检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：陈琳广东医科大学

学位级别：硕士

【目的】　　1.筛选和鉴定人脐静脉血管内皮细胞（ Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）衰老过程中差异表达的circRNAs，分析这些血管内皮细胞衰老相关circRNAs的基本特征。　　2.初步探讨衰老相关circRNA circCDYL对血... 详细信息

【目的】　　1.筛选和鉴定人脐静脉血管内皮细胞（ Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）衰老过程中差异表达的circRNAs，分析这些血管内皮细胞衰老相关circRNAs的基本特征。　　2.初步探讨衰老相关circRNA circCDYL对血管内皮细胞衰老的影响。　　【方法】　　1.根据 circRNA 表达丰度、差异倍数、宿主基因功能及其保守性等条件，挑选在年轻和衰老血管内皮细胞circRNA测序结果中差异表达的circRNAs。利用Primer 5软件在拼接位点附近设计反向PCR引物，qRT-PCR验证这些表达差异显著的circRNAs（差异倍数>2）。另外，利用qRT-PCR验证这些circRNAs在年轻（2~3月龄）和衰老（25~26月龄）小鼠主动脉血管组织中的表达，进一步探讨它们与血管衰老的关系。　　2.利用基因测序和RNase R消化处理，验证差异表达的circRNAs的成环结构及稳定性。　　3.在衰老的血管内皮细胞HUVECs中转染siRNA抑制circCDYL的表达，分别利用 SA-β-gal、BrdU、流式、小管形成和 western blot 等实验，观察沉默circCDYL对HUVECs细胞衰老、增殖、体外小管生成能力和衰老相关蛋白的影响。　　4.利用核质分离技术探讨 circCDYL 在年轻和衰老血管内皮细胞中的胞浆/核定位。并利用circNet和CircInteractome在线网站对其结合的miRNA进行预测，分析circCDYL-miRNA相互作用。　　【结果】　　1.年轻和衰老HUVECs细胞中差异表达circRNAs的筛选与鉴定　　qRT-PCR验证了circRNA测序结果中，在衰老HUVECs细胞表达上调且差异表达>2倍的69个circRNAs，结果表明circCDYL、circNRIP1、circAMBRA1和circDRAM1等circRNAs的表达在衰老HUVECs中显著上调，与测序结果一致。血管组织的验证结果显示，circCDYL等circRNAs在衰老小鼠主动脉血管组织中显著上调，而circAMBRA1等circRNAs在年轻和衰老小鼠主动脉血管组织中没有明显差异。　　2. circRNA的成环及稳定性分析　　PCR 产物的测序结果显示，所有检测的血管内皮细胞衰老相关的 circRNAs都含有特异的拼接序列，提示它们均具有闭合成环结构。RNase R处理的结果显示，这些circRNAs表达量未见明显降低并呈现一定的富集趋势，而其对应的宿主基因线性 mRNA 的表达量显著降低，提示 circCDYL 等血管内皮衰老相关的circRNAs具有circRNA特有的、比其线性mRNA更稳定的特征。　　3. circCDYL对血管内皮细胞衰老相关表型的影响　　在衰老HUVECs细胞抑制circCDYL的表达后，可显著下调p53和p21等衰老相关蛋白的表达，延缓HUVECs细胞衰老，促进细胞增殖和小管形成的能力。　　4. circCDYL 在年轻和衰老血管内皮细胞中的胞浆/核定位及预测其 miRNA结合位点　　circCDYL 主要分布于胞浆，且在年轻和衰老血管内皮细胞的定位均没有明显改变。circNet和CircInteractome在线网站预测circCDYL存在多个miRNA的结合位点，提示胞浆定位的circCDYL可能作为“miRNA sponge”影响miRNAs靶基因的功能，进而调控血管内皮细胞衰老。　　【结论】　　circCDYL、circNRIP1、circDRAM1和circAMBRA1等circRNAs与血管内皮细胞衰老密切相关。这些血管内皮细胞衰老相关circRNAs均具有成环结构和耐RNase R消化特性。circCDYL可促进细胞衰老，抑制细胞增殖和体外小管生成的能力。胞浆定位的circCDYL可能作为“miRNA sponge”影响miRNAs的功能，并参与血管内皮细胞衰老的调节。

关键词：血管内皮细胞衰老 circRNAs 成环结构胞浆定位调控功能

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PA28γ及其胞浆定位突变体在HepG2中的表达

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中国生物化学与分子生物学报 2010年第4期26卷 369-373页

作者：李烨吴晶晶彭彬姜孝成汪保和印大中湖南师范大学生命科学院长沙410081

本研究采用RT-PCR法从293T细胞中克隆得到PA28γcDNA全长序列,并将该片段亚克隆到pMD-18T载体中,利用定点突变获得核定位序列缺失突变的PA28γ突变体,分别将野生型(WT)和突变型(MT)PA28γ基因克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中,脂质体法转... 详细信息

本研究采用RT-PCR法从293T细胞中克隆得到PA28γcDNA全长序列,并将该片段亚克隆到pMD-18T载体中,利用定点突变获得核定位序列缺失突变的PA28γ突变体,分别将野生型(WT)和突变型(MT)PA28γ基因克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中,脂质体法转染293T细胞,荧光显微镜观察发现,在293T细胞中,PA28γWT定位在胞核中,而PA28γMT定位在胞浆中;再将野生型和突变型PA28γ基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)Flag中,用脂质体法將其转染HepG2細胞.Western印迹检测结果表明,PA28γWT和PA28γMT蛋白在HepG2细胞中获得了高效表达,建立了高表达PA28γWT和PA28γMT蛋白的HepG2细胞系.这些结果的获得,为进一步研究人类PA28γ基因的功能奠定了基础.

关键词：真核表达质粒 HepG2 PA28γ 胞浆定位

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DAXX亚细胞定位对ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡的影响

DAXX亚细胞定位对ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡的影响

引用

作者：李玲南华大学

学位级别：硕士

目的:观察DAXX的亚细胞定位对ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡的影响，为开辟以DAXX的亚细胞定位为手段，稳定斑块、防治急性冠脉综合征的新途径提供理论依据。方法：构建人源性DAXX胞核定位突变质粒DAXX（S667A）、胞浆定位突变质粒DAX... 详细信息

目的:观察DAXX的亚细胞定位对ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡的影响，为开辟以DAXX的亚细胞定位为手段，稳定斑块、防治急性冠脉综合征的新途径提供理论依据。方法：构建人源性DAXX胞核定位突变质粒DAXX（S667A）、胞浆定位突变质粒DAXX（W621A）；瞬时转染RAW264.7巨噬细胞，应用RT-PCR和Western Blot技术检测转染后细胞内DAXX的表达情况和转染效率；同时，应用免疫荧光法观察DAXX在细胞中的定位情况；转染24h后用100μg/mL ox-LDL孵育48h，诱导细胞凋亡，MTT法检测细胞活性，流式细胞术观察细胞凋亡情况。应用RT-PCR和Western Blot分别检测ASKI和JNK的mRNA和蛋白的表达情况。结果：DAXX的两个突变重组质粒DAXX（S667A）和DAXX（W621A）经琼脂糖凝胶电泳和DNA测序分析，证实突变正确，无其它突变和读码框移位。RT-PCR和Western Blot法检测转染后细胞内DAXX表达的升高有显著性差异，表明转染效率达到实验要求。免疫荧光法观察到DAXX（WT）在胞核胞浆均有表达，且主要定位于胞核；质粒DAXX(S667A)定位胞核；质粒DAXX(W621A)定位胞浆。瞬时转染24h后细胞经100μg/ml ox-LDL孵育48h，与正常对照组比较，MTT法和流式细胞术检测发现：转DAXX(W621A)组细胞活性显著下调，凋亡率明显上升（p＜0.05）；转DAXX (S667A)组细胞活性有所上调，且凋亡率下降；同时，RT-PCR和Western Blot检测发现：转DAXX(W621A)组细胞中ASK1和JNK的mRNA和蛋白表达显著高于正常组（p＜0.05），而转染DAXX (S667A)组细胞中ASK1和JNK的表达均低于正常对照组。结论：胞核定位DAXX可以抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡；胞浆定位DAXX可以增敏ox-LDL诱导的巨噬细胞凋亡；其凋亡通路可能与ASK1-JNK介导的信号通路有关。

关键词： DAXX 胞核定位胞浆定位巨噬细胞凋亡

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CTP-OD-HA融合蛋白的原核表达及其活性鉴定

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中国生物制品学杂志 2009年第2期22卷 115-119页

作者：刘钉宾黄世峰曾建明袁颖陶昆温健萍曹唯希黄宗干冯文莉重庆医科大学医学检验系临床血液学教研室临床检验诊断学教育部重点实验室重庆400016 重庆医科大学临床医学系重庆400016 Canadian Blood Services Canada 重庆医科大学临床学院血液科重庆400016

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a... 详细信息

目的构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,并检测其在人慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞株中的转导活性及胞浆定位。方法分别将胞浆转导肽(CTP)、寡聚化区域(OD)基因和流感病毒血凝素抗原表位(HA)片段依次连接入pET32a(+)质粒,构建重组原核表达质粒pCTP-OD-HA,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经亲和纯化、Western blot验证、肠激酶切割、目的蛋白回收和FITC标记后,将FITC-CTP-OD-HA融合蛋白作用于K562细胞,观察其转导活性及细胞定位。结果重组原核表达质粒pCTP-OD-HA经酶切及测序鉴定,证明构建正确。37℃,1 mmol/LIPTG诱导4h,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的35%,纯化后纯度达95%以上。FITC-CTP-OD-HA融合蛋白在K562细胞中具有高转导活性和显著的胞浆定位特性。结论已成功构建CTP-OD-HA融合基因原核表达质粒,并高效表达了目的蛋白,为进一步研究其在CML信号转导通路中的作用,阐明CML的发病机制及探讨蛋白肽在CML中的治疗策略奠定了基础。

关键词：胞浆转导肽寡聚化区域血凝素慢性粒细胞白血病原核表达转导活性胞浆定位

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CTP-β-gal融合蛋白在体内和体外的分布和动力学的研究

CTP-β-gal融合蛋白在体内和体外的分布和动力学的研究

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作者：刘钉宾重庆医科大学

学位级别：硕士

目的胞浆转导肽(cytoplasmic transduction peptide ,CTP),作为一种生物载体,能为一些由于胞浆蛋白缺陷而致的疾病提供新的治疗策略。我们前期的研究发现CTP融合BCR/ABL寡聚化区域(oligomerization domain ,OD)在慢性粒细胞白血病K562... 详细信息

目的胞浆转导肽(cytoplasmic transduction peptide ,CTP),作为一种生物载体,能为一些由于胞浆蛋白缺陷而致的疾病提供新的治疗策略。我们前期的研究发现CTP融合BCR/ABL寡聚化区域(oligomerization domain ,OD)在慢性粒细胞白血病K562细胞中对BCR/ABL癌蛋白有靶向的治疗作用。本课题拟通过评价CTP-β-gal融合蛋白在BaF3-P210细胞中的胞浆定位和酶活性能力,并测定融合蛋白在小鼠体内的动力学和组织分布,以此来探讨CTP-OD-HA融合蛋白在临床运用的可行性。方法将lacZ、CTP基因依次插入到质粒pET32a(+),通过转化、IPTG诱导融合蛋白CTP-β-gal表达,亲和层析纯化目的蛋白,最后Western blot鉴定纯化后的目的蛋白。融合蛋白CTP-β-gal转导BaF3-P210细胞,通过激光共聚焦显微镜、免疫组织化学分析和X-gal原位染色分析融合蛋白在细胞内的定位和活性能力。体内通过尾静脉注射雌性Balb/c小鼠,于注射后15min,1h,3h和24h收集肝脏、脾脏、肾脏、肺和脑组织。X-gal原位染色和定量酶活性分析检测CTP-β-gal融合蛋白在各种组织中的分布情况。结果成功构建原核表达质粒pET32a(+)-CTP-lacZ,纯化和Western blot鉴定了重组融合蛋白CTP-β-gal。激光共聚焦显微镜和免疫组织化学检测分析发现融合蛋白CTP-β-gal在BaF3-P210细胞中有很强的胞浆定位能力,且具有较高的酶活性能力。β-gal酶活性定量分析Balb/c小鼠各组织,发现CTP-β-gal融合蛋白酶活性在大多数组织中15min达高峰,仅脑组织是24h达高峰。结论本研究阐明了融合蛋白转导BaF3-P210细胞和静脉注射Balb/c小鼠后,CTP融合蛋白在细胞内的定位和酶活性能力以及在小鼠体内的动力学和组织分布情况,为CTP-OD-HA治疗CML提供了合理的理论基础,同时也为CTP融合蛋白胞浆转导发挥靶向治疗提供了实验依据。

关键词：胞浆转导肽 β-半乳糖苷酶胞浆定位组织分布酶组织化学

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蛋白酶体调节蛋白PA28γ的不同亚细胞定位对肝细胞增殖的影响

蛋白酶体调节蛋白PA28γ的不同亚细胞定位对肝细胞增殖的影响

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作者：王穗海南方医科大学

学位级别：硕士

PA28是一种蛋白酶体调节蛋白,它能结合到20S蛋白酶体的外环并促进小肽的降解,这个过程并不需要蛋白的泛素化也不需要消耗ATP,这与PA700不同,后者是一种能识别并降解泛素化蛋白的大分子复合物。目前已经有证据证明,PA28-20S蛋白酶体也能... 详细信息

PA28是一种蛋白酶体调节蛋白,它能结合到20S蛋白酶体的外环并促进小肽的降解,这个过程并不需要蛋白的泛素化也不需要消耗ATP,这与PA700不同,后者是一种能识别并降解泛素化蛋白的大分子复合物。目前已经有证据证明,PA28-20S蛋白酶体也能够降解完整的蛋白分子,如HCV-core和SRC-3。这说明PA28-20S蛋白酶体能参与重要的细胞调节过程。 PA28γ是PA28三种同系物中最保守的一种,而且PA28γ主要定位在细胞核中,这与其他两种同系物(PA28α和PA28β)主要定位在细胞质中不同,这可以认为PA28γ与其他两种同系物相比存在着很不同的生理功能。 Nikaido等人的研究认为,PA28γ的表达可能与细胞的转化和细胞的生长调节相关,他们在研究该蛋白时发现,当A31细胞被诱导分裂时PA28γ的表达量上升了10倍。Murata等人通过敲除小鼠的PA28γ基因发现,基因敲除小鼠并没有什么明显的生理损伤,但是小鼠的生长速度要比正常小鼠慢,而且体型也没有正常小鼠大,另外,通过培养这种基因敲除的小鼠的胚胎成纤维细胞发现,敲除PA28γ基因后的胚胎成纤维细胞的生长速度下降,细胞的饱和密度下降,而且还会阻止细胞周期进入S期。相似地,***等人使用RNA干扰技术抑制了果蝇细胞PA28γ的表达后发现,被抑制后的果蝇细胞部分停留在了G1期。另外有报道,PA28γ能与PCNA(proliferating cell nuclear antigen)形成复合物,而且,PA28γ高表达在快速分裂的甲状腺癌细胞中并且核定位明显,这些研究都表明,PA28γ与细胞的DNA合成以及细胞的分裂存在着一定的关系。一些实验室在对肿瘤凋亡蛋白相互作用蛋白筛选时发现B-Raf、MEKK3、FLASH(CASP8-assosiated protein 2)、Daxx、RanBPM、PIASI等细胞凋亡相关因子均能与PA28γ相互作用,而Li研究组在研究乳腺癌细胞时首次发现并证明PA28γ能与癌基因SRC-3相互作用并在体内、体外降解这种完整的内源性蛋白(Cell,2006)。随后的研究又发现了几个重要的PA28γ相互作用蛋白,包括P21、P16、P19。然而,这些学者在相应的细胞株中高表达PA28γ,对目标细胞的周期和生长没有多大影响。考虑到以上报道的PA28γ相互作用蛋白都是与肿瘤的促进和抑制相关,我们可以认为,PA28γ可能在肿瘤的发生、发展过程中起到重要的双向调节作用。然而,它如何通过调节这么多重要的癌相关基因,从而在肿瘤的发生中发挥作用的,目前还没有明确的研究数据。总的来说,对于PA28γ在细胞中的生理功能目前还是模糊的。鉴于很多重要的癌基因在肿瘤的发生过程中会发生重要的突变,于是我们考虑PA28γ在癌细胞中的基因是否也会发生重要的突变,从本科室保存的18种正常细胞株和癌细胞株中克隆全长的PA28γcDNA,测序结果显示,PA28γ在这些细胞株(正常的和癌的)中并没有发生突变。考虑到PA28γ是一种核定位蛋白(这不同于其同系物PA28α、PA28β定位在胞浆),但在细胞有丝分裂期(M期)能弥漫表达于整个细胞。我们推测:PA28γ的不同亚细胞定位对细胞不同时期有着不同的影响,与PA28γ对上述重要相互作用蛋白的精细调控密切相关,PA28γ通过这种在不同的细胞空间调控不同的蛋白或被不同的蛋白修饰,精细地调控这细胞的生理过程。因此,此次研究从构建PA28γ的基因突变体入手,从人胚肾细胞株(293T)中扩增并克隆出PA28γcDNA全长序列(自编号KL03-3),将PA28γcDNA克隆至pMD18-T克隆载体,在这基础上,对PA28γcDNA序列进行定点突变和截断,构建了KL03-15(无NLS位点)和KL03-17(无NLS和蛋白酶体结合位点)等突变体,把KL03-3、KL03-15和KL03-17分别克隆到pCDNA3.1(-)Flag哺乳动物表达载体和pDsRed-C3荧光融合表达载体中,KL03-3还克隆到pEGFP-C2绿色荧光融合表达载体中。把鉴定正确的pcDNA3.1(-)KL03-3、pcDNA3.1(-)KL03-15、pcDNA3.1(-)KL03-17分别转染到人肝癌细胞株HepG2和人正常肝细胞株Chang,并且通过压力筛选和Western Blot鉴定,构建了以上两种重组阳性表达细胞系。细胞增殖实验显示,表达KL03-3和KL03-15能促进HepG2的增殖,KL03-15比KL03-3要稍明显,而空载体、pRed和KL03-17均无促进HepG2增殖的现象。而在另一方面,表达KL03-15和KL03-17能抑制Chang的增殖,KL03-15比

关键词： PA28γ 克隆真核表达胞浆定位细胞周期增殖

来源：评论

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