本课题组从2001年起承担了河南省卫生厅省科技创新人才项目“微囊包裹肾上腺髓质细胞移植抑制疼痛的基础与临床研究”以来,从2001年起至今已进行了将近7年的研究历程。现对研究工作情况技术、方法、方案作以总体介绍： (1)采用胶原酶消化、密度梯度离心及二次接种纯化等方法获得牛肾上腺髓质嗜铬细胞。培养牛肾上腺嗜铬细胞,将其移植到大鼠的蛛网膜下腔。采用125I标记的放射免疫技术测定脑啡肽浓度,使用高效液相色谱仪检测儿茶酚胺的浓度。用甩尾实验检测大鼠对急性热刺激的反应;用福尔马林实验检测大鼠急性痛和慢性痛两阶段的行为学反应。用免疫组化法检测大鼠脊髓fos蛋白表达的变化。 (2)静电微囊制作仪制作APA(海藻酸钠－多聚赖氨酸－海藻酸钠)微囊。APA微囊包裹牛肾上腺嗜铬细胞,体外培养囊化细胞观察生长状况,检测囊膜对目的基因产物脑啡肽的通透性。将制备好的囊化细胞移植到大鼠的蛛网膜下腔,采用125I标记的放射免疫技术测定灌洗脑脊液亮氨酸脑啡肽含量,使用高效液相色谱仪检测儿茶酚胺的浓度;检测脊髓内c-fos蛋白表达含量;甩尾实验及福尔马林炎性实验检测大鼠的热痛域。 (3)提取大鼠、人脑组织总RNA,根据GenBank报道的大鼠前脑啡肽原基因序列(NM 017139)、人前脑啡肽原基因序列( NM_006211 ), 使用Primer5.0分别设计引物,反转录得到单链cDNA,PCR扩增反转录产物。与基因Bank上的序列对比,序列一致。构建成四种重组载体质粒。pLNCX2-rPENK、pLNCX2- hPENK、pCDNA3.1(+)-hPENK、EGfP/C2-hPENK 载体。 (4)成功制备转前脑啡肽原基因细胞系。脂质体包裹pLNCX2- rPENK后转染病毒包装细胞PT67,G418筛选出了产病毒的阳性克隆。用含病毒的上清进行病毒滴度测定,检测到8×108CfU/L的产病毒PT67细胞株。用含病毒的上清感染NIH3T3细胞,G418筛选出了阳性细胞。提取阳性NIH3T3细胞的基因组DNA,并以neor引物做PCR,得到270bp左右的片段。以大鼠、人前脑啡肽原基因为摸板,制做探针,原位杂交检测人前脑啡肽原基因的mRNA。验证转前脑啡肽原基因细胞系构建成功。 (5)制作神经性疼痛动物模型(CCI模型),通过自发性疼痛,热痛敏,冷痛敏判断模型成功。空囊组、转前脑啡肽原基因细胞组、微囊化转前脑啡肽原基因细胞组分别植入CCI模型：对比观察热痛阈变化的规律。用放射免疫法检测脑脊液灌流液中脑啡肽含量的变化、用免疫组化法(热修复)检测各组大鼠脊髓背角NR2B蛋白表达情况。 该研究应用于医疗卫生领域。全世界每年新发癌症患者1000万,其中30～50﹪伴有不同程度的疼痛。有癌症疼痛的患者中,50﹪有中等程度或剧烈的疼痛,有30﹪的患者有剧烈的或难以忍受的疼痛。难治性顽固疼痛,尤其晚期癌痛,缺乏有效的治疗方法。因此,本研究探索基因工程方法治疗疼痛,为疼痛的治疗提供了新的思路和途径,拥有广泛的应用前景。 与2006年发表在Transplantation proceedings上的：Intrathecal implants of microencapsulated xenogenic chromaffin cells provide a long-term source of analgesic substances;2005年发表在Cell Transplant上的Intrathecal grafting of porcine chromaffin cells reduces formalin-evoked c-fos expression in the rat spinal cord等相比,我们的研究APA微囊包裹肾上腺嗜铬细胞移植镇痛更早,而且克服了嗜铬细胞来源有限、原代培养困难、不易传代等缺陷。与2006年湘雅医院发表的Intrathecal administration of HSV-I amplicon vector-mediated HPPE gene therapy of nocicepion in rats with formalin pain ;2006年发表在Mol Pain上的Intrathecal long-term gene expression by self-complementary adeno-associated virus type 1 suitable for chronic pain studies in rats;2001年发表在Gene Ther上的：Antinociceptive effect of a genomic herpes simplex virus-based vector express
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