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植物学报 2015年第3期50卷 354-362页

作者：李潇孙海彦阮孟斌王霈虹彭明海南大学海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海口571101 北京市科学技术情报研究所北京100048

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长,构建了原核表达载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)中,使用IPTG于28℃诱导6小时后,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白,分子量约为55 kDa,并通过酶活力检测实验证明... 详细信息

从地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)中克隆到耐高温α-淀粉酶基因全长,构建了原核表达载体,转入大肠杆菌(Escherichia coli)中,使用IPTG于28℃诱导6小时后,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白,分子量约为55 kDa,并通过酶活力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导瞬时转化烟草(Nicotiana tabacun)下表皮细胞并在荧光显微镜下观察,发现在烟草下表皮细胞的细胞质和液泡中均有绿色荧光。使用I_2-KI溶液对乙醇脱色后的烟草叶片进行染色,显色反应表明在烟草中表达的耐高温α-淀粉酶具有酶活性。最后,采用农杆菌介导的花蕾浸泡法将重组载体转化到拟南芥(Arabidopsis thaliana)中,筛选到稳定遗传的耐高温α-淀粉酶基因的拟南芥纯合子。研究结果为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了实验基础。

关键词：地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因烟草瞬时表达拟南芥

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杜氏盐藻番茄红素ε-环化酶基因DsLYCE表达载体构建及其在烟草中瞬时表达分析

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山西农业大学学报（自然科学版） 2020年第2期40卷 54-59页

作者：王计平安茜段露露赵熙宁岳敏崔红利李润植山西农业大学分子农业与生物能源研究所山西太谷030801

[目的]ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LYCE)可将番茄红素环化,并与番茄红素β-环化酶共同作用合成α-胡萝卜素,参与植物体内类胡萝卜素的合成途径。富含β-胡萝卜素的杜氏盐藻(Dunaliella Salina)LYCE功能还未解析。[方法]本文利用RT-PC... 详细信息

[目的]ε-环化酶(lycopeneε-cyclase,LYCE)可将番茄红素环化,并与番茄红素β-环化酶共同作用合成α-胡萝卜素,参与植物体内类胡萝卜素的合成途径。富含β-胡萝卜素的杜氏盐藻(Dunaliella Salina)LYCE功能还未解析。[方法]本文利用RT-PCR分离杜氏盐藻DsLYCE基因ORF,并克隆到植物表达载体pCAMBIA1303、构建DsLYCE组成型表达载体pCAMBIA1303-DsLYCE。通过农杆菌介导渗入法在烟草叶组织中瞬时表达DsLYCE,鉴定DsLYCE功能。[结果]烟叶生理生化分析显示,与野生型和空载体对照相比,DsLYCE瞬时表达的烟叶组织中类胡萝卜素积累显著提高(P<0.05),含量增加了24%。相似地,转DsLYCE基因的烟草叶片中叶绿素a和叶绿素b含量也明显高于野生型空载对照烟草。这表明杜氏盐藻DsLYCE基因异源表达不仅能促进宿主细胞类胡萝卜素的合成与积累,而且还可以改善宿主细胞的光合作用。[结论]本研究为深入解析杜氏盐藻DsLYCE参与类胡萝卜素生物合成的分子机制以及应用于其他植物的色素代谢遗传改良提供科学参考。

关键词：杜氏盐藻番茄红素ε-环化酶烟草瞬时表达类胡萝卜素

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地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、原核表达及其在烟草叶中瞬时表达的研究

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因的克隆、原核表达及其在烟草叶...

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2014年度中国热带作物学会遗传育种专业委员会/热带香料饮料作物专业委员会年会暨学术研讨会

作者：李潇孙海彦阮孟斌彭明海南大学海南海口570228 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101

为探讨在植物中表达耐高温基因的可行性,本研究从地衣芽孢杆菌中克隆得到耐高温α-淀粉酶基因全长,构建了原核表达载体,转入大肠杆菌中使用IPTG于28℃诱导6小时后,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白,分子量约为55KDa,并通过酶活力检测实验证... 详细信息

为探讨在植物中表达耐高温基因的可行性,本研究从地衣芽孢杆菌中克隆得到耐高温α-淀粉酶基因全长,构建了原核表达载体,转入大肠杆菌中使用IPTG于28℃诱导6小时后,通过SDS-PAGE检测到目的蛋白,分子量约为55KDa,并通过酶活力检测实验证明该蛋白具有耐高温α-淀粉酶活性。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化烟草下表皮细胞,荧光显微镜观察发现,在烟草下表皮细胞的细胞质、液泡中均有绿色荧光。本研究结果表明所克隆得到的耐高温α-淀粉酶基因可在烟草中成功表达,为后期开展表达耐高温α-淀粉酶的转基因植物的相关研究奠定了实验基础。

关键词：地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因原核表达烟草瞬时表达

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油茶炭疽病菌果生刺盘孢效应子的筛选

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林业科学 2021年第9期57卷 110-120页

作者：陈星州周国英陈行钢江玲玉包安华刘君昂中南林业科技大学南方人工林病虫害防治国家林业局重点实验室森林有害生物防控湖南省重点实验室经济林培育与保护教育部重点实验室长沙410004

【目的】采用生物信息学研究方法,筛选分析果生刺盘孢效应子,并验证其功能,为其致病相关基因研究提供理论依据,同时为油茶病害管理提供参考。【方法】对果生刺盘孢非侵染期(分生孢子)和侵染时期(油茶叶片病斑组织)进行RNA-seq测序,并利... 详细信息

【目的】采用生物信息学研究方法,筛选分析果生刺盘孢效应子,并验证其功能,为其致病相关基因研究提供理论依据,同时为油茶病害管理提供参考。【方法】对果生刺盘孢非侵染期(分生孢子)和侵染时期(油茶叶片病斑组织)进行RNA-seq测序,并利用生物信息分析软件BUSCA、Target P、big-PI Predictor和GO、KEGG、PHI数据库分析转录组数据,选出符合条件的候选效应子,再利用qRT-PCR技术对效应子进行相对定量分析;克隆候选效应子全长基因,通过烟草瞬时表达系统和DAB染色验证相应基因功能。【结果】1)转录组结果数据显示,侵染时期相对于非侵染时期有7850个差异表达基因。对差异表达基因的编码蛋白进行预测分析,345个为经典分泌蛋白,占总数的4.39%。经典分泌蛋白氨基酸长度在各区间段分布较为均匀,而符合效应子筛选条件(<300 aa)的蛋白约占经典分泌蛋白总数的36%,数量相对较少。信号肽长度集中在18~20 aa(占48.7%),信号肽切割位点以SPase I型为主(占88.41%)。KEGG功能富集分析得到164条Pathway信息,多为真菌代谢途径、次生代谢产物、淀粉和蔗糖代谢相关的通路。PHI致病菌数据库同源比对结果表明,在经典分泌蛋白中含有80条与真菌致病力相关的基因,其中包括1个已知效应子。以氨基酸长度<300和半胱氨酸残基数≥4为筛选条件,并过滤已经注释过功能的蛋白后,在果生刺盘孢中筛选出17个候选效应子。2)随机抽样选取9个候选效应子做qRT-PCR分析,结果显示9个基因均为上调表达,与转录组数据结果相符。3)克隆出4个候选效应子,并通过烟草瞬时表达系统和DAB染色,验证出4个候选效应子均能引起植物细胞坏死。【结论】果生刺盘孢在侵染油茶时期有多个效应子表达,而在分生孢子时期此类蛋白多为不表达或少量表达,这验证了效应子是植物与病原菌相互作用的关键因素。

关键词：油茶炭疽病果生刺盘孢转录组生物信息学效应子烟草瞬时表达分泌蛋白

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蛇足石杉中石杉碱甲合成相关基因HsPKS1的克隆及表达分析

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中草药 2024年第18期55卷 6324-6334页

作者：沈玉吴昊吴德财姚诗晴李欣媛戴亮芳罗向东江西师范大学生命科学学院江西南昌330022

目的克隆蛇足石杉Huperzia serrata中石杉碱甲合成相关基因HsPKS1,解析其功能,为揭示石杉碱甲生物合成机制奠定基础。方法基于蛇足石杉转录组及qRT-PCR,筛选并克隆HsPKS1基因,利用生物学信息分析预测其功能;采用同源重组方法构建基因表... 详细信息

目的克隆蛇足石杉Huperzia serrata中石杉碱甲合成相关基因HsPKS1,解析其功能,为揭示石杉碱甲生物合成机制奠定基础。方法基于蛇足石杉转录组及qRT-PCR,筛选并克隆HsPKS1基因,利用生物学信息分析预测其功能;采用同源重组方法构建基因表达载体,遗传转化至烟草中进行亚细胞定位和表达分析,利用广泛靶向代谢组分析HsPKS1基因参与的生物合成通路的作用机制。结果qRT-PCR和HPLC结果表明不同组织间HsPKS1基因相对表达量与其石杉碱甲含量呈正相关。基因克隆、测序及生物信息学分析表明,HsPKS1基因开放阅读框为1200 bp,编码399个氨基酸,编码蛋白具有酰基转移酶活性区域及多个辅酶A的结合位点。系统进化树分析表明,HsPKS1蛋白与25个物种的聚酮合酶均具有较高的同源性,其中与江南卷柏的亲缘关系最近。亚细胞定位结果表明HsPKS1蛋白在细胞核和细胞质均有表达。广泛靶向代谢组分析发现,HsPKS1基因可以显著影响烟草次生代谢产物的积累,并引起合成黄酮类的前体化合物和异喹啉类生物碱化合物的物质变化。结论成功克隆并获得HsPKS1基因序列,分析了基因表达模式、生物学功能及亚细胞定位,揭示了该基因在类黄酮和生物碱合成等方面起重要作用,为研究和揭示HupA合成代谢通路的分子机制提供科学依据。

关键词：蛇足石杉聚酮合酶基因克隆烟草瞬时表达广泛靶向代谢组

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续随子二酰甘油酰基转移酶2基因(ElDGAT2)克隆与功能分析

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植物生理学报 2019年第8期55卷 1156-1166页

作者：任国鹏葛丽萍孙超超刘宝玲李润植山西农业大学林学院山西太谷030801 山西农业大学分子农业与生物能源研究所山西太谷030801 北方功能油料树种培育与研发山西省重点实验室山西太谷030801

本文从续随子发育种子中分离编码二酰甘油酰基转移酶2的cDNA克隆(ElDGAT2),采用生物信息学工具解析ElDGAT2酶蛋白的理化性质、高级结构、亚细胞定位及系统发育等特性。利用qRT-PCR研究该基因在续随子不同器官组织的表达谱。构建ElDGAT2... 详细信息

本文从续随子发育种子中分离编码二酰甘油酰基转移酶2的cDNA克隆(ElDGAT2),采用生物信息学工具解析ElDGAT2酶蛋白的理化性质、高级结构、亚细胞定位及系统发育等特性。利用qRT-PCR研究该基因在续随子不同器官组织的表达谱。构建ElDGAT2的组成型植物表达载体(pCAMBIA1303-ElDGAT2),通过农杆菌介导烟草瞬时表达鉴定ElDGAT2基因的功能。结果显示,续随子ElDGAT2cDNA全长1939bp,ORF为984bp,编码327个氨基酸。ElDGAT2蛋白定位于内质网上,二级结构主要结构元件为α-螺旋(37.00%)和无规则卷曲(34.25%)。DGAT2蛋白系统发育树分析揭示,续随子ElDGAT2与同科植物蓖麻、油桐、麻疯树的DGAT2蛋白亲缘关系较近。基因表达分析表明,ElDGAT2基因在续随子不同器官中均有表达,而且在种子中的表达量显著高于其他器官。在种子发育中期(花后30d)即油脂快速合成积累时期的表达量最高,ElDGAT2表达量约为叶片的12.83倍。与野生型和空载体转化烟叶相比,ElDGAT2瞬时表达的烟叶组织总油脂含量提高1.59%,饱和脂肪酸减少,油酸等不饱和脂肪酸增加。研究表明,ElDGAT2编码一个具有催化活性的DGAT2酶蛋白,异源表达可提高宿主组织总油脂和不饱和脂肪酸的合成积累,显示ElDGAT2对油酸等不饱和脂肪酸有底物偏好性。

关键词：续随子二酰甘油酰基转移酶2 基因克隆表达谱烟草瞬时表达

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续随子ElSAD2基因的克隆与功能分析

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西北植物学报 2022年第4期42卷 549-557页

作者：王鑫雨葛丽萍盛晓倩牛听风包鹏李润植山西农业大学林学院山西太谷030801 山西农业大学分子农业与生物能源研究所山西太谷030801

Δ^(9)-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是参与植物不饱和脂肪酸生物合成的关键酶。该研究从续随子(Euphorbia lathyris)种子转录组数据库中筛选得到续随子ElSAD2基因序列,对其序列表达特性进行分析,并鉴定ElSAD2基因的功能。结果显示:(1)续随子E... 详细信息

Δ^(9)-硬脂酰-ACP脱氢酶(SAD)是参与植物不饱和脂肪酸生物合成的关键酶。该研究从续随子(Euphorbia lathyris)种子转录组数据库中筛选得到续随子ElSAD2基因序列,对其序列表达特性进行分析,并鉴定ElSAD2基因的功能。结果显示:(1)续随子ElSAD2的cDNA全长1665 bp,ORF为1194 bp,编码397个氨基酸残基;系统进化分析显示ElSAD2蛋白与蓖麻(Ricinus communis)RcSAD1蛋白等亲缘关系较近。(2)ElSAD2在续随子各器官中均有表达,其中在花后30 d种子中表达量最高。(3)在BY4389缺陷型酵母中过表达ElSAD2,使缺陷酵母不饱和脂肪酸含量升高。(4)本氏烟草瞬时表达ElSAD2,使得烟草叶片总油脂和油酸含量分别提高2.46%和2.1%。研究发现,ElSAD2能催化单不饱和油酸的生物合成,可进一步应用于油料植物油脂产量和品质改良。

关键词： Δ^(9)-硬脂酰-ACP脱氢酶续随子能源植物油酸(18∶1Δ^(9)) 酵母功能互补实验烟草瞬时表达

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点蜂缘蝽效应子新型筛选体系的建立及应用

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应用昆虫学报 2024年第1期61卷 49-61页

作者：鲁王善李继芬董玉妹沈丹宇窦道龙夏爱南京农业大学植物保护学院南京210095

【目的】建立以荧光素酶为报告基因且调控不同植物抗性相关通路的点蜂缘蝽效应子筛选新体系,并应用于点蜂缘蝽效应子的研究。【方法】通过对点蜂缘蝽Riptortuspedestris取食前后的大豆叶片转录组比较分析,挑选出了4个点蜂缘蝽取食后高... 详细信息

【目的】建立以荧光素酶为报告基因且调控不同植物抗性相关通路的点蜂缘蝽效应子筛选新体系,并应用于点蜂缘蝽效应子的研究。【方法】通过对点蜂缘蝽Riptortuspedestris取食前后的大豆叶片转录组比较分析,挑选出了4个点蜂缘蝽取食后高度上调表达且影响不同信号通路的大豆抗性相关基因。其中Gm^(2)参与异黄酮代谢、Gm3参与生长素和硫苷代谢、Gm6参与免疫信号识别和Gm8参与茉莉酸生物合成。利用PCR扩增4个基因的启动子序列并构建到pGreen-LUC载体上。构建成功的载体转化到大肠杆菌中,再利用根癌农杆菌注射在本氏烟中瞬时过表达建立报告系统。其次,在烟草叶片上表达点蜂缘蝽候选效应子12h后再分别表达报告系统。通过观察效应子对荧光素酶表达活性的影响来研究效应子的功能。【结果】琼脂糖凝胶电泳和测序证明了PCR成功扩增了4个抗性相关基因的启动子。荧光素酶报告基因检测、酶标仪酶活检测以及Western Blot验证了4个基因启动子在烟草叶片上成功表达。昆虫取食、机械处理和MeJA处理验证了该报告系统的可行性。最后利用该筛选体系对9个点蜂缘蝽效应子进行了筛选,结果显示9个点蜂缘蝽效应子对4个报告基因的表达有不同的调控作用。【结论】成功建立了以荧光素酶为报告基因的点蜂缘蝽效应子筛选新体系,该体系可应用于点蜂缘蝽效应子的大量筛选,且具有高效、快速和操作简易等特点,为其他昆虫效应子的研究提供了新思路。

关键词：点蜂缘蝽荧光素酶大豆基因启动子昆虫效应子信号通路烟草瞬时表达

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紫苏磷脂酸磷酸水解酶基因(PfPAH1)的鉴定及功能分析

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西北农业学报 2024年第4期33卷 695-706页

作者：董书言邢志尹苗王尧周雅莉黄旭升王超王计平李润植山西农业大学分子农业与生物能源研究所山西太谷030801

本文基于紫苏基因组数据筛选获得两条PfPAH1基因序列,分别命名为PfPAH1-1和PfPAH1-2。应用生物信息学工具分析PfPAH1s蛋白理化性质、功能结构域及系统进化。定量PCR(qRT-PCR)检测PfPAH1s在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子的表达... 详细信息

本文基于紫苏基因组数据筛选获得两条PfPAH1基因序列,分别命名为PfPAH1-1和PfPAH1-2。应用生物信息学工具分析PfPAH1s蛋白理化性质、功能结构域及系统进化。定量PCR(qRT-PCR)检测PfPAH1s在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子的表达谱。进一步克隆到高表达的PfPAH1-1基因的编码序列并进行烟草瞬时转化以鉴定其功能。结果表明,PfPAH1-1和PfPAH1-2基因的开放阅读框(ORF)长度均为2715 bp,编码904个氨基酸残基,含有Lipin_N、Lipin_mid和属于HAD_like超家族的LNS2三个保守结构域。系统进化分析显示紫苏PfPAH1-1蛋白与唇形科植物一串红的SsPAH1亲缘关系最近,其次是葡萄和芥菜。PfPAH1-2蛋白则与唇形科的芝麻SiPAH1亲缘关系最近,其次为油橄榄,紫苏和芝麻均为油料作物,推测PfPAH1-2和SiPAH1可能具有相似功能。qRT-PCR分析表明PfPAH1-1和PfPAH1-2基因均在开花后40 d种子中表达量最高,预示着其可能参与油脂合成积累。烟草瞬时转化揭示过表达PfPAH1-1基因烟草叶片总脂肪酸及中性脂含量均高于野生型烟草,然而磷脂含量降低。

关键词：紫苏磷脂酸磷酸水解酶基因克隆表达特性烟草瞬时表达

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调控黄瓜苦味基因Bi的AP2/ERF家族转录因子

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园艺学报 2014年第4期41卷 672-680页

作者：张慧敏张雷马永硕尚轶王深浩杨清黄三文南京农业大学生命科学学院南京210095 中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京100081

从华北型黄瓜‘9930’中克隆了黄瓜苦味形成的关键基因Bi的启动子序列,通过酵母单杂交技术对黄瓜叶片cDNA文库进行筛选,寻找可以调控Bi表达的转录因子。通过对筛选结果的测序及比对,发现有7种转录因子重复出现,包括2个AP2/ERF家族、3个b... 详细信息

从华北型黄瓜‘9930’中克隆了黄瓜苦味形成的关键基因Bi的启动子序列,通过酵母单杂交技术对黄瓜叶片cDNA文库进行筛选,寻找可以调控Bi表达的转录因子。通过对筛选结果的测序及比对,发现有7种转录因子重复出现,包括2个AP2/ERF家族、3个bZIP家族、1个WRKY家族转录因子和1个E3泛素类COP1蛋白。其中AP2/ERF家族转录因子CsERF(登录号:Csa7M448110)重复出现6次,出现概率高于其他转录因子。利用烟草瞬时表达系统,CsERF对Bi启动子的结合及激活作用得到了进一步验证。初步证明CsERF可以结合到Bi的启动子并激活其转录,推测其很可能就是黄瓜叶片中调控苦味形成的关键转录因子。

关键词：黄瓜苦味酵母单杂交烟草瞬时表达 AP2/ERF转录因子

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