检索结果-内蒙古大学图书馆

中华微生物学和免疫学杂志 2012年第11期32卷 961-966页

作者：梁宇靳玉琴张靖陈实李启明北京生物制品研究所第六研究室 100024

目的以拟多形假丝酵母菌（ATCC26012）为材料，构建遗传稳定性良好的尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型工程化菌株。方法利用物化及基因工程等方法对拟多形假丝酵母菌株的染色体进行改造，将ura3基因和leu2基因进行定向诱变，以获得尿嘧啶和... 详细信息

目的以拟多形假丝酵母菌（ATCC26012）为材料，构建遗传稳定性良好的尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型工程化菌株。方法利用物化及基因工程等方法对拟多形假丝酵母菌株的染色体进行改造，将ura3基因和leu2基因进行定向诱变，以获得尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型突变菌株，并对其进行生物学鉴定，包括菌株的遗传稳定性、基因序列及生理生化特征分析等。结果筛选得到尿嘧啶和亮氨酸双营养缺陷型突变菌株，鉴定结果显示该菌株遗传稳定性良好，标志基因均发生定向改变，生理生化结果显示该菌株能利用多种碳源和氮源，且生长状况良好。结论拟多形假丝酵母的双营养缺陷型工程化改造为进一步研究该菌株的遗传学奠定了基础，为多价蛋白组成类病毒颗粒的外源表达提供了工程化宿主。进而，为复杂疫苗抗原的重组表达和功能研究提供了技术手段。

关键词：拟多形假丝酵母菌营养缺陷型 ura3基因 leu2基因

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重组结核抗原痘苗病毒Ankara株的构建及其免疫原性研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第9期28卷 812-817页

作者：楼觉人张群朱琳上海生物制品研究所第二研究室 200052

目的构建5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒，并研究其特异免疫原性。方法运用同源重组技术将含结核分泌抗原Ag85A和ESAT-6的基因片段插入痘苗病毒表达质粒p18中。重组质粒导入痘苗病毒Ankara（MVA）后构建重组痘苗病毒... 详细信息

目的构建5种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组痘苗病毒，并研究其特异免疫原性。方法运用同源重组技术将含结核分泌抗原Ag85A和ESAT-6的基因片段插入痘苗病毒表达质粒p18中。重组质粒导入痘苗病毒Ankara（MVA）后构建重组痘苗病毒，经筛选和Western blot鉴定，得到5个种类的带有结核抗原基因的重组病毒。用构建的5种重组病毒免疫小鼠，MTT法检测免疫后小鼠脾淋巴细胞对特异结核抗原的增殖反应；ELISA检测小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ的含量；结核菌素纯蛋白衍化物（PPD）皮内试验以检测重组病毒引发的针对结核抗原的特异细胞免疫应答。结果构建的5种重组病毒介导的细胞表达产物经Western blot鉴定确认相对分子质量与结核抗原一致。免疫小鼠两次后，5种重组病毒免疫组脾淋巴细胞体外与Ag85A—ESAT-6融合蛋白共培养后表现出明显的增殖活性（P〈0．01），培养上清液中IFN-γ的浓度均较同组细胞经生理盐水刺激明显增高（P〈0．05）；与空痘苗病毒或生理盐水免疫后小鼠相比，5种重组MVA免疫组脾淋巴细胞与Ag85A-ESAT-6融合蛋白共培养后同样表现出明显的增殖活性（P〈0．01），与Ag85A—ESAT-6融合蛋白共培养的细胞上清液中IFN-γ的浓度均升高（P〈0．01）。与空痘苗病毒或生理盐水免疫后小鼠相比，5种重组MVA免疫组小鼠对PPD都表现出显著的迟发型超敏反应应答（P〈0．05）。结论成功构建了5种不同类型的表达结核杆菌抗原的重组痘苗病毒疫苗，其免疫小鼠后可激发针对结核杆菌抗原的特异性细胞免疫。

关键词：结核重组痘苗病毒Ankara 疫苗免疫原性

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表达轮状病毒类病毒颗粒的重组毕赤酵母的制备及鉴定

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中国生物制品学杂志 2011年第7期24卷 818-823页

作者：张群楼觉人上海生物制品研究所第二研究室上海200052

目的制备表达轮状病毒(Rotavirus,RV)类病毒颗粒(Virus-like particle,VLP)的重组巴斯德毕赤酵母。方法优化并合成人RV VP2、VP6、VP4(P8血清型)和VP7(G1血清型)结构基因,分别转入改造的pPIC3.5K质粒,构建pPIC3.5K改-VP7-VP6-VP2-VP4共表达质粒,即重组G1P8质粒,电转化毕赤酵母GS115菌株,甲醇诱导表达。表达产物经Western blot鉴定,并经蔗糖密度梯度离心、分子筛层析和透射电镜观察,分析VLP的形成。结果所构建的重组G1P8质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约41 000;发酵破菌液经分子筛纯化,在180 ml洗脱体积处出现的色谱峰经Western blot鉴定和透射电镜观察,为RV VLP形成的蛋白峰。结论已成功构建了表达RV VLP的重组毕赤酵母菌株,并初步观察到了VLP,为开发新的RV疫苗奠定了基础。

关键词：轮状病毒属类病毒毕赤酵母

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重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白的原核表达、纯化及其生物活性

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中国生物制品学杂志 2010年第11期23卷 1153-1157页

作者：张群朱琳楼觉人上海生物制品研究所第二研究室上海200052

目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂... 详细信息

目的原核表达、纯化重组结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,并检测其生物活性。方法将Ag85a-ESAT6融合基因片段插入pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物在变性条件下经Ni-琼脂糖凝胶层析柱纯化复性后,在体外对经5种不同类型的表达结核杆菌Ag85a和ESAT6的重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞进行刺激,以MTT法检测脾淋巴细胞的增殖反应。结果重组质粒pET-28a-Ag85a-ESAT6经双酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约41000,主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的55.65%;纯化复性的重组融合蛋白纯度达95%以上,表达量约为1.2g/L发酵液,且具有良好的反应原性;与空痘苗病毒或生理盐水免疫的小鼠相比,5种重组痘苗病毒免疫的小鼠脾淋巴细胞与Ag85a-ESAT6融合蛋白共培养后,增殖活性明显升高(P<0.01)。结论成功利用原核系统表达了结核杆菌Ag85a-ESAT6融合蛋白,纯化复性的Ag85a-ESAT6融合蛋白具有生物学活性。

关键词：分枝杆菌,结核 Ag85a ESAT6 原核细胞基因表达生物活性

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C群和W_(135)群脑膜炎球菌发酵工艺的优化

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中国生物制品学杂志 2009年第8期22卷 782-785页

作者：江元翔荣家康朱为上海生物制品研究所第三研究室上海200052

目的优化C群和W135群脑膜炎球菌的发酵工艺,提高荚膜多糖产量。方法在5L发酵罐中,通过调整溶氧(DO)、pH值、培养温度、葡萄糖补料速率等参数,了解C群和W135群脑膜炎球菌在发酵过程中的代谢规律,优化发酵工艺,并将C群脑膜炎球菌在100L发... 详细信息

目的优化C群和W135群脑膜炎球菌的发酵工艺,提高荚膜多糖产量。方法在5L发酵罐中,通过调整溶氧(DO)、pH值、培养温度、葡萄糖补料速率等参数,了解C群和W135群脑膜炎球菌在发酵过程中的代谢规律,优化发酵工艺,并将C群脑膜炎球菌在100L发酵罐中放大发酵。结果在发酵过程中,DO在20%～40%范围内对多糖合成无明显影响;在pH6.6左右,培养温度37℃,有利于多糖合成;发酵中间补加葡萄糖可增加多糖合成,低速补糖较高速补糖更有利于多糖合成。C群脑膜炎球菌在100L罐中放大发酵,多糖产量可达5L罐水平。结论通过参数优化,确定了C群和W135群脑膜炎球菌的最佳发酵工艺。

关键词：脑膜炎球菌 C群 W135群发酵荚膜多糖

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多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

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中国生物制品学杂志 2008年第3期21卷 207-211页

作者：何成蔡蓓蓓楼觉人上海生物制品研究所第二研究室上海200052

目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化... 详细信息

目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化,获得纯化HBsAg颗粒,并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测,显示出良好的特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。

关键词：乙型肝炎表面抗原多拷贝数毕赤酵母

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冻干A群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的稳定性及氢氧化铝佐剂复溶疫苗的免疫效果

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中国生物制品学杂志 2010年第12期23卷 1347-1349,1356页

作者：朱为毕慧王月红王晓上海生物制品研究所第三研究室上海200052

目的观察冻干A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗的稳定性,并比较A(lOH)3佐剂和磷酸盐缓冲液(PBS)复溶疫苗的免疫效果。方法将冻干疫苗于2～8℃放置36个月,每隔6个月取样,测定游离多糖含量、分子大小等,观察疫苗的稳定性。分别用A(... 详细信息

目的观察冻干A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合疫苗的稳定性,并比较A(lOH)3佐剂和磷酸盐缓冲液(PBS)复溶疫苗的免疫效果。方法将冻干疫苗于2～8℃放置36个月,每隔6个月取样,测定游离多糖含量、分子大小等,观察疫苗的稳定性。分别用A(lOH)3和PBS两种稀释液复溶疫苗后,计算吸附率并免疫小鼠,采用ELISA法测定小鼠血清中抗多糖IgG抗体滴度。结果疫苗于2～8℃放置30个月,各项质量指标均合格。A(lOH)3稀释液复溶疫苗的吸附率为100%。以两种稀释液复溶的疫苗均可诱导小鼠产生高滴度的抗多糖IgG抗体及免疫记忆反应,且A(lOH)3稀释液明显优于PBS稀释液。结论冻干A群脑膜炎球菌结合疫苗具有良好的稳定性,A(lOH)3佐剂可作为其稀释液。

关键词：脑膜炎脑膜炎球菌性结合疫苗稳定性氢氧化铝免疫原性吸附

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胰高血糖素样肽-1衍生物的聚乙二醇定点修饰及其产物性质分析

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中国生物制品学杂志 2021年第7期34卷 819-823页

作者：秦荣浦田石华江筠刘敏何成杨宇峰楼觉人上海生物制品研究所第二研究室上海200051

目的用马来酰亚胺活化的相对分子质量40000的聚乙二醇(MAL-PEG40K)定点修饰胰高血糖素样肽-1衍生物(glucagon like peptide-1analogue,GLP-1a),并分析修饰产物部分性质。方法采用MAL-PEG40K定点修饰GLP-1a,强阳离子交换层析分离纯化修... 详细信息

目的用马来酰亚胺活化的相对分子质量40000的聚乙二醇(MAL-PEG40K)定点修饰胰高血糖素样肽-1衍生物(glucagon like peptide-1analogue,GLP-1a),并分析修饰产物部分性质。方法采用MAL-PEG40K定点修饰GLP-1a,强阳离子交换层析分离纯化修饰混合物,SDS-PAGE及反相高压液相色谱法(RP-HPLC)检测修饰产物MAL-PEG40KGLP-1a纯度,报告基因法检测其体外活性,动物急性降血糖试验检测其体内生物学活性。结果MAL-PEG40K-GLP-1a经SDS-PAGE及RP-HPLC分析,纯度分别为95%和98.1%,体外活性保留率为22.9%,体内具有显著降血糖作用且药效时间明显延长。结论制备的MAL-PEG40K-GLP-1a药学性质获得显著改善,有望开发为安全、长效的新型GLP-1受体激动剂。

关键词：胰高血糖素样肽-1衍生物聚乙二醇定点修饰产物性质报告基因生物学活性

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肺炎球菌表面黏附素A和表面膜蛋白A的研究进展

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中国生物制品学杂志 2011年第11期24卷 1368-1372页

作者：唐玉龙李启明北京生物制品研究所第六研究室北京100024

肺炎球菌表面黏附素A(Pneumococcal surface adhesin A,PsaA)为脂蛋白,属于ABC型转运蛋白复合物(ATPbinding cassette transporter),存在于各型肺炎球菌中,是其重要的毒力因子和黏附因子,编码基因高度保守,具有转运Mn2+及黏附功能。肺... 详细信息

肺炎球菌表面黏附素A(Pneumococcal surface adhesin A,PsaA)为脂蛋白,属于ABC型转运蛋白复合物(ATPbinding cassette transporter),存在于各型肺炎球菌中,是其重要的毒力因子和黏附因子,编码基因高度保守,具有转运Mn2+及黏附功能。肺炎球菌表面膜蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)是与其毒力相关的一种重要的表面抗原,在目前发现的所有临床分离的肺炎球菌中几乎均存在,其编码基因变异性较大。PsaA和PspA均为肺炎球菌的保护性抗原和新型肺炎球菌疫苗的研发热点之一。本文就这两种蛋白的结构、功能、免疫学特性及应用的研究进展作一综述。

关键词：链球菌肺炎表面黏附素A 表面膜蛋白A

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肺炎球菌表面蛋白A的原核表达及其作为多糖结合疫苗载体的可行性

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中国生物制品学杂志 2011年第12期24卷 1381-1384页

作者：李启明唐玉龙张学峰靳玉琴马智静张靖北京生物制品研究所第六研究室北京100024

目的原核表达肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA),并探讨其作为多糖结合疫苗候选载体的可行性。方法合成PspA基因,定向克隆至pET-30a(+)载体,构建重组表达质粒pET-30a-rPspA,转化*** Sta(rDE3)菌株,IPTG诱导表达... 详细信息

目的原核表达肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA),并探讨其作为多糖结合疫苗候选载体的可行性。方法合成PspA基因,定向克隆至pET-30a(+)载体,构建重组表达质粒pET-30a-rPspA,转化*** Sta(rDE3)菌株,IPTG诱导表达。表达产物经Ni离子亲和层析纯化后,经Western blot鉴定。取破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)及纯化的rPspA,分别与A群脑膜炎球菌多糖(Group A meningococcal capsular polysaccharide,GAMP)通过溴化氰活化法进行偶联,获得rPspA-GAMP与TT-GAMP多糖蛋白结合物,对其进行纯化及检定。多糖结合物分别以滴鼻和肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,评价其诱发的体液免疫和黏膜免疫水平。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确;表达产物主要以可溶形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%,经纯化后纯度可达90%,可与His单抗特异性结合;肌肉注射途径显示,两种蛋白载体的结合物均能诱发较高水平的体液免疫,不同载体间差异无统计学意义(P>0.05);滴鼻途径显示,载体蛋白rPspA的结合物刺激产生sIgA的能力优于传统载体TT,差异有统计学意义(P<0.05)。结论原核表达并纯化了rPspA,其具有新型多糖蛋白载体的潜力,也可作为黏膜投递型多糖结合疫苗的候选载体。

关键词：肺炎球菌表面蛋白A 多糖结合疫苗载体

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