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生物工程学报 2011年第7期27卷 990-997页

作者：汤晖石楠于淼刘龙刘静贾颖牛宏彦张利平河北大学生命科学学院河北省微生物多样性研究与应用实验室保定071002

三孢布拉氏霉菌CarRA蛋白,既有番茄红素环化酶功能活性又有八氢番茄红素合成酶功能活性,为了对CarRA蛋白进行双功能活性分析,及探测CarRA蛋白的番茄红素环化酶功能活性位点,构建了在大肠杆菌体内通过颜色互补检测两种酶活性的系统。通... 详细信息

三孢布拉氏霉菌CarRA蛋白,既有番茄红素环化酶功能活性又有八氢番茄红素合成酶功能活性,为了对CarRA蛋白进行双功能活性分析,及探测CarRA蛋白的番茄红素环化酶功能活性位点,构建了在大肠杆菌体内通过颜色互补检测两种酶活性的系统。通过重叠延伸pcr的方法克隆得到了carRA基因,并构建原核表达载体pET28a-carRA,与携带crtI/crtB/crtE基因簇的质粒pAC-LYC共转化BL21(DE3),验证番茄红素环化酶功能活性;与以pAC-LYC为基础构建的携带crtI/crtE基因簇的质粒pAC-LYC△(crtB)共转化BL21(DE3),验证八氢番茄红素合成酶功能活性。通过颜色互补的初步鉴定,再以HPLC对代谢产物进行分析,明确了实验中的CarRA蛋白功能活性检测系统的可靠性,为定点突变番茄红素环化酶活性位点而不影响八氢番茄红素合成酶功能活性提供了筛选模型。

关键词：重叠延伸pcr carRA基因番茄红素环化酶八氢番茄红素合成酶

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重叠延伸pcr法克隆人脂联素基因及其在毕赤酵母中表达

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生物工程学报 2008年第8期24卷 1480-1484页

作者：张变玲张儒姬婧媛薛柯荆二勇张展鹏尉亚辉西北大学生命科学学院西部资源生物与现代生物技术省部共建教育部重点实验室西安710069 湖南工程学院化学化工系湘潭411104

利用重叠延伸pcr法克隆出人脂联素基因,连接至克隆载体pGEM-T中,转化大肠杆菌DH5α,通过测序对其进行序列分析后,进一步构建毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN,通过电击法转化毕赤酵母GS115,转化的重组酵母菌用甲醇诱导外源基因表达。经pcr... 详细信息

利用重叠延伸pcr法克隆出人脂联素基因,连接至克隆载体pGEM-T中,转化大肠杆菌DH5α,通过测序对其进行序列分析后,进一步构建毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN,通过电击法转化毕赤酵母GS115,转化的重组酵母菌用甲醇诱导外源基因表达。经pcr、Southern blotting鉴定,获得了重组毕赤酵母菌株;经甲醇诱导人脂联素基因表达,Western blotting杂交鉴定证明人脂联素基因已经在毕赤酵母中成功表达。结果表明重叠延伸pcr法准确方便克隆出人脂联素基因,在30oC,1%甲醇诱导48h,人脂联素基因在巴斯德毕赤酵母中的表达最佳。

关键词：人脂联素重叠延伸pcr 巴斯德毕赤酵母 Southern blotting Western blotting

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重叠延伸pcr技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化

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吉林大学学报（医学版） 2022年第5期48卷 1109-1115页

作者：焦凤娟刘俊杰卢思维姜东君济宁医学院精神卫生学院山东省行为医学重点实验室山东济宁272067

目的:基于重叠延伸pcr(SOE pcr)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE pcr技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n... 详细信息

目的:基于重叠延伸pcr(SOE pcr)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化。方法:根据SOE pcr技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物F_(n)和R_(n)进行第1步pcr扩增,获得含突变位点的产物1和产物2。经第2步pcr退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步pcr扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果。于大肠杆菌(***)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达。Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量。结果:第1步pcr扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步pcr退火延伸和第3步pcr扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段。双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致。DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸(TCT)成功突变为丙氨酸(GCT)。在0.5 mmol·L^(-1)IPTG、16℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达。SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确。结论:利用SOE pcr技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在***中成功表达。

关键词：转录因子EB 重叠延伸pcr 定点突变融合蛋白丝氨酸丙氨酸

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重叠延伸pcr法构建小菜蛾化学感受蛋白1基因突变体研究

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2011年第1期39卷 119-125页

作者：任珍珍刘晶晶柳晓磊陈永李珣胡美英华南农业大学昆虫毒理研究室广东广州510642

【目的】探索重叠延伸pcr法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与... 详细信息

【目的】探索重叠延伸pcr法在昆虫化学感受蛋白基因点突变上的应用,研究半胱氨酸(Cys32)对小菜蛾(Plutella xylostella)化学感受蛋白1(PlxyCSP1)结合特性的影响。【方法】用计算机软件模拟PlxyCSP1上Cys32突变前后的蛋白三级结构以及与配体化合物的结合情况,确定点突变位点。根据扩增得到的PlxyCSP1序列设计并合成重叠引物,利用重叠延伸pcr法,将PlxyCSP1上的Cys32突变成色氨酸(Trp32),获得突变体PlxyCSP1-M。将突变后的基因与载体pET-32a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)。【结果】分子对接图显示,配体可以顺利进入PlxyCSP1的结合口袋,而无法进入PlxyCSP1-M的结合口袋。结合能预测显示,配体化合物与PlxyCSP1的结合能均为正值,与PlxyCSP1-M的结合能均为0。突变后的重组质粒测序结果表明,Cys32(TGC)已突变为Trp32(TGG),经IPTG诱导,该菌表达了分子质量约为36 ku的融合蛋白。【结论】Cys32是影响PlxyCSP1结构和功能的重要氨基酸残基。Cys32突变为Trp32后,PlxyCSP1-M结合特性发生了变化,不能与配体化合物正常结合。

关键词：小菜蛾化学感受蛋白1 重叠延伸pcr 原核表达同源建模分子对接

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重叠延伸pcr克隆拟南芥ACCase基因和植物表达载体构建

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中国油料作物学报 2009年第4期31卷 407-412,420页

作者：胡亚平夏玉平吴刚武玉花肖玲李均卢长明中国农业科学院油料作物研究所农业部油料作物生物学重点开放实验室湖北武汉430062

植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7 000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规pcr将... 详细信息

植物的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成的第一步,该步骤是种子脂肪酸合成与含油量形成的关键调控步骤。拟南芥中的真核形式ACCase基因cDNA长约7 000bp,难以直接克隆。本研究先通过常规pcr将其cDNA分成八个重叠的片段分别扩增出来,再用重叠延伸pcr将得到的片段逐步拼接成长度为6 890bp的完整的基因序列,测序证实克隆序列正确无误,最后将其克隆到农杆菌转化植物的载体上。序列分析发现ACCase基因的开放阅读框长度为6 765bp,编码一个含2 254个氨基酸残基的多肽链,推测其分子量约为250kDa。ACCase基因的成功克隆为利用该基因调控油料作物的含油量奠定了良好基础,同时为克隆长度较大的基因提供了一种经济可行的方法。

关键词：重叠延伸pcr 乙酰辅酶A羧化酶基因克隆

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重叠延伸pcr法扩增猪囊尾蚴AgB基因及其在BHK-21细胞中的表达

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中国农业科学 2009年第7期42卷 2572-2578页

作者：郭爱疆才学鹏贾万忠房永祥乔军刘红霞潘小梅景志忠中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室

【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用RT-pcr法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸pcr法(splicing overlap extension pcr method,SOE-pcr)把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构... 详细信息

【目的】克隆猪囊尾蚴AgB基因并在体外细胞中表达。【方法】采用RT-pcr法分别扩增AgB基因的上半段和下半段序列。采用重叠延伸pcr法(splicing overlap extension pcr method,SOE-pcr)把具有35个相同碱基的上下半段扩增为全长基因,并构建到真核表达载体pVAX1,将酶切、pcr、测序鉴定的阳性质粒经脂质体转染BHK-21细胞。通过SDS-PAGE、Western-blotting、间接免疫荧光法,检测细胞中B抗原的表达。【结果】琼脂糖凝胶电泳显示扩增的不同片段大小分别与预期的相同。重组表达载体转染BHK细胞后有荧光出现。表达的蛋白能被猪囊尾蚴病阳性血清所识别。【结论】通过重叠延伸pcr法成功扩增了AgB基因全长并构建到真核表达载体,目的蛋白在BHK-21细胞中表达。

关键词：猪囊尾蚴 AgB基因重叠延伸pcr 真核表达 BHK-21

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重叠延伸pcr合成风疹病毒E1蛋白抗原肽基因及其表达

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细胞与分子免疫学杂志 2012年第8期28卷 830-833页

作者：芦春斌邱建阁马贞丽暨南大学生命科学技术学院广东广州510632

目的:利用重叠延伸pcr合成风疹病毒E1基因的抗原肽段,构建其原核表达载体并表达蛋白,为进一步获得高质量的rE1重组抗原肽奠定基础。方法:利用软件对风疹病毒E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计... 详细信息

目的:利用重叠延伸pcr合成风疹病毒E1基因的抗原肽段,构建其原核表达载体并表达蛋白,为进一步获得高质量的rE1重组抗原肽奠定基础。方法:利用软件对风疹病毒E1基因进行生物信息学分析,根据大肠杆菌密码子偏爱性对其密码子进行优化;设计多对寡核苷酸引物,以重叠延伸pcr法合成相应抗原肽段,克隆后测序鉴定。再以酶切连接的方法将合成的抗原肽序列克隆导入原核表达载体pET32a;利用IPTG诱导抗原肽段的表达,SDS-PAGE和West-ern blot法分析表达产物。结果:经过6轮重叠延伸pcr扩增,成功获得与预期目的序列一致的风疹病毒E1基因抗原肽并构建获得重组质粒pET32-rE1;在37℃下分别以终浓度为1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG诱导抗原肽表达,SDS-PAGE和Western blot法检测到预期的蛋白条带;且以IPTG终浓度为1 mmol/L诱导6 h后表达量最高。结论:成功合成了密码子优化的风疹病毒E1基因抗原肽段,构建其原核表达载体pET32-rE1并表达该抗原肽。

关键词：风疹病毒E1基因抗原肽重叠延伸pcr 密码子优化原核表达

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重叠延伸pcr法构建VPS4B基因定点突变真核表达载体

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临床检验杂志 2011年第1期29卷 57-59页

作者：王维鹏夏剑波李磊郝友华杨东亮华中科技大学同济医学院附属同济医院临床免疫研究室武汉430030 湖北省妇幼保健院检验科武汉430070

目的构建含液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)基因定点突变的真核表达载体。方法用RT-pcr法从HuH-7细胞中扩增VPS4B基因,并克隆到真核载体pXF3H上。采用重叠延伸pcr定点突变技术,构建K180Q和E235Q两种突变质粒,经DNA测序确证定点突变的结果,... 详细信息

目的构建含液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)基因定点突变的真核表达载体。方法用RT-pcr法从HuH-7细胞中扩增VPS4B基因,并克隆到真核载体pXF3H上。采用重叠延伸pcr定点突变技术,构建K180Q和E235Q两种突变质粒,经DNA测序确证定点突变的结果,再将VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞,western blot检测融合蛋白表达。结果克隆了VPS4基因,构建了真核载体pXF3H-VPS4B,经重叠延伸pcr得到突变体。DNA测序结果显示,编码180位氨基酸的538～540位碱基由AAG突变为CAG;编码235位氨基酸的703～705位碱基由GAA突变为CAA,其他碱基均无突变。VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞可检出HA-VPS4B融合蛋白表达。结论成功构建了VPS4以及K180Q和E235Q两种突变的真核表达载体。

关键词：细胞液泡蛋白质分选因子4B 重叠延伸pcr 定点突变真核表达载体

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重叠延伸pcr技术构建β-环糊精葡糖基转移酶基因的定点突变原核表达载体

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食品工业科技 2013年第19期34卷 145-147,151页

作者：王华文一于寒松朴春红王玉华刘俊梅胡耀辉内蒙古民族大学生命科学学院内蒙古通辽028000 环境保护部环境规划院北京100012 吉林农业大学食品学院吉林长春130118

采用重叠延伸pcr技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经pcr鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒... 详细信息

采用重叠延伸pcr技术对环糊精葡萄糖基转移酶基因序列中保守区域的二个氨基酸位点Y127,R254进行体外基因定点突变。将突变基因分别亚克隆进pUC-18,经pcr鉴定及序列分析,所转化的Escherichia coli BL21(DE3)中含有插入的突变基因重组质粒,结果表明成功构建了Y127F、R254F二个突变基因的重组表达载体。

关键词： β-环糊精葡糖糖基转移酶重叠延伸pcr 定点突变原核表达载体构建

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重叠延伸pcr法体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ

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畜牧兽医学报 2006年第10期37卷 1047-1052页

作者：李新生闫若潜高风山方勤美郝惠芳李云岗陈红英夏春中国农业大学动物医学院农业部预防兽医学重点实验室北京100094 河南省兽医防治站郑州450002 河南农业大学牧医工程学院郑州450002

本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ)重链(α链)胞外区与轻链(β2m)成熟肽的重组嵌合分子。采用RT-pcr法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列;采用重叠延伸pcr(Splicing overlap extension pcr method,... 详细信息

本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ)重链(α链)胞外区与轻链(β2m)成熟肽的重组嵌合分子。采用RT-pcr法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列;采用重叠延伸pcr(Splicing overlap extension pcr method,SOE-pcr)把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT-pcr可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因,大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物,以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列pcr产物的混合物作为模板,进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段;测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连,阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-pcr是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。

关键词：鸡主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ) 重链轻链重叠延伸pcr

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