。全长的 arp3 基因中间序列是一个特异的 5.5 次 102 bp 的重复区(Repeats),是目前已经克隆的 AvrBs3 基因家族所有成员中重复次数最少的一个。C-端有 3 个核定位信号(Nuclear localization signals, NLSs)和 1 个酸性转录激活域(Acidic transcriptional activation domain, AAD)。核定位信号对无毒蛋白进入植物细胞核是必要的,缺少了核定位信号或者酸性转录激活域,无毒蛋白会失去毒性。由此推测,AvrBs3 相似蛋白是一个组装的蛋白,是病原细菌和植物长期互相竞争中形成的。中间的重复区,是无毒蛋白的基本功能域,N- 端和 C-端结构是无毒蛋白用来武装自己,使自己能顺利从细菌内分泌出去,到达植物细胞并表现正常功能。 Southern 分析发现该基因在 PXO339 基因组中单拷贝存在,而且只位于 PXO339 的质粒 DNA 上,推测它可能是一个候选的 avrxa5 基因。利用 pGEX-4T-1 原核表达载体,构建 pGEX-4T-1-Arp3 融合表达蛋白,Western 分析表明,Arp3 能正常表达,表达的融合蛋白大小为 128 kDa。融合表达载体通过电击转化到毒性很强的菲律宾白叶枯病菌株 PXO99,剪叶接种含有 xa5 抗病基因的水稻近等基因系材料 IRBB5。与对照(接种 PXO99)相比,接种 PXO99::pGEX-4T-1-Arp3 的 IRBB5 没有明显地表现为抗病,只是比对照的病情稍轻,但是表现为感病。 I 复旦大学博士学位论文水稻白叶枯病菌无毒新基因的功能鉴定以及 Quorum Sensing 相关基因的克隆和表达因此,arp3 基因可能是一个候选的 avrxa5 基因。 3.从白叶枯病菌中克隆到两个 Quorum Sensing (QS)相关的同源基因。xooR 是一个转录因子,全长 765 bp;相邻的 amino acid transporter(aat)基因是一个跨膜蛋白,全长 1377bp。Southern

关键词：水稻白叶枯病菌遗传多样性无毒基因 AvrBs3 相似蛋白 Quorum Sensing 转录因子氨基酸转运子

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水稻白叶枯病菌北方菌株遗传多样性rep-PCR分析

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江西农业大学学报 2011年第3期33卷 482-487页

作者：阙海勇陈华民吴茂森何晨阳江西出入境检验检疫局综合技术中心江西南昌330002 中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193 江西农业大学农学院江西南昌330045

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)北方菌株的遗传结构组成,利用rep-PCR技术对103个从辽宁、吉林、河北、山东稻区采集的Xoo菌株、9个标准小种(R1-R9)代表菌株和13个水稻细菌性条斑病菌(*** ***,Xoc)菌株进行了遗传... 详细信息

为了揭示水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)北方菌株的遗传结构组成,利用rep-PCR技术对103个从辽宁、吉林、河北、山东稻区采集的Xoo菌株、9个标准小种(R1-R9)代表菌株和13个水稻细菌性条斑病菌(*** ***,Xoc)菌株进行了遗传多样性分析。结果表明,ERIC-PCR和BOX-PCR分析均能较好地揭示出测试菌株的遗传多态性,分别获得了84种和90种分子谱型;在相似系数为70%时,ERIC-PCR将所有测试菌株聚类为17个簇群,其中1个为优势簇群;BOX-PCR将测试菌株聚类为10个簇群,其中2个为优势簇群。在相似系数为50%时,Xoo与Xoc测试菌株分别聚类为2个不同的簇群。

关键词：水稻白叶枯病菌 rep-PCR 分子谱型簇群

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水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号蛋白基因PXO01021功能的初步研究

水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号蛋白基因PXO01021功能的初步研究

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作者：霍欢中国农业科学院

学位级别：硕士

由水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，简称Xoo）引起的水稻白叶枯病是世界上最重要的水稻细菌性病害之一。在与水稻互作过程中，Xoo通过一系列的信号调控系统对寄主植物的侵染过程进行分子和细胞等水平上的调... 详细信息

由水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，简称Xoo）引起的水稻白叶枯病是世界上最重要的水稻细菌性病害之一。在与水稻互作过程中，Xoo通过一系列的信号调控系统对寄主植物的侵染过程进行分子和细胞等水平上的调控。环鸟苷二磷酸（c-di-GMP）是在细菌中新发现的、新型的第二信使，与细菌的多种生物学性状（如毒性、致病性）的调控有关。在Xoo基因组中含有多个与c-di-GMP代谢（合成和降解）相关的基因，PXO01021就是其中一个含有与c-di-GMP代谢相关的GGDEF和EAL保守结构域的基因，另外它还含有信号接收结构域PAS。但至今尚不清楚其功能、表达与调控。本研究对该基因的功能及其可能感应接受的外源信号分子开展了相关研究，主要结果如下：（1）利用同源置换方法，构建了该基因的缺失突变体ΔPXO01021，进行了突变体致病性、生物膜形成、运动性、致敏性等生物表型的检测。与野生型菌株PXO99A相比，ΔPXO01021突变体致病性明显增強，生物膜形成能力减弱，运动性以及对烟草致敏性无明显变化，基因互补可以使突变体表型部分恢复到与野生型相同。（2）利用RT-qPCR方法，检测了PXO01021基因在不同离体培养条件（模拟水稻维管束组织环境：低氧和中性偏酸，及不同铜离子浓度）下的转录动态。发现PXO01021的表达明显地受到氧（O2）浓度的影响。 pH值并不影响PXO01021的表达。在有Cu2+存在的生长条件情况下，PXO01021表达明显上调，并在一定范围内具有剂量效应。（3）为了分析PXO01021基因启动子活性及其对外界信号分子的感应，构建了该基因启动子PXO01021-p::gfp的载体，并将其导入Xoo野生型菌株PXO99A感受态细胞中，可定性地观察到GFP绿色荧光，但不够定量检测。说明该启动子虽然具有活性，但需要进一步优化定量分析条件。（4）对PXO01021/PXO01020/PXO01019/PXO01018基因簇进行转录分析，其中PXO01021和PXO01018的转录方向是一致的，且是单个基因转录， PXO01019和PXO01020的转录方向一致，且是共转录单元。总之，本研究从Xoo中成功克隆到c-di-GMP信号蛋白PXO01021基因，并构建了基因的缺失突变体和互补菌株。研究表明：该基因具有正向调控生物膜形成和负向调控致病性的作用；氧分子和Cu2+显著影响PXO01021基因的表达；在野生型PXO99A菌株中，PXO01021基因启动子具有生物学活性；PXO01021/PXO01020/PXO01019/PXO01018基因簇中，PXO01021和PXO01018都是单独转录的，而PXO01020和PXO01019是共转录的。此外，通过RT-qPCR方法，检测了Xoo中DSF信号蛋白基因突变体ΔrpfF、ΔrpfC和ΔrpfG中三型分泌系统相关hrp基因的表达情况，发现DSF信号系统能够调控三型分泌系统相关基因的表达。

关键词：水稻白叶枯病菌 PXO01021 环鸟苷二磷酸基因表达功能

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水稻白叶枯病菌PX099A中趋化受体基因的突变研究

水稻白叶枯病菌PX099A中趋化受体基因的突变研究

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作者：许力丹广西大学

学位级别：硕士

水稻白叶枯病（ricebacterialleafblight,BLB）是一种水稻细菌性病害,在世界范围内的多数稻区均有发生,造成水稻减产甚至绝收。其病原物为水稻黄单胞菌致病变种（Xanthomonas oryzae ***,Xoo）,俗称水稻白叶枯病菌。该菌主要通过水孔和... 详细信息

水稻白叶枯病（ricebacterialleafblight,BLB）是一种水稻细菌性病害,在世界范围内的多数稻区均有发生,造成水稻减产甚至绝收。其病原物为水稻黄单胞菌致病变种（Xanthomonas oryzae ***,Xoo）,俗称水稻白叶枯病菌。该菌主要通过水孔和伤口侵入叶片,并沿维管束系统进行定殖和扩展。对该菌致病机理的研究有助于开发新的防治病害的药物和方法。已有研究表明趋化性对细菌完成完整的侵染循环具有重要的作用,更在侵染宿主的前期阶段扮演重要角色。然而,由于趋化受体及其基因具有显著的菌种特异性和多样性,目前对Xoo的趋化受体的功能及作用机理尚未阐明。趋化受体,也称甲基化受体蛋白（methyl-accepting chemotaxis proteins,MCP）,在细菌趋化过程中负责接收并转导外界化学信号的作用。为了弄清Xoo中MCP的功能,本研究从全基因组水平,对水稻白叶枯病菌中的甲基化受体蛋白基因开展突变研究。主要结果如下:1.通过生物信息学方法对Xoo PXO99A菌株的基因组进行分析,确认该菌株具有11个mcp基因,其中多数为典型的mcp基因,编码产物具有双重跨膜结构域、配体结合结构域和甲基接受结构域。而PXO00916基因编码一类非典型的MCP。通过逆转录PCR的验证,证明了PXO009 6基因在基因组中注释的不完整性,新的预测中发现其携带了一个REC结构域,作为一种新型的MCP类型存在。2.采用基于pK18mobsacB自杀质粒的双交换突变方法系统地构建了 mcp基因的突变体。根据nmcp基因上、下游侧翼序列设计引物,通过PCR方法获得上下游片段,克隆于pK18mobsacB质粒上,通过三亲本接合的方式将重组质粒导入到PX099A菌株中,再通过筛选标记的筛选及PCR验证,构建了 9个nmcp基因的突变体（本实验室已有其余2个mcp基因突变体）以及一个包含了 7个mcp基因的大片段缺失突变体。3.采用毛细管法对Xoo PX099A野生型菌株和突变体进行趋化鉴定。首先通过野生型菌株的趋化研究,表明PX099A菌株对供试蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、半乳糖、核糖、苹果酸、吲哚乙酸、脱落酸、水稻叶片提取物、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸具有明显的趋化性。随后,又通过对其11个rmcp单基因敲除突变体和1个簇基因敲除突变体进行上述化合物趋化研究,初步鉴定出不同MCP响应的化合物。4.通过对11个mcp单基因敲除突变体和1个簇基因敲除突变体进行多种表型检测,并对其中表型明显变化的突变体进行互补实验。发现PXO00054基因的缺失影响了菌株在种子表面的定殖能力;PXO00041、PXO00045、PXO06142基因的缺失导致细菌的游动性显著降低;PXO00916、PXO04751和PXO06142基因的缺失导致细菌的集群性运动显著降低;PXO00045、PXO00046和PXO00054基因的缺失后,菌株的抗SDS能力有轻微下降,而PXO00916和PXO04751基因缺失后菌株抗SDS能力显著增强;PXO00039和PXO00041基因对细菌的生物膜的形成能力有贡献,这两个基因缺失后菌株形成生物膜的能力降低。而mcp基因簇缺失突变体在种子表面定殖能力、运动性以及生物膜形成方面,均较野生型表现出显著性降低。综上,本研究系统地对水稻白叶枯病菌PX099A中趋化受体相关基因进行了突变,完成对PX099A菌株的mcp基因功能的初探,为后续深入研究MCP功能提供线索,以及为白叶枯病害防治提供了参考。

关键词：水稻白叶枯病菌趋化性趋化受体 MCP 表型致病力

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水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号受体Filp和PXO02374的互作蛋白鉴定

水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号受体Filp和PXO02374的互作蛋白鉴定

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作者：李潇桐中国农业科学院

学位级别：硕士

在与寄主水稻互作中，水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo）通过多种信号途径调控其毒性和侵染过程。环鸟苷二磷酸（cyclic-diguanylate,简称c-di-GMP）是细菌内普遍存在的第二信使，参与细菌体内信号级联反应，调... 详细信息

在与寄主水稻互作中，水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo）通过多种信号途径调控其毒性和侵染过程。环鸟苷二磷酸（cyclic-diguanylate,简称c-di-GMP）是细菌内普遍存在的第二信使，参与细菌体内信号级联反应，调控细菌毒性、生物膜形成、胞外多糖产生和运动性等生物学功能。c-di-GMP受体作为信号识别、接收和传递者，可在基因转录、翻译和翻译后等水平上发挥调控功能。前期研究表明，Xoo菌株PXO99A具有26个c-di-GMP信号代谢相关蛋白，c-di-GMP水平变化影响致病性和EPS产生，说明c-di-GMP信号系统在Xoo毒性调控中至关重要。两种c-di-GMP信号受体Filp （含有退化的GGDEF和EAL结构域）和PXO02374（含有PilZ结构域）参与了Xoo毒性表达的调控，但是对其介导的下游调控途径及其机理尚不清楚。因此，本研究对Filp和PXO02374的互作蛋白进行了筛选，鉴定了互作模式，为阐明c-di-GMP信号在Xoo毒性调控中的作用机理提供了科学依据。主要结果如下： 1. Filp与PXO02715蛋白互作的鉴定。构建了Filp诱饵载体pGBKFilp，证实了诱饵载体对酵母细胞无毒性作用，无自激活活性；构建了3个PilZ结构域蛋白PXO02715、PXO02374和PXO00049猎物载体，并转化酵母Y187菌株。采用酵母双杂交（Y2H）方法，发现了Filp可以与PXO02715发生互作，而不与PXO02374或PXO00049互作。原核表达和纯化了Filp蛋白（带有GST标签）和PXO02715蛋白（带有His6标签）。采用GST pull-down方法，证实了Filp与PXO02715蛋白之间的互作。 2. Filp与PXO02715蛋白结构域互作的鉴定。构建了Filp缺失不同结构域（REC，PAS，GGDEF和EAL）和Filp单独PilZ结构域的酵母诱饵表达载体，分析了两个蛋白不同结构域之间的互作模式，发现了缺失EAL结构域的Filp蛋白不能与PXO02715发生互作，而缺失REC、PAS和GGDEF不影响与PXO02715的互作；单独的EAL和GGDEF结构域可以与PXO02715发生互作。 3. PXO02374互作蛋白的筛选。构建了PXO02374诱饵载体，从Xoo cDNA文库中筛选了107个互作蛋白的阳性克隆，通过PCR和测序分析得到了14个候选基因。通过Y2H和GSTpull-down方法验证，获得了2个与PXO02374特异性互作蛋白（PXO03510和PXO05583）。总之，本研究揭示了Filp与PXO02715互作关系，发现了EAL结构域是两者互作所必须的，Filp的GGDEF结构域也可与PXO02715发生互作。另外，鉴定了PilZ结构域蛋白PXO02374可以与PXO03510和PXO05583发生互作。因此， Filp和PXO02374受体的互作蛋白的鉴定，为深入地解析Xoo c-di-GMP信号途径及其毒性调控机理奠定了坚实的基础。

关键词：水稻白叶枯病菌 c-di-GMP 受体互作蛋白毒性调控

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水稻白叶枯病菌转录调控因子FleQxoo和σ54因子RpoNxoo的基因功能鉴定

水稻白叶枯病菌转录调控因子FleQxoo和σ54因子RpoNxoo的基因功能...

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作者：张静中国农业科学院

学位级别：硕士

细菌鞭毛不仅在适应环境、寻找营养和躲避不良因素伤害等过程中是一种重要的运动器官,而且在趋化、附着、毒性因子产生、生物膜形成和定殖等过程中也是一种潜在的致病因子。细菌鞭毛的生物合成受到级联调控系统的严格控制。在一些重要... 详细信息

细菌鞭毛不仅在适应环境、寻找营养和躲避不良因素伤害等过程中是一种重要的运动器官,而且在趋化、附着、毒性因子产生、生物膜形成和定殖等过程中也是一种潜在的致病因子。细菌鞭毛的生物合成受到级联调控系统的严格控制。在一些重要的动物和医学病原细菌（如铜绿假单胞、霍乱弧菌和幽门螺旋杆菌等）中,存在一个以转录调控因子FleQ和σ54因子RpoN为主控因子的4层级联调控系统,FleQ和σ54因子协同调控了不同类型鞭毛基因的表达。水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo）侵染引起的白叶枯病是世界水稻生产上最严重的细菌病害之一,也是病原物—植物互作研究的一种重要模式系统。Xoo单根极生鞭毛是重要的运动器官和潜在的致病因子。然而,至今对Xoo鞭毛生物合成的调控机理尚不清楚。对Xoo基因组进行生物信息学分析,发现了由大约60个基因组成了鞭毛基因簇,其结构排列、序列特征、转录单元和转录方向与铜绿假单胞等相似,其中存在FleQ和RpoN同源序列FleQxoo和RpoNxoo。推断Xoo可能同样存在一个以FleQxoo和RpoNxoo为主控因子的级联调控系统。本研究通过基因克隆、序列分析、缺失突变、表型测定、鞭毛基因和TTSS基因表达检测,对FleQxoo和RpoNxoo的分子特征及其功能进行了鉴定分析。研究目的和意义在于阐明FleQxoo和RpoNxoo在Xoo鞭毛运动性以及相关生物学性状表达中的作用;阐明Xoo鞭毛系统调控机制将为发展新型、有效和可持续的病害控制策略和方法提供科学依据。以Xoo野生型菌株PXO99A基因组DNA为模板,用特异性引物进行PCR扩增,成功地获得了与GenBank中KACC10331序列完全一致的fleQxoo （1485bp）和rpoNxoo （1402bp）基因片段。FleQxoo是NtrC家族激活蛋白成员之一,具有与σ54作用的结构域和DNA结合保守结构域（HTH）,通过结合靶基因启动子区域、激活基因的转录。RpoNxoo具有与激活子互作的结构域（AID）、核心结合结构域（CBD）和DNA结合结构域（DBD）的3个保守结构域。FleQ和RpoN在植物病原黄单胞菌（水稻白叶枯病菌、柑桔溃疡病菌、番茄斑点病菌、甘蓝黑腐病菌）中同源性较高,氨基酸序列同源性可达到81.06-98.08%。采用基因标记置换方法,将构建的基因缺失突变载体pKS-fleQG和pKS-rpoNG分别导入PXO99A,发生同源重组和标记双交换,分别从基因组中缺失了fleQxoo和rpoNxoo,获得了△fleQxoo和△rpoNxoo缺失突变体。将构建的互补载体pHM-fleQ和pHM-rpoN分别转化到相应的突变体中,获得了互补菌株△fleQxoo::C和△rpoNxoo::C。与PXO99A相比,△fleQxoo、△rpoNxoo和△fleQxoo+△rpoNxoo鞭毛产生能力丧失,运动性减弱,基因互补可以使之恢复;但胞外酶类（纤维素酶和木聚糖酶）活性以及对烟草叶组织的致敏性无明显改变。表明FleQxoo和σ54可能主要参与了Xoo鞭毛生物合成及其运动性的调控。利用生物信息学方法,鉴定了44个σ54依赖型鞭毛基因,其启动子中存在σ54识别的保守结合域GG-（N10）-GC和FleQxoo结合位点保守序列CC-（N4）-C-（N3）-T。鉴定了3个σ28依赖型基因（fliCxoo、cheAxoo和cheZxoo）,其启动子中存在σ28识别的保守结合域TAAA-（N15）-GCCCGTT。利用RT-Q-PCR方法,检测了△fleQxoo和△rpoNxoo中6个鞭毛基因(包括自身基因fleQxoo和rpoNxoo、σ54依赖型鞭毛基因fliAxoo、fliDxoo和fliLxoo、σ28依赖型鞭毛基因fliCxoo)的转录。与PXO99A相比,在所有突变体中这些鞭毛基因的表达均显著降低。表明FleQxoo和RpoNxoo不仅直接正向调控了鞭毛基因fliAxoo、fliDxoo和fliLxoo的转录,通过FliAxoo (σ28)间接正向调控了鞭毛素基因fliCxoo的转录,而且还负向调控了自身基因fleQxoo和rpoNxoo的转录。此外,利用RT-Q-PCR方法,检测了△fleQxoo和△rpoNxoo中3个TTSS基因（转录调控基因hrpG、hrpXo和效应子基因hpaI）的转录。与PXO99A相比,在所有突变体中这些TTSS基因的表达均显著增加。表明FleQxoo和RpoNxoo负向调控了TTSS基因（hrpG、hrpXo和hpa I）的转录。总之,本研究阐明了FleQxoo和RpoNxoo (σ54)作为主控因子,在Xoo鞭

关键词：水稻白叶枯病菌 FleQxoo RpoNxoo 鞭毛运动性基因级联调控

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水稻白叶枯病菌中国菌株OS-198基因文库的构建及含无毒基因克隆的初步筛选

水稻白叶枯病菌中国菌株OS-198基因文库的构建及含无毒基因克隆的...

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作者：李士河南京农业大学

学位级别：硕士

水稻白叶枯病(Bacterial Blight of Rice)是水稻(Oryzae sativa)上最重要的病害之一,它是由水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)引起的。水稻白叶枯菌(Xoo)从被发现至今100多年的历史中,一直是植物病理学研究者关注的焦点。研... 详细信息

水稻白叶枯病(Bacterial Blight of Rice)是水稻(Oryzae sativa)上最重要的病害之一,它是由水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)引起的。水稻白叶枯菌(Xoo)从被发现至今100多年的历史中,一直是植物病理学研究者关注的焦点。研究水稻抗病基因(R)和Xoo无毒基因(A)的互作是阐明抗病基因和Xoo的致病性分化、鉴定小种、无毒基因、致病基因等的基本依据,也是发展有效的病害防治措施的需要。因此,研究水稻白叶枯病菌的无毒基因,将有助于鉴定和克隆水稻的抗病基因,进一步明确无毒基因与抗病基因互作的分子机制。\n Xoo中已克隆的avr基因有avrXa7、avrXa10、avrXa3、avrXa27和avrxa5,而本实验室筛选到一个弱毒性的菌株OS-198可能含有新的无毒基因,为此提取了OS-198的总DNA,经EcoRI部分酶切后,回收23-48.5Kb的片段,连接到用EcoRI完全酶切,去磷酸化的粘粒载体pUFR034上。用包装蛋白将上述连接混合物包装后,吸附到宿主菌S17-1中,构建了OS-198的基因组文库。\n Xoo基因组中存在着众多的avrBs3/pthA家族基因,为了了解这些基因在OS-198基因组中的存在特点,本实验利用来源于水稻白叶枯病菌菌株JXOⅢ的2.67Kb的无毒基因avrXa3重复区的1.4kb-SphⅠ片段作探针检测OS-198基因文库,通过斑点杂交及Southern杂交,将所得结果进行归类和分析,从64个阳性克隆中鉴定出15个不同的阳性克隆,它们在基因组中单独存在,或2个和2个以上串联排列。为今后进一步研究OS198的avrBs3/pthA家族基因提供了基本信息。\n 将800个OS-198/pUFR034文库的克隆用两型交配法逐一导入PXO99A中,得到的结合子和野生型菌株一起接种苗期水稻近等基因系,发现7个克隆导入受体菌后病斑长度与PXO99A差异显著。其中克隆592和519,377在水稻IRBB8和IRBB2,IRBB7上产生类似HR的反应,为将来进一步发掘OS-198中新的无毒基因提供了基础。

关键词：基因文库无毒基因水稻白叶枯病菌基因克隆两型交配法

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水稻白叶枯病菌OS198低毒力的机制初探

水稻白叶枯病菌OS198低毒力的机制初探

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作者：何翔南京农业大学

学位级别：硕士

水稻白叶枯病(bacterial leaf blight of rice)是由革兰氏阴性黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)引起的维管束病害,可造成水稻的严重减产,给全中国乃至全世界的水稻带来毁灭性危害。水稻白叶枯菌中国系统6号小种代表菌... 详细信息

水稻白叶枯病(bacterial leaf blight of rice)是由革兰氏阴性黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae ***,Xoo)引起的维管束病害,可造成水稻的严重减产,给全中国乃至全世界的水稻带来毁灭性危害。水稻白叶枯菌中国系统6号小种代表菌株OS198,它具有与多个IRBB系列和一些地方水稻品种上互作时表现弱毒力的遗传背景,本课题组在过去对OS198中的几个tal基因的研究发现,talR26.5和talR20.5能够起着一定程度的弱毒力作用,但并不是OS198弱毒力的决定因子。同时该菌中存在的主效毒力因子的功能也不能够得到表达。为探究OS198中毒力调控的遗传机制,本研究采用了构建突变体库,筛选毒力表型发生改变的突变体的途径来发掘OS198中毒力调控因子,以期从分子水平上揭示OS198中毒力调控机制。研究采用EZ-Tn5TM

关键词：水稻白叶枯病菌 ALP基因 EZ-Tn5 毒力

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