检索结果-内蒙古大学图书馆

吉林大学学报（医学版） 2006年第2期32卷 228-231页

作者：刘扬马淑梅刘晓冬金顺子徐瑞明武宁赵银龙龚守良刘树铮吉林大学公共卫生学院卫生部放射生物学重点实验室吉林长春130021

目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人... 详细信息

目的:检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA(small hairpin RNA,shRNA)对人胚胎肾细胞(HEK293)中p53基因的干扰作用。方法:将人H1启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD4基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人野生型p53基因设计的shRNA被连接在H1启动子的下游,构建含有shRNA的逆转录病毒载体LTRH1-p53,即RNAi表达载体;利用流式细胞术检测逆转录病毒感染HEK293细胞72 h后细胞内P53蛋白水平的变化。结果:成功构建LTRH1-p53载体,该载体感染HEK293细胞后72 h,与感染空病毒载体LTRH1组相比,P53蛋白表达降至空病毒载体LTRH1组的69%(P<0.01)。结论:LTRH1-p53表达载体成功使p53基因沉默,shRNA表达载体的使用为基因功能研究提供有力工具。

关键词： RNA干扰基因,p53 逆转录病毒载体 shRNA

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逆转录病毒载体介导MGMT和MDR1基因增强人脐血CD34+细胞对联合化疗抗性的研究

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实验生物学报 2001年第3期34卷 227-233页

作者：王季石孙等军林果为费俭贵阳医学院附属医院血液科贵阳医学院药学系贵阳550004 复旦大学附属华山医院上海200040 中国科学院上海细胞生物学所上海200031

为探讨转染六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因(MGMT)和多药耐药基因(MDR1)的人脐血CD34^+细胞能否同时增强对卡氮芥(BCNU)和MDR1基因靶药的抗性,应用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGM... 详细信息

为探讨转染六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶基因(MGMT)和多药耐药基因(MDR1)的人脐血CD34^+细胞能否同时增强对卡氮芥(BCNU)和MDR1基因靶药的抗性,应用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)cDNA,构建双顺反子逆转录病毒载体G1Na-MGMT-IRES-MDR1,以电穿孔介导的基因转移法导入GP+E86和PA317病毒包装细胞,采用含BCNU和长春新碱(VCR)的培养基克隆选择后收集重组病毒上清于单向型GP+E86与双嗜型PA317包装细胞行乒乓交互感染,将含MGMT和MDR1双耐药基因重组病毒的上清在细胞生长因子刺激下重复感染经免疫磁珠分离系统(MACS)分离纯化后的人脐血CD34^+细胞,用PCR,RT-PCR,Southern blot,Northern blot,FACS和MTT等方法检测外源MGMT与MDR1基因在CD34^+细胞中的转移和表达。结果显示,DNA测序及酶切鉴定证实MGMTcDNA克隆和双顺反子逆转录病毒载体构建的正确性,MACS分离纯化后的人脐血CD34^+细胞纯度平均达92%,回收率为75%,含双耐药基因重组病毒的上清最高滴度为5.8×10~5cfu/ml,逆转录病毒载体介导的双耐药基因已整合入转染靶细胞中基因组并获得有效表达,同时传递不同的耐药表型,应用集落计数、PCR方法测定基因转导效率分别为18%和20%,巢式PCR及补救分析均未检测到辅助病毒存在,经双耐药基因修饰的脐血CD34^+细胞对BCNU的IC_(50)较对照组提高4.5倍,对VCR,柔红霉素(DNR)和秋水仙碱(COL)的IC_(50)较未转染细胞分别高7.8,6.6和5.5倍。本研究对降低联合化疗骨髓毒性作用的肿瘤临床研究奠定了实验基础。

关键词：逆转录病毒载体 MGMT MDR1基因 CD34+细胞联合化疗抗性耐药基因

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逆转录病毒载体介导的RNAi技术稳定抑制前列腺癌细胞株β-catenin的表达

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中南大学学报（医学版） 2005年第3期30卷 253-257页

作者：胡政蔡芳程莉娟夏昆夏家辉张灼华中南大学中国医学遗传学国家重点实验室长沙410078

目的:建立稳定抑制βcatenin基因表达的前列腺癌细胞株,为探讨Wnt/βcatenin信号在前列腺癌发生中的作用提供合适的细胞模型。方法:在βcatenin基因编码区选择3个RNAi作用的靶位点,体外合成前体DNA链,复性后连入逆转录病毒载体pSUPERret... 详细信息

目的:建立稳定抑制βcatenin基因表达的前列腺癌细胞株,为探讨Wnt/βcatenin信号在前列腺癌发生中的作用提供合适的细胞模型。方法:在βcatenin基因编码区选择3个RNAi作用的靶位点,体外合成前体DNA链,复性后连入逆转录病毒载体pSUPERretro,转染包装细胞PA317,收集含病毒颗粒的培养上清感染DU145细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后得到克隆,继续培养2个月形成稳定克隆。免疫印迹检测癌细胞内βcatenin及受其调控的靶基因cmyc和cyclinD1的表达;四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测βcatenin基因表达抑制的细胞和对照组细胞的增殖。结果:免疫印迹和RTPCR结果显示,筛选得到的2个克隆中细胞内βcatenin表达水平下降;且克隆内cmyc,cyclinD1基因的表达下调;MTT检测显示,βcatenin表达抑制的细胞克隆吸光度值下降,这表明克隆内细胞数量减少,细胞增殖受到了抑制。结论:成功建立稳定抑制βcatenin基因表达的前列腺癌细胞株。

关键词： Wnt/β—catenin RNAi 前列腺癌逆转录病毒载体稳定抑制

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逆转录病毒载体介导的HSVtk基因表达及提高重组逆转录病毒滴度的研究

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中华实验和临床病毒学杂志 2004年第4期18卷 332-336页

作者：曾赵军胡维新罗赛群陈迁中南大学湘雅医学院分子生物学研究中心长沙410078

目的　探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因表达及提高逆转录病毒滴度的措施。方法　将HSVtk基因插入逆转录病毒载体pRevTRE中 ,构建重组逆转录病毒载体。通过微乒乓感染法导入包装细胞PA317中 ,以潮霉素B筛选克... 详细信息

目的　探讨逆转录病毒载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSVtk)基因表达及提高逆转录病毒滴度的措施。方法　将HSVtk基因插入逆转录病毒载体pRevTRE中 ,构建重组逆转录病毒载体。通过微乒乓感染法导入包装细胞PA317中 ,以潮霉素B筛选克隆细胞 ,浓缩克隆细胞上清制备重组逆转录病毒。在不同时间及不同丁酸钠浓度下 ,检测分析经筛选获得阳性克隆靶细胞中有无HSVtk基因的表达及如何获得高滴度的重组病毒液。结果　成功构建了重组逆转录病毒载体RevTRE tk ,制备的重组病毒感染靶细胞后有HSVtk基因的表达。结论　通过微乒乓感染法在包装细胞PA317培养 30h和 10mmol L丁酸钠浓度下 ,经冷冻超速离心能获得携HSVtk基因的高滴度逆转录病毒颗粒 ,为其基因治疗的应用及研究奠定了基础。

关键词： HSV tk基因逆转录病毒载体高滴度表达介导包装细胞重组病毒潮霉素筛选

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逆转录病毒载体介导反义K-ras基因治疗胰腺癌的实验研究

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世界华人消化杂志 2004年第11期12卷 2627-2632页

作者：蒋奎荣刘训良苗毅卢春戴存才徐泽宽钱祝银南京医科大学第一附属医院胆胰外科江苏南京市210029 南京医科大学免疫学与微生物学系江苏省南京市210029

目的:分离及克隆胰腺癌细胞基因组中K-ras基因片段,构建含反义K-ras癌基因逆转录病毒载体并探讨其对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响及可能的分子机制. 方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI 和EcoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3... 详细信息

目的:分离及克隆胰腺癌细胞基因组中K-ras基因片段,构建含反义K-ras癌基因逆转录病毒载体并探讨其对胰腺癌细胞增生、凋亡的影响及可能的分子机制. 方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI 和EcoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3、PC-3基因组DNA为模板扩增K-ras基因外显子1、4及侧翼序列,将目的基因克隆入逆转录病毒载体pLXSN中,构建重组质粒,经PT-67细胞包装后获得重组逆转录病毒.将该重组逆转录病毒转染上述细胞,经G418筛选获得稳定细胞,应用MTT、流式细胞仪和免疫组化法分别研究其增生、凋亡和对胰腺癌p21蛋白表达;建立胰腺癌裸鼠移植瘤模型,观察反义K-ras基因体内治疗效果. 结果:成功构建含反义K-ras基因的重组逆转录病毒载体.反义K-ras基因抑制胰腺癌细胞增生,诱导细胞凋亡、下调K-rasmRNA和P21蛋白表达,并抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生长. 结论:反义K-ras基因可使胰腺癌细胞增生受到抑制,并可诱导细胞凋亡和下调K-rasmRNA和P21蛋白表达.

关键词：逆转录病毒载体介导反义K—ras基因治疗胰腺癌实验研究

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逆转录病毒载体介导的GFP基因在四种细胞株中的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2002年第4期18卷 349-350页

作者：郭志兵黄洪莲刁志宏王小宁成都军区总医院检验科四川成都610058 第一军医大学分子免疫研究所广东广州510515 广州军区总医院广东广州510072

基因治疗中 ,所用的目的细胞通常为哺乳动物的细胞 ,体外培养条件要求高。传统的转基因细胞的筛选对细胞损伤大 ,且比较费时。ＧＦＰ是一种新型的报道基因 ,目前已在多种细菌和真菌中有效表达 ,如果ＧＦＰ能在多种哺乳动物细胞中广泛而... 详细信息

基因治疗中 ,所用的目的细胞通常为哺乳动物的细胞 ,体外培养条件要求高。传统的转基因细胞的筛选对细胞损伤大 ,且比较费时。ＧＦＰ是一种新型的报道基因 ,目前已在多种细菌和真菌中有效表达 ,如果ＧＦＰ能在多种哺乳动物细胞中广泛而高效的表达 ,我们就可以利用流式细胞仪等设备 ,将其用于基因治疗的转基因细胞快速分离。利用逆转录病毒载体 ,对哺乳动物细胞进行基因转移是一种高效的方法。我们利用同时含有新霉素抗性基因 (ＮｅｏＲ)、ＧＦＰ报道基因和ＨＳＶＴＫ目的基因多顺反子重组逆转录病毒载体ＧＣＧＰＴＫＳＮ ,转染Ｋ5 6 2、ＮＳ 1、ＥＬ4及Ｓｐ2 / 0细胞株 ,通过荧光显微镜观察 ,研究了ＧＦＰ

关键词： GFP 逆转录病毒载体报道基因转染

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逆转录病毒载体在基因工程疫苗方面的应用

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中国生物工程杂志 2010年第6期30卷 130-133页

作者：张继文杨桂连王春凤吉林农业大学动物科学技术学院长春130118

逆转录病毒载体是根据逆转录病毒的特性设计出的一种病毒表达载体,以其能够整合到宿主细胞染色体上并能稳定表达目的基因而被视为基因运载最有效的工具。目前广泛应用于基因治疗、外源基因表达、基因工程疫苗等方面。主要综述了逆转录... 详细信息

逆转录病毒载体是根据逆转录病毒的特性设计出的一种病毒表达载体,以其能够整合到宿主细胞染色体上并能稳定表达目的基因而被视为基因运载最有效的工具。目前广泛应用于基因治疗、外源基因表达、基因工程疫苗等方面。主要综述了逆转录病毒载体在基因工程疫苗方面的应用现状及前景,为该载体在生物医学领域方面的应用提供有价值的参考。

关键词：逆转录病毒载体基因工程亚单位疫苗 DNA疫苗

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逆转录病毒载体介导的人白细胞介素10在大鼠心肌细胞的表达

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中国免疫学杂志 1999年第8期15卷 348-351页

作者：李锦华陈永雄张仕光廖晓星中山医科大学附属第一医院急诊科中山医科大学附属第一医院肾脏研究所

目的：建立一个在大鼠心肌细胞表达人白细胞介素１０（ＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１０，ｈＩＬ１０）的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为下一步的研究工作做准备。方法：将构建的表达人白细胞介素１０的逆转录病毒重组体ｐ... 详细信息

目的：建立一个在大鼠心肌细胞表达人白细胞介素１０（ＨｕｍａｎＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１０，ｈＩＬ１０）的重组逆转录病毒载体基因转移系统，为下一步的研究工作做准备。方法：将构建的表达人白细胞介素１０的逆转录病毒重组体ｐＬＸ（ｈＩＬ１０）ＳＮ经ＰＡ３１７细胞包装，Ｇ４１８筛选，ＮＩＨ３Ｔ３细胞进行病毒滴度测定，选滴度最高的克隆（６×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）作为感染大鼠心肌细胞的感染细胞；用重组逆转录病毒感染大鼠心肌细胞，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测转染大鼠心肌细胞ＤＮＡ及ｍＲＮＡ，应用ＥＬＩＳＡ测定ｈＩＬ１０在心肌细胞的表达。结果：外源性ｈＩＬ１０基因已整合到心肌细胞染色体ＤＮＡ并有效地转录和翻译，表达水平最高达１７５５ｎｇ／（１０６ｃｅｌｓ·２４ｈ）。结论：外源性ｈＩＬ１０基因可以转移到大鼠心肌细胞并稳定表达，为今后研究ｈＩＬ１０的作用机制及在治疗疾病中的应用打下了基础。

关键词：基因转移逆转录病毒载体心肌细胞 IC-10

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逆转录病毒载体导入重组ICAD和ICAD-DM对STS诱导大鼠C6细胞凋亡的影响

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武汉大学学报（理学版） 2004年第2期50卷 223-228页

作者：张雯张百芳彭芳芳武栋成武汉大学医学院湖北武汉430071

为了观察caspase依赖的脱氧核糖核酸酶(CAD)及其抑制剂ICAD对星形孢菌素(STS)诱导的C6细胞凋亡的影响,用含有ICAD/DFF45和caspase抗性的ICAD/DFF45突变体ICAD DM基因的复制缺陷型逆转录病毒载体转染包装细胞,并用产生的病毒感染大鼠神... 详细信息

为了观察caspase依赖的脱氧核糖核酸酶(CAD)及其抑制剂ICAD对星形孢菌素(STS)诱导的C6细胞凋亡的影响,用含有ICAD/DFF45和caspase抗性的ICAD/DFF45突变体ICAD DM基因的复制缺陷型逆转录病毒载体转染包装细胞,并用产生的病毒感染大鼠神经胶质瘤细胞株C6,筛选获得稳定表达目的蛋白的细胞.结果发现STS可显著诱导ICAD组的C6细胞出现DNA凋亡梯带,而ICAD DM组不出现DNA凋亡梯带;与ICAD DM组相比,STS对ICAD组MTT代谢的抑制作用更强(P<0.05);透射电镜观察显示ICAD DM组的细胞核形态改变弱于ICAD组.表明ICAD/DFF45的切割应在CAD/DFF40的激活中占主导地位,抑制ICAD/DFF45的切割并不能阻止凋亡的发生,但可延迟细胞死亡的速度,对染色质凝聚和核固缩的出现亦有一定抑制作用.

关键词：逆转录病毒载体 caspase依赖脱氧核糖核酸酶 CAD抑制剂星形孢菌素细胞凋亡

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逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

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中华实验和临床病毒学杂志 1997年第4期11卷 325-328页

作者：季伟王勤环斯崇文张国庆刘丹解解放军302医院感染四科北京医科大学第一临床医学院感染疾病科

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，... 详细信息

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达。

关键词：基因治疗逆转录病毒载体 HBV 乙型肝炎

来源：评论

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