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第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议

目的:多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR) 已成为化疗失败、影响预后的主要原因。P-糖蛋白(P- Glycoprotein,P-gp)是一种重要的MDR机制。MDR1基因转录增强造成P-gp的过量表达,从而将细胞内化疗药物逆浓度泵至细胞外,使细胞内化疗药... 详细信息

目的:多药耐药性(Multidrug Resistance,MDR) 已成为化疗失败、影响预后的主要原因。P-糖蛋白(P- Glycoprotein,P-gp)是一种重要的MDR机制。MDR1基因转录增强造成P-gp的过量表达,从而将细胞内化疗药物逆浓度泵至细胞外,使细胞内化疗药物达不到有效杀伤浓度而产生耐药性。虽然目前有药物:免疫、抗体、反义RNA 等多种方法逆转多药耐药,但效果不理想。本实验以MDR1 基因为靶基因,构建RNA干扰表达蔓病毒载体系统,并对其进行筛选鉴定,为以后的基因功能研究及肿瘤基因治疗准备条件。方法:1、siRNA的设计和合成:根据GeneBank 中MDR1已知序列(基因编号AF016535),运用多元生物信息法则设计3条含21个碱基的siRNA和并用随机序列作为阴性对照。2、细胞培养293T细胞株,大肠杆菌菌株DH5, 舌鳞癌耐药细胞系TCA8113／CDDP(上海市第九人民医院口腔颌面研究所),细胞接种于10％小牛血清RPMI1640双抗培养液中,37℃5％CO2培养箱中常规培养;3、MDR-1 小干扰RNA的蔓病毒载体系统的构建,包装与纯化病毒载体(蔓病毒载体系统购自tronolab)。采用体外化学方祛合成siRNA。合成Oligo DNA,然后与经MluI和ClaI酶切后的pLVTHM载体连接过夜。转化大肠杆菌DH5。筛选阳性克隆测序。在293T细胞株中转染、包装并收获及纯化病毒载体4、MDR-1小干扰RNA的蔓病毒载体系统效率检测在AD293和TCA8113／CDDP中,采用RT-PCR、Western Blot和免疫组织化学三种实验方法,同时在RNA水平和蛋白水平检测MDR-1小干扰RNA的蔓病毒载体系统对于目的基因MDR-1的敲减效率。结果:1、siRNA的设计和质粒合成设计3条含21个碱基的siRNA和并用随机序列作为阴性对照。采用体外化学方法合成siRNA。2、病毒载体的纯化与滴度测定重组病毒测得基因组滴度为2×10E8 TU。倒置荧光显微镜下检测GFP表达量90％以上。MOI=5时, TCA8113／CDDP中感染效率为90％;MOI=2时,293细胞中近100％的感染效率。3、MDR-1小干扰RNA的蔓病毒载体系统效率检测感染293细胞48后倒置荧光显微镜下可观察到表达,说明MDR-1小干扰RNA的蔓病毒载体系统成功感染细胞,并能正常表达目的序列;病毒感染TCA8113／ CDDP后通过采用RT—PCR、Western Blot和免疫组织化学三种实验方法,同时在RNA水平和蛋白水平检测表明, MDR-ImRNA和P—GP蛋白表达水平在干预后显著降低。以此为手段筛选出一条高效的mRNA。结论:RNA干扰(RNA interference,RNAi)是通过双链RNA(doublestrandedRNA, dsRNA)在细胞内被Dicer切成约19～22nt的小片段干扰 RNA(smallintefferingRNA,siRNA),进而形成沉默复合体 (RNA induced silencing complex,RISC),RISC通过识别降解具有同源序列的mRNA,最终导致特异性的基因表达沉默(genesilencing)。本实验构建的MDR-1小干扰RNA的蔓病毒载体系统能明显干扰P-gp的表达,为将其进一步应用于肿瘤多药耐药性逆转的治疗研究奠定了基础。

关键词：病毒载体系统 RNA MDR-1 小干扰

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人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定

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第六届全国免疫学学术大会

作者：高美华石学香李先平张蓓王秋波王冰山东青岛大学医学院免疫学教研室

目的:构建并筛选携带针对CD59基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞克隆,从mRNA水平研究CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法:用DNA重组技术,将3条60bp能转录产生靶向CD59小发夹RNA(shRNA)

关键词：病毒载体系统 CD59 RNAi 细胞克隆

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新型、简捷、有效的方法构建基于腺病毒载体系统的cDNA表达文库

新型、简捷、有效的方法构建基于腺病毒载体系统的cDNA表达文库

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中国蛋白质组学首届学术大会

作者：马立新马琪徐松湖北大学生物化学与分子生物学研究所湖北大学生物化学与分子生物学研究所湖北大学生物化学与分子生物学研究所

基因组测序和生物信息学的进展产生了大量未知功能的基因;多年来已知基因的完整功能谱还很缺乏;由于特殊细胞型或发育阶段中基因及环境因子间的复杂相互作用,基因功能也具可变性。cDNA克隆表达是鉴定赋予特殊细胞可选择表型的基因的有... 详细信息

基因组测序和生物信息学的进展产生了大量未知功能的基因;多年来已知基因的完整功能谱还很缺乏;由于特殊细胞型或发育阶段中基因及环境因子间的复杂相互作用,基因功能也具可变性。cDNA克隆表达是鉴定赋予特殊细胞可选择表型的基因的有力方法。因而,有必要发展高效的哺乳动物克隆表达系统。早期哺乳动物cDNA表达克隆系统是扩增带有SV40复制起始点在哺乳动物细胞中稳定表达SV40抗原的表达质粒。很多细胞因子受体相应的cDNA已通过各种筛选方式被克隆,如分析文库转染的COS细胞的培养上清的促生长活性;抗体包被板分选细胞;流式细胞术分捡细胞等。这却局限于允许SV40

关键词：病毒载体系统穿梭质粒

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一种改进的腺病毒载体系统及其病毒颗粒的制备和应用

一种改进的腺病毒载体系统及其病毒颗粒的制备和应用

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作者：陈海旭叶军 226601 江苏省南通市海安县开发区开发大道188号

本发明公开了一种改进的腺病毒载体系统和病毒制备方法，它是以pDONR221载体为初始载体进行改进，插入了多克隆位点和IRES-GFP片段。该系统结合了酶切连接和重组反应技术，既能高效构建载体，又降低了试剂成本。本发明还公开了后续病毒... 详细信息

标准号: CN103290052A

本发明公开了一种改进的腺病毒载体系统和病毒制备方法，它是以pDONR221载体为初始载体进行改进，插入了多克隆位点和IRES-GFP片段。该系统结合了酶切连接和重组反应技术，既能高效构建载体，又降低了试剂成本。本发明还公开了后续病毒载体酶切后，纯化的改进方法，该方法摒弃了传统的酚：氯仿：异戊醇纯化法，而使用常规的DNA回收柱或直接加热灭活法，简单易行，缩短了操作时间，降低了材料成本，并且无需使用有毒的酚、氯仿试剂，利用这两个方面结合起来的腺病毒系统，制备效率提高，成本降低，在侵染细胞中仍然保持高效。

关键词：氯仿酶切简单易行病毒载体系统病毒系统病毒载体病毒制备材料成本初始载体试剂成本系统结合制备效率重组反应纯化法克隆有毒细胞回收连接

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一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物使用方法

一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物...

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作者：董春升 215000 江苏省苏州市仁爱路199号生物医学研究院

本发明揭示一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物使用方法，该病毒为RNA病毒，其遗传物质在哺乳动物细胞中不具备整合能力，该病毒为弹状病毒科、水疱性口炎病毒属，病毒载体系统结构基因嵌合编码的分子至少... 详细信息

标准号: CN110564767A

本发明揭示一种减毒病毒载体系统及其在制备抗恶性肿瘤的药物中的应用及药物使用方法，该病毒为RNA病毒，其遗传物质在哺乳动物细胞中不具备整合能力，该病毒为弹状病毒科、水疱性口炎病毒属，病毒载体系统结构基因嵌合编码的分子至少包括一种特异性针对免疫检查点分子的抑制剂，该减毒病毒载体系统嵌合表达针对免疫检查点的单链抗体的新型重组表达载体系统，可特异性在肿瘤细胞中完成复制的同时表达外泌结合肿瘤细胞表面分子的特异性抗体，释放肿瘤抗原的同时激活免疫细胞抗肿瘤的特异性免疫应答，同时外泌的单链抗体打破肿瘤微环境的免疫抑制作用，促进CTL细胞对肿瘤细胞的清除，促进机体产生系统性的特异性抗肿瘤免疫记忆反应，控制肿瘤的复发。

关键词：单链抗体减毒病毒免疫检查载体系统肿瘤细胞嵌合水疱性口炎病毒特异性免疫应答病毒载体系统哺乳动物细胞结合肿瘤细胞免疫抑制作用特异性抗肿瘤重组表达载体病毒弹状病毒科特异性抗体肿瘤微环境表面分子激活免疫结构基因免疫记忆药物使用遗传物质种特异性肿瘤抗原抗肿瘤抑制剂恶性肿瘤整合制备复发肿瘤复制细胞释放应用

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慢病毒肌肉注射介导人FⅧ基因在大鼠体内的表达

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中华血液学杂志 2007年第5期28卷 349-350页

作者：全贵红奇花淑金映杉金东洙延边大学基础医学院延吉133000 延边妇幼保健院韩国延世大学校保健大学临床病理学科

近来的研究表明，以HIV-1为基础构建的慢病毒（Lentivirus）载体因具有可感染非分裂细胞、转移基因片段容量较大、转染所需的病毒滴度可达10^7-10^8IU／ml、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点而受到人们关注。我们利用慢... 详细信息

近来的研究表明，以HIV-1为基础构建的慢病毒（Lentivirus）载体因具有可感染非分裂细胞、转移基因片段容量较大、转染所需的病毒滴度可达10^7-10^8IU／ml、目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点而受到人们关注。我们利用慢病毒制备含人凝血因子Ⅷ（hFW）基因的重组慢病毒，注射到正常大鼠大腿骨骼肌，测定大鼠血清中hFⅧ抗原和hFⅧ抗体水平，用PCR检测确认目的基因的存在，在正常大鼠体内构建慢病毒载体系统，探讨在动物模型中慢病毒介导肌肉注射基因治疗的可行性。

关键词：慢病毒介导 FⅧ基因肌肉注射正常大鼠体内构建病毒载体系统宿主免疫反应人凝血因子Ⅷ

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核糖核酸干扰技术在移植免疫中的应用前景

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中华器官移植杂志 2006年第4期27卷 253-254页

作者：朱珉陈刚陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究院教育部卫生部器官移植重点实验室武汉430030

核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象.自从2001年在哺乳动物培养细胞中通过小型干扰RNA(siRNA)成功诱导了特异性靶基因表达沉默后,又有学者报道[1]用病毒载体系统在原代哺乳动物细胞、干细胞和转基... 详细信息

核糖核酸干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象.自从2001年在哺乳动物培养细胞中通过小型干扰RNA(siRNA)成功诱导了特异性靶基因表达沉默后,又有学者报道[1]用病毒载体系统在原代哺乳动物细胞、干细胞和转基因小鼠上都成功实现了RNAi,更拓宽了这项技术的应用范围.虽然目前RNAi在移植学领域中的相关研究几乎处于空白阶段,但我们可以通过从相关学科RNAi的研究进展中触类旁通,探讨其在移植领域中的应用前景。

关键词：核糖核酸干扰技术移植免疫基因沉默现象哺乳动物细胞病毒载体系统 RNAi 双链RNA 靶基因表达转基因小鼠培养细胞

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腺病毒介导尿激酶型纤溶酶原激活剂转染内皮细胞的纤溶活性变化

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中华实验外科杂志 2012年第8期29卷 1620-1621页

作者：周为民吴浩荣南昌大学第二附属医院血管外科 330006 苏州大学附属第二医院普外科

我们采用pAD／CMV／V5-DESTGate—wayVector腺病毒载体系统构建尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）腺病毒载体，并将腺病毒介导的uPA基因体外转染人脐静脉内皮细胞，检测其纤溶活性及表达，为uPA的体内基因治疗奠定基础。

关键词：尿激酶型纤溶酶原激活剂人脐静脉内皮细胞腺病毒介导体外转染活性变化 uPA基因病毒载体系统腺病毒载体

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基因治疗血友病B的研究进展

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中华血液学杂志 2003年第3期24卷 167-168页

作者：何睿韩忠朝中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020

血友病B为凝血因子IX（FⅨ）基因缺陷导致缺乏凝血因子的X连锁的出血性疾病，目前治疗血友病以补充FIX为主，随着科学技术的发展，利用病毒载体携带正常的FIX基因以及适合的启动子和增强子元件到FIX基因缺陷的患者细胞内，使修饰后的细... 详细信息

血友病B为凝血因子IX（FⅨ）基因缺陷导致缺乏凝血因子的X连锁的出血性疾病，目前治疗血友病以补充FIX为主，随着科学技术的发展，利用病毒载体携带正常的FIX基因以及适合的启动子和增强子元件到FIX基因缺陷的患者细胞内，使修饰后的细胞能够长期表达有生物功能的FIX，从而维持患者循环血液中一定的凝血因子水平，最终达到治疗血友病B的目的，这就是目前最有希望治疗血友B的基因治疗法。

关键词：基因治疗高友病B 病毒载体系统动物模型靶组织

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重组腺相关病毒载体在脑缺血动物模型基因治疗中的应用

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中国脑血管病杂志 2007年第10期4卷 477-480页

作者：李照建王任直中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院神经外科 100730

脑缺血的基因治疗是颇具前景的治疗手段,以病毒为载体的基因治疗的有效性和安全性关系到最终治疗的成败.

关键词：重组腺相关病毒载体基因治疗动物模型脑缺血病毒载体系统中枢神经系统国内外研究 rAAV

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