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- 1 篇 哲学

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5 篇 白血病
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7 篇 上海医科大学
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5 篇 温州医科大学
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4 篇 上海体育学院
3 篇 广州医科大学
3 篇 第二军医大学长海...
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3 篇 长海医院
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作者

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光学分子影像技术在肝癌动物模型构建及诊疗中的应用研究

光学分子影像技术在肝癌动物模型构建及诊疗中的应用研究

引用

作者：李岗南方医科大学

学位级别：博士

研究背景光学分子影像的概念首先由Weissleder于1999年提出(Weissleder R. Molecular imaging:exploring the next frontier[J]. Radiology,1999,212(3):609-14.),是指在分子水平上反映生物体生理、病理变化的特异性成像技术,能够提供以解剖结构为基础、以细胞水平为基准的疾病发生、发展的信息,故可作为疾病分期诊断的定位、定性、定量的可靠依据。相对于离体检测方法,其优势在于可对同一机体实现实时、无创、动态观察,同目前其它医学影像手段相比具有灵敏度高、易操作、无辐射、投入小等优点,由于其可以在细胞水平体现和鉴别活体内不同生理、病理过程,相对于之前的影像技术主要定位在形态和结构层面上认识疾病过程,分子影像技术着力于在生物化学和细胞内来揭示疾病的发生发展过程(Blow N. In vivo molecular imaging:the inside job[J]. Nature Methods,2009,6(6): 465-469.).随着计算机科学、分子生物学、生物工程学、临床医学等学科的不断进步和交叉给医学提供了大量精确量化的实验模型,大大促进了临床实践的发展,但仍有许多在体实验无法在真人身上进行,因此动物实验仍是研究疾病发病机理、临床表现等的重要方法,其可以较全面的了解相应的生理学和病理学信息,改善疾病尤其是恶性疾病的治疗方式,从而为开发新的诊疗技术提供有利保证。如前所述,小动物光学在体分子成像技术能在较短时间内提供生物组织内部细胞层面的高分辨率图像,并能跟踪病变组织的变化,进而从细胞水平和基因研究的角度获得疾病发生发展等生理学和病理学方面的详细资料,尤其是对恶性疾病如肿瘤等病变组织的活体成像研究,将大大推动人类对此类疾病的认识,有助于医疗工作者早日研究出治疗此类疾病的有效方法(Baker M. Whole-animal imaging:The whole picture[J]. Nature,2010,463(7283):977-980.)。本论文第一部分借助中国科学院自动化研究所分子影像重点实验室所拥有的IVIS200分子影像成像系统(Xenogen精诺真公司),在光学分子影像技术辅助下构建了裸鼠肝癌皮下及原位模型,实现了无创、实时、连续、直观地观测裸鼠活体内肝癌肿瘤的生物学行为,为后续研究肝癌的致病机理、药物疗效评估和手术治疗方法等方面搭建了良好的前期动物模型平台。肝脏肿瘤性疾病常用影像学方法来评价治疗效果,如通过观察一定时间内肿瘤体积大小改变来观察疗效,而临床对疾病的影像学诊断是以人体的病理形态改变为基础,其远远落后于在分子、细胞水平的病变。光学分子影像技术可在分子水平层面对病变进行检测,而不单单是疾病终末期的解剖形态改变,如化疗只需观察治疗药物的作用靶点变化情况,药物作用过程中一些关键的分子标记变化情况,即可推断这种治疗方法有无产生效用。所以,光学分子影像技术可较常规影像手段更早地发现病变,并对病变进行定性分析,使得临床医生可以在疾病的发生、形成阶段就对其进行有效的干预,达到早期观察治疗效果的目的(Zhang Q, Du Y, Xue Z, et al. Comprehensive Evaluation of the Anti-Angiogenic and Anti-Neoplastic Effects of Endostar on Liver Cancer through Optical Molecular Imaging. PLoS One,2014,9(1):8555-9.).近年来,芹黄素因其被证明具有抗炎、清除自由基和抗癌的潜力已被广泛应用于抗肿瘤的研究中,它是天然存在的一种黄酮类化合物,具有潜在的抗肿瘤活性。多项研究表明,芹黄素对于结肠癌、胃癌、肺癌、子宫肉瘤等均具有明显的抑制作用(Shukla S, Gupta S. Apigenin:a promising molecule for cancer prevention. Pharm Res,2010, 27(6):962-78.)。本论文第二部分我们利用已成功构建的裸鼠肝癌皮下及原位模型结合光学分子影像技术探讨和验证了芹黄素对肝癌的抑制作用,为发现新的肝癌治疗药物提供了有益的参考价值。小动物活体光学分子成像技术主要包括生物发光成像(Bioluminescence imaging, BLI)和荧光成像(Fluorescence imaging, FMI)两种方法,目前该技术主要用于观测药物代谢及靶向作用；基因的表达反应过程；标记示踪不同种类的干细胞；监测了解炎性反应过程；器官移植模型的监测；肿瘤原发、转移病灶的发现；抗肿瘤药物筛选；细菌病毒的繁殖生长及控制等。具体应用原

关键词：光学分子影像技术肝癌动物模型分子影像手术导航系统芹黄素 MRP2

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肺癌组织基因表达谱的数据挖掘与生物信息学分析

肺癌组织基因表达谱的数据挖掘与生物信息学分析

引用

作者：李华南方医科大学

学位级别：博士

随着人类基因组测序计划的完成，大量微阵列表达数据的积累，以及应运而生的生物信息学的发展给肿瘤分子发病机理的研究开阔了新的研究思路。生物信息学是一门由计算机技术、统计学、数学、遗传学、分子生物学、医学、信息学、生物物理... 详细信息

随着人类基因组测序计划的完成，大量微阵列表达数据的积累，以及应运而生的生物信息学的发展给肿瘤分子发病机理的研究开阔了新的研究思路。生物信息学是一门由计算机技术、统计学、数学、遗传学、分子生物学、医学、信息学、生物物理和化学等结合的交叉学科。一般意义上，生物信息学是研究生物信息的采集、处理、存储、传播、分析和解释等各方面的一门学科，它通过综合利用生物学、计算机科学和信息技术来揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘。它的研究重点主要体现在基因组学（Genomics）和蛋白组学（Proteomics）两方面。通过对DNA序列的统计计算分析，更加深入地理解DNA序列、结构、演化及其与生物功能之间的关系，以揭示基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律。以生物芯片为研究基础，以序列比对、统计分析方法、可视化作图、生物聚类、通路分析及启动子预测等方法为手段，在分子水平进行数据挖掘、对疾病进行阐述。利用基因芯片技术和生物信息学方法系统分析肿瘤相关基因及调控机制，是当前功能基因组学的重要研究途径，可从整体的、基因组水平上阐明肿瘤细胞基因表达调控网络。最近，综合使用各种分析手段对芯片表达数据进行分析的统合分析方法（meta-analysis）成为研究者们的热点，这种分析方法不仅降低了错误发现率（false discovery rate，FDR），还克服了单个芯片数据或单个实验室数据存在的缺陷，从而更加全面地从整体上对疾病进行研究。本研究选择同一芯片平台的三组肺癌患者的基因表达谱数据集：GSE3268、GSE7670和GSE10072为数据来源，是为了缩小因单一数据集样本差异造成的假阳性率，提高筛选基因的特异性;采用dCHIP（DNA-Chip Analyzer）芯片分析软件分别筛选三组数据集中的差异基因，经Excel软件交集，选择三组数据集中共有的差异基因;应用DAVID（database for annotation，visualization and integrated discovery）软件对差异基因进行初步功能聚类与通路分析，并通过共表达基因的筛选和实验验证，对上调差异基因进行深入分析，从中发现与肺癌发病相关的新的特异性基因，同时构建共表达基因与预测转录因子相互作用的网络图谱，为肺癌的分子发病机制、药物研发、诊断与治疗等深入研究提供有意义的探索和理论依据。研究内容主要分为以下三个部分：第一部分：肺癌组织基因表达谱的数据分析。选择数据集GSE3268中人肺鳞癌组织和癌旁正常组织，GSE7670与GSE10072中部分人肺腺癌组织和癌旁正常组织的配对芯片数据为研究材料，分别导入dCHIP软件筛选荧光表达值变化超过2倍比值的差异表达基因，将得到的三组差异基因经Excel软件交集，最后获得603个与肺癌相关的特异性基因，其中144个基因上调，459个基因下调。利用生物学功能聚类、KEGG通路分析、功能注释结合文献分析对差异基因进行初步分析。结果发现上调基因主要以MMP9，BIRC5和CDC2基因为核心聚集，已知MMP9与癌细胞的侵袭转移密切相关，而BIRC5和CDC2是调控细胞凋亡和细胞周期的重要基因。下调基因由于已研究的基因信息相对较少，并且基因功能较为分散，所以并无明显聚集，又因为上调基因在癌细胞中发挥重要的生物学功能，故本文主要针对上调基因进行深入分析。本文利用GEO数据库中GDS1312（GSE3268）中MMP9，BIRC5和CDC2的邻近基因表达谱（Profile neighbors）与筛选出的上调基因交集，得到MMP9，BIRC5和CDC2基因在肺癌组织中的共表达差异基因（简称为共表达基因）。结合DAVID在线软件分析和文献挖掘，发现在肺癌组织中，与MMP9共表达的基因有15个，该组中多数基因具有信号传导功能，其中包括COLIA2、COL3A1、COL5A1等7个胶原蛋白基因，推测该组共表达基因在肺癌组织中具有促进癌细胞迁移和浸润的功能;与BIRC5共表达的基因有22个，与CDC2共表达的基因有35个，这两组共表达基因中部分基因参与细胞凋亡和细胞周期的调控过程，推测这两组共表达基因在肺癌组织中与BIRC5和CDC2一起参与细胞周期及细胞凋亡的调节过程。第二部分：肺癌共表达基因转录调控分析和网络构建。基因表达调控是生物体内基因表达的调节控制机制，是细胞中基因表达的过程在时间、空间上处于有序状态，并对环境条件的变化作出适当反应的复杂过程，其中转录水平尤其是转录起始阶段的调控对基因表达起关键作用。本文应用TELiS、GATHER和TFME软件，对筛选的三组共表达基因进行转录因子及转录因子结合位点（Transcriptional factor binding site，T

关键词：肺癌基因表达谱数据挖掘生物信息学共表达基因 KIAA0101 靶向治疗

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慢病毒载体携带自杀基因Dm-dNK(果蝇脱氧核糖核苷酸激酶)对肿瘤细胞杀伤作用的研究

慢病毒载体携带自杀基因Dm-dNK(果蝇脱氧核糖核苷酸激酶)对肿瘤细...

引用

作者：张念劬中国医科大学

学位级别：博士

目的：　　尽管肿瘤的治疗策略在不断改进，传统的肿瘤治疗方法，如外科切除、放射治疗和化学药物治疗并不能完全地治愈肿瘤。随着生物学技术的发展，基因技术开始应用于肿瘤治疗，其中对自杀基因疗法应用的研究较为广泛。自杀基因又... 详细信息

目的：　　尽管肿瘤的治疗策略在不断改进，传统的肿瘤治疗方法，如外科切除、放射治疗和化学药物治疗并不能完全地治愈肿瘤。随着生物学技术的发展，基因技术开始应用于肿瘤治疗，其中对自杀基因疗法应用的研究较为广泛。自杀基因又称药物敏感基因(drug sensitivity gene)，它可以在体内将无毒性的前体药物转化为有毒性药物，从而达到杀死肿瘤细胞的目的。由于这种方法常以病毒作为载体进行基因转导，故称为病毒介导的酶解药物前体治疗(VDEPT)。　　与哺乳动物的四种脱氧核苷酸激酶不同的是，黑腹果蝇只有一种脱氧核苷酸激酶，Dm-dNK(deoxyribonucleoside kinase of Drosophila melanogaster)。它具有广泛的底物特异性，能够催化自然界所有嘌呤、嘧啶脱氧核糖核酸的磷酸化反应，并且这种激酶还表现出惊人的催化效率，要高出我们所曾了解的核酸激酶效率的10-100倍。研究者们研究显示Dm-dNK可以在人类癌细胞中表达并存留其活性，如在骨肉瘤中，表达Dm-dNK的肿瘤细胞还显示出它对多种化疗药物敏感性的增强。Dm-dN通过磷酸化核苷酸类似物，使其从一磷酸化形式随后被细胞内的其他酶类二三步磷酸化，三磷酸化核苷酸类似物通过DNA复制的终止而引起细胞的凋亡。另有研究显示，基因突变可以提高自杀基因Dm-dNK的酶活性，从而更有效地杀伤肿瘤细胞。　　慢病毒载体是近来受到广泛注意的一种逆转录病毒载体，由于具有可感染分裂细胞和非分裂细胞、目的基因整合至靶细胞基因组长期表达等优点，适于基因治疗，因此有望成为理想的基因转移载体。　　我们构建了慢病毒载体携带Dm-dNK，进一步我们在体外，体内试验中检测Dm-dNK的抗肿瘤特性。　　研究资料与方法：　　一、细胞培养　　肿瘤细胞系购买于上海细胞库，正常细胞购买ATCC.细胞使用RPM1640培养基或高糖DMEM培养。培养基中含有10％的血清，双抗。培养环境为37℃，5％CO2.　　二、慢病毒载体的构建及转染　　根据Dm-dNK的cDNA，在其两端设计出带EcoRI和BamH的酶切位点的引物，利用聚合酶链式反应(PCR)将Dm-dNK克隆到慢病毒载体PGC-FU中，成为PGC-FU-dNK。另外，将绿色荧光蛋白基因(GFP)克隆到慢病毒载体PGC-FU中，成为PGC-FU-GFP，使得转染率能够通过荧光来观察。用Lipofectamine2000将PGC-FU-dNK质粒与两种包装质粒Phelper1.0和Phelper2.0共转染至293细胞，9-14天出现病毒空斑，应用DNA提取试剂盒提取慢病毒DNA，通过PCR验证后命名为Lenti-CMV-dNK，即CMV调控的带dNK基因的慢病毒。Lenti-GFP用于比较不同细胞系间感染率的区别。　　三、Dm-dNK基因的表达及酶活性的检测　　用TRIZOL方法提取纯化Bcap37，SGC-7901和WI-38，感染慢病毒Lenti-CMV-dNK后的细胞系Bcap37，SGC-7901和WI-38，使用反转录PCR试剂盒及Western blotting对目的基因的表达进行检测，　　酶活性测定通过提取细胞的蛋白，用放射性[3H]标记作为底物的核苷酸药物，混合液在Whatman DE-81滤纸上反应不同时间后经液闪测量仪测定放射活性。　　四、Dm-dNK基因与核苷类似物联合对癌细胞的杀伤作用　　稳定转染的细胞Bcap37，SGC-7901和WI-38及未转染的对照细胞铺板，加入不同浓度的dFdC共培养5天后采用MTT法检测细胞增殖情况。　　癌细胞系Bcap37，SGC-7901以及正常细胞系WI-38铺板，培养基在第二天分别替换为病毒溶液Lenti-CMV-dNK.感染3后，加入不同浓度的dFdC，浓度为0，0.001，0.01，0.1，1，和10μM，共培养3天后采用MTT法检测细胞增殖情况。　　采用Annexin ***双染凋亡检测试剂盒观察治疗后细胞凋亡情况及凋亡比例。各种细胞铺6孔板加入核苷类药物处理，经Annexin ***和碘化丙锭双重染色后用流式细胞仪分析凋亡比例。　　五、Dm-dNK基因与核苷类似物联合对裸鼠移植瘤的抑制作用　　采用100-150 mm3裸鼠皮下种植肿瘤模型，6-7周龄的BALB/C裸鼠皮下注射转染Lenti-CMV-dNK的Bcap37和对照Bcap37细胞.所有治疗组动物在成瘤注射6天后腹腔给药dFdC治疗一个月。对照组动物成瘤注射6天后腹腔给PBS。治疗条件满足后，裸鼠处死剥离瘤体根据公式ab2/2测量瘤体积（a为长径）。　　结果：　　 Dm-dNK经慢病毒转染至肿瘤细胞后呈高水平表达，并保持其激酶活性。

关键词：果蝇脱氧核糖核苷酸激酶慢病毒载体自杀基因抗肿瘤特性肿瘤细胞杀伤作用

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CoCl<,2>对神经型一氧化氮合酶表达的作用及其调控机制研究

CoCl<,2>对神经型一氧化氮合酶表达的作用及其调控机制研究

引用

作者：李光宇中国医科大学

学位级别：博士

目的:缺血性脑损伤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率，致残率和复发率极高。对其深入研究具有重要的理论和临床应用价值。神经细胞对缺血十分敏感，神经系统很多的疾病的发生，发展和缺血过程相关。在神经外科疾病的治疗中缺血... 详细信息

目的:缺血性脑损伤是一种严重威胁人类健康的疾病，其发病率，致残率和复发率极高。对其深入研究具有重要的理论和临床应用价值。神经细胞对缺血十分敏感，神经系统很多的疾病的发生，发展和缺血过程相关。在神经外科疾病的治疗中缺血和低氧也是影响病人预后的重要因素之一。神经型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)最早发现于大鼠的小脑组织，现已被证明广泛的存在于神经系统中，在维持神经元的功能如神经递质的传递，神经元发育，突触塑形，调节基因表达等方面发挥重要的作用，同时参与许多神经系统疾病的病理过程。除了神经系统外，还在其他很多组织如骨骼肌，肺，肾脏中发现了nNOS的表达。nNOS在体内具有多样而复杂的功能，它的基因结构和表达调节也十分复杂。一氧化氮合酶尤其是神经型一氧化氮合酶在神经系统缺血过程中起到重要作用。但是现在对它在神经系统缺血中的作用和调控的研究存在较大的分歧。我们的研究拟通过低氧化学模拟物CoCl2刺激神经母细胞瘤SK-N-SH，进而探讨nNOS在模拟低氧条件下的表达情况和调控机制。预适应是机体抗缺氧或缺血的一种内源性保护现象，在多种动物的心脏，肝、肾和脑等多种组织、器官和细胞中都发现了这种机制的存在，其中在心脏和脑中这种现象受到特别的关注。有研究认为nNOS在低氧预适应中起到重要作用，我们拟通过低氧的化学模拟物CoCl2刺激神经母细胞瘤SK-N-SH建立预适应模型，进而研究nNOS在低氧预适应中的作用，并对其预适应的机制进行初步研究。材料与方法:1.实验材料：RNA提取试剂TRIzolReagent购自GIBCOBRL，逆转录试剂盒购自Promega，Real-timePCR试剂盒购自Takara，一氧化氮荧光染料DAF-Ⅱa购自Anxora，Real-timePCR相关引物和探针购自上海博亚生物技术有限公司，人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH购自中国科学院上海细胞生物研究所，PCR产物纯化试剂盒及柱离心胶回收纯化试剂盒均购自上海华舜生物工程有限公司丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自MERCK公司产品，琼脂糖购自Promega公司，载体连接系统pMD18-TVector购自Takara公司，PGL3-basic报告基因载体购自Promega公司，γ-32pATP购自北京福瑞德公司，双重荧光素酶报告基因检测试剂盒购自promega公司，抗体购自Santacruz公司。 2.实验方法：以CoCl2为低氧的模拟刺激刺激人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH，提取RNA，进行Real-timePCR定量分析nNOSmRNA的表达情况。以荧光染料DAF-ⅡA检测在刺激后NO产生情况;Western-blot方法分析在刺激后nNOS蛋白的表达情况。设计探针，以同位素标记，以EMSA的方法检测nNOSExon1f启动子区域的低氧反应元件(HRE)和C/EBPα反应元件的活性，并以ChIP的方法验证。构建PGL3-basic荧光素酶报告基因表达载体，在CoCl2的刺激下检测其报告基因的表达，鉴定反应元件的活性。以CoCl2为低氧的模拟刺激对人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH进行预适应刺激，以无血清模拟低氧刺激，MTT法检测细胞增殖，流式细胞方法检测细胞凋亡。提取RNA，进行RT-PCR分析nNOSmRNA和BCL-2，Apaf-1的表达情况。结果:***2刺激对SK-N-SH细胞nNOS基因表达的影响：Real-timePCR检测结果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中nNOS的表达升高，并且呈时间和剂量依赖性。DAF-ⅡA荧光染料分析表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中NO的含量升高，在应用了nNOS特异性拮抗剂7-NI后可以使NO的含量下降，表明了在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中NO的含量升高至少有一部分来源于***-blot结果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH细胞中nNOS的蛋白表达增高，而7-NI可以拮抗这种作用。 ***1f启动子区域低氧反应元件HRE的鉴定：EMSA的结果显示nNOSExon1f启动子区域的HRE可以和转录因子HIF-1α结合。ChIP结果表明在CoCl2的刺激下HIF-1α和该HRE的结合增强。pGL3荧光素酶报告基因的检测结果表明在CoCl2的刺激下含HRE的启动子活性增加60％。 ***1f启动子区域C/EBPα反应元件的鉴定：EMSA的结果显示nNOSExon1f启动子区域的C/EBPα结合位点可以和转录因子C/EBPα结合。ChIP结果表明在CoCl2的刺激下HIF-1和该C/EBPα反应元件的结合增强。pGL3荧光素酶报告基因的检测结果表明在CoCl2

关键词：神经型一氧化氮合酶低氧诱导因子 CCAAT增强子结合蛋白低氧预适应

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鞘内注射scAAV9-hIGF1对ALS小鼠模型运动神经元保护作用及机制研究

鞘内注射scAAV9-hIGF1对ALS小鼠模型运动神经元保护作用及机制研究

引用

作者：忽浩杰河北医科大学

学位级别：博士

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种慢性、进行性、致死性神经变性疾病,发病率约为5/10万至7/10万,临床患者约90%为散发性肌萎缩侧索硬化(SALS),余为家族性肌萎缩侧索硬化(FALS),二者的临床表现及病理特点相似,... 详细信息

肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种慢性、进行性、致死性神经变性疾病,发病率约为5/10万至7/10万,临床患者约90%为散发性肌萎缩侧索硬化(SALS),余为家族性肌萎缩侧索硬化(FALS),二者的临床表现及病理特点相似,患者一般在出现症状后的3～5年内病情进行性加重,最终因肌肉萎缩无力、呼吸衰竭而死亡。目前尚无有效的治疗方法。SALS的病因还不明确。经大量的FALS患者研究证实,20%的病例由铜/锌超氧化物歧化酶1基因(SOD1)突变引起。G93A-SOD1转基因小鼠(ALS小鼠)模拟人类ALS疾病的临床特点,被用作研究ALS病理机制的工具鼠。高拷贝数转基因G93A-SOD1小鼠约在12周龄时后肢开始出现运动功能障碍症状,并逐渐进展,约17-20周龄发展到终末,病理表现与人ALS相似的致命的运动神经元的变性。研究认为突变的SOD1蛋白错误折叠,易形成聚集体,对降解短寿命蛋白质的泛素蛋白酶体系统抵抗,具有细胞毒性,是导致家族性ALS疾病的机制之一。自噬(autophagy)可以清除长寿命蛋白质、错误折叠蛋白质及衰老损伤细胞器,是高度保守的细胞生物学行为。在中枢神经系统,自噬是清除错误折叠蛋白的重要途径,以维持神经元的正常生理功能。因此研究有效降解突变SOD1蛋白对ALS疾病治疗具有重要意义。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF1)含有70个氨基酸,是一种在分子结构上与胰岛素类似,相对分子质量为7 649,通过内分泌、自分泌和旁分泌的三种途径产生的低分子多肽。IGF-1参与生物体内多种重要生理功能,其重要作用之一是有助于修复神经的损害。应用腺相关病毒血清2型(adeno-associated virus 2,AAV2)携带人单链IGF1基因(AAV2-hIGF1)肌肉注射经神经逆轴浆运输干预G93A-SOD1转基因小鼠,其发病明显推迟、生存期延长,研究发现IGF1激活ALS小鼠的脊髓运动神经元自噬通路,抑制运动神经元凋亡,从而保护了运动神经元,该实验没有报道突变的sod1蛋白水平变化,我们推测可能是在自噬激活参与下使致病的sod1蛋白水平下调减轻了对运动神经元的毒性。本研究我们应用亲神经的腺相关病毒血清9型(aav9)携带编码双链的higf1基因(scaav9-higf1)经鞘内注射的途径干预g93a-sod1转基因小鼠,观察其行为学变化,探索表达higf1对als小鼠突变sod1蛋白表达及病理的影响,并进一步采用crispr-cas9系统,通过给g93a-sod1转基因雌性小鼠鞘内注射scaav9-sgrna-igf1-cas9以敲降小鼠自身igf1,探索对als小鼠突变sod1蛋白表达及病理是否呈反方向影响。我们查阅国内外文献类似报道极少。第一部分鞘内注射scaav9-higf1对als小鼠模型行为学及突变sod1蛋白的影响目的:我们应用亲神经性的腺相关病毒血清型9(aav9)携带编码双链的人igf1基因(scaav9-higf1)经鞘内注射途径干预60天龄、90天龄g93a-sod1转基因雌性小鼠,观察干预后其行为学变化,研究表达higf1对als小鼠突变sod1蛋白表达及病理的影响。方法:我们选取美国jackson实验室提供的肌萎缩侧索硬化转基因g93a-sod1小鼠为动物模型,应用其提供的引物序列和鉴定方法对转基因g93a-sod1仔鼠进行dna鉴定,阳性的g93a-sodl转基因雌性小鼠经同窝配对作为受试对象。60天龄时、90天龄时的g93a-sod1转基因阳性同窝雌性小鼠随机分配到药物治疗组鞘内注射scaav9-higf1,对照组鞘内注射aav9-gfp,各15对。另外选取60天龄时g93a-sod1转基因阳性同窝雌性小鼠10对,随机分别给予鞘内注射scaav9-higf1/aav9-gfp,其中3对鞘内注射3周时新鲜取材提取蛋白,采用酶联免疫吸附实验观测转染后higf1表达、分布特点,1对用4%的多聚甲醛液灌注固定,通过免疫荧光双染观测腰髓组织振荡切片higf1表达特点;其中3对110天龄时用4%的多聚甲醛液灌注固定,通过免疫组织化学法、免疫荧光法观测腰髓组织振荡切片病理变化特征;余3对110天龄时新鲜取材,通过蛋白印迹分析研究gfap、cd11b、sod1、lc3、p62表达特点,通过rt-pcr研究sod1的mrna转录水平。结果:1所有纳入实验的小鼠经dna鉴定,核实为g93a-sod1转基因阳性的雌鼠。2给予g93a-sod1转基因小鼠鞘内注射scaav9-higf1/aav9-gfp,3周时新鲜取材提取蛋白,酶联免疫吸附实验结果显示higf1在神经组织中都有表达,腰段脊髓、胸段脊髓、颈段脊髓、脑干组

关键词：肌萎缩侧索硬化转基因小鼠自噬鞘内注射超氧化物歧化酶1 胰岛素样生长因子1 ScAAV9-hIGF1 一氧化氮合酶肿瘤坏死因子α NF-κB CRISPR-Cas9 敲降

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EIF3C在人脑胶质瘤中的表达及其对脑胶质瘤U87MG细胞增殖作用的体内外研究

EIF3C在人脑胶质瘤中的表达及其对脑胶质瘤U87MG细胞增殖作用的体...

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作者：郝进敏河北医科大学

学位级别：博士

脑胶质瘤是最常见、难以控制和最致命的人类颅内肿瘤,占原发性中枢神经系统肿瘤的40%以上。根据世界卫生组织的神经病理学分类,脑胶质瘤被分为星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、室管膜细胞瘤、髓母细胞瘤、多形胶质母细胞瘤、少突神经胶质... 详细信息

脑胶质瘤是最常见、难以控制和最致命的人类颅内肿瘤,占原发性中枢神经系统肿瘤的40%以上。根据世界卫生组织的神经病理学分类,脑胶质瘤被分为星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、室管膜细胞瘤、髓母细胞瘤、多形胶质母细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤和脉络丛乳头状瘤等。世界卫生组织根据脑胶质瘤的恶性程度将其分为I级、II级、III级和IV级四个级别。I级脑胶质瘤在生物学上是良性肿瘤,完全切除能够治愈;II级脑胶质瘤属于低度恶性,可能经历较长的临床过程,但早期弥漫浸润到临近的脑组织中导致即使手术也会因术后复发而不能治愈;III级脑胶质瘤比II级胶质瘤呈现出更多的间变和恶性增殖的特征,常常进展快而致命;IV级脑胶质瘤性质更加恶劣,他们对化疗和放疗都不敏感,往往生存时间更短。程度最高的星形细胞瘤被称为多形胶质母细胞瘤或简称为GMB,属于脑胶质瘤IV级。在成年人,恶脑脑胶质瘤(III级和IV级)占所有原发性脑肿瘤的比例接近60%。恶性脑胶质瘤,尤其多形胶质母细胞瘤,对化疗和放疗反应差、术后复发率高,是最难治疗的肿瘤。尽管近年来显微手术、放疗和化疗等治疗措施获得较大进展,但恶性脑胶质瘤患者平均生存时间仍然是9～12个月,很少病人能获得治愈。据报道,除了属于I级的毛细胞型星形细胞瘤之外,罹患其它类型脑胶质瘤病人自诊断后5年生存率不足3%。脑胶质瘤病人的预后仍然非常差,近些年也没有明显的变化。而且,有报道老年病人比年轻成年病人的相对风险高出3.18倍。无论是低级别还是高级别,脑胶质瘤均呈现浸润性生长和富有血管的特性。肿瘤细胞浸润临近的脑组织,常常导致常规治疗手段的失败。如今,许多化疗药物被发现产生较为严重的副作用,因此也影响肿瘤治疗的效果。大约有30%的病人由于现代药物严重的副作用而放弃化疗。为此,人们已经进行了很多努力和尝试,通过开展新的治疗方法和发现新的药物作用机制来提高药物的治疗效果,减少药物的毒副作用。目前,尽管一些药物用于脑胶质瘤的临床治疗,但存在着我们如何提高治疗效果、减少并发症和降低复发率等许多挑战。分子遗传学研究人员已经证实基因变化参与了恶性肿瘤的发生和进展,包括杂合子10(LOH10)、磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)、肿瘤蛋白p53(TP53)、表皮生长因子(EGFR)和p16的丢失等等。人们认为肿瘤的发生和进展同多种基因改变和基因表达模式改变的累积有关。掌握脑胶质瘤发生和进展基因改变的分子通路,将有希望在不远的将来获得新的有效的治疗靶点,这将有助于提高脑胶质瘤患者的生存状况,并改善他们的医疗预后。蛋白质翻译异常在人类肿瘤中广泛存在。近年来,人们发现真核翻译起始因子(e IFs)在多种人类肿瘤发生和进展中发挥着重要作用。然而,真核翻译起始因子在脑胶质瘤中的作用和机制仍然不清楚,还需要进一步研究阐明。本研究探讨了真核翻译起始因子3(e IF3)的核心亚基e IF3c在人脑胶质瘤中的作用。首先,采用免疫组织化学SP技术和RT-PCR技术检测了e IF3c在人脑胶质瘤和正常脑组织中的表达。然后,利用慢病毒介导si RNA的方法,在体外实验中探讨了e IF3c基因沉默对U87 MG细胞的增殖、凋亡、细胞周期和克隆形成等的影响。随后,又建立了胶质瘤裸鼠移植模型,在体内实验中观察了e IF3c基因沉默对脑胶质瘤形成和增殖生长的影响。根据以上的实验结果,证实了e IF3c在脑胶质瘤的形成和进展中起着重要作用,以期在临床实践中为脑胶质瘤的基因治疗奠定极为重要的理论基础。本课题研究内容包括以下三部分:第一部分EIF3C在人脑胶质瘤和正常脑组织中的表达研究目的:采用免疫组织化学SP方法和逆转录聚合酶链式反应技术,检测e IF3c在人脑胶质瘤和正常脑组织标本中的表达情况,探讨e IF3c在脑胶质瘤中的表达与脑胶质瘤的病理级别、肿瘤大小、位置、病人年龄和性别等临床特性的相关性。方法：1病人的临床资料和肿瘤标本的处置脑胶质瘤标本来自河北医科大学第二医院神经外科2008年1月-2013年12月期间接收外科手术的83例脑胶质瘤患者。另外对照组27例正常脑组织标本来自同期27例颅脑损伤行内减压手术的患者。所有标本均经两名以上神经病理医师明确诊断。所有患者术前均未接受放疗、化疗和免疫治疗。83例脑胶质瘤患者中,男性44例,女性39例,平均年龄为44.54±12.53岁(年龄范围16岁到73岁)。所有组织标本取材后均分为两部分:一部分标本速冻并储存在-80℃液氮中以备抽取目的基因e IF3c的m RNA;另一部分标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋,应用免疫组织化学SP法检测e IF3c的表达。详细记录所有标本的病人年龄、性别、肿瘤大小、生长部位和病理级别等临床资料。在液氮中保存的标本中,取其中的31例脑胶质瘤标本和5例正常脑组织标本进行RT-PCR实验,用于检测内源基因e IF3

关键词：脑胶质瘤真核翻译起始因子3亚基c 蛋白质翻译核糖核酸干扰细胞增殖凋亡

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ZNF259通过FAK-AKT信号通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭的研究

ZNF259通过FAK-AKT信号通路抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭的...

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作者：单悦梅中国医科大学

学位级别：博士

目的:　　肺癌现今是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，与细胞增殖、侵袭、转移有关的信号途径的异常启动是肿瘤进展的关键原因。因此，全面理解肺癌细胞增殖、侵袭和转移的分子机制，发现新的肺癌生物学行为的标记物，不仅为肺癌患... 详细信息

目的:　　肺癌现今是全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，与细胞增殖、侵袭、转移有关的信号途径的异常启动是肿瘤进展的关键原因。因此，全面理解肺癌细胞增殖、侵袭和转移的分子机制，发现新的肺癌生物学行为的标记物，不仅为肺癌患者的临床治疗和预后评估带来益处，也可为开发新的靶向治疗药物提供依据，提高临床治疗手段，具有重要的理论和现实意义。　　ZNF259，也被称为ZPR1，是一种锌指蛋白，Gangwani L等人已经证明在各种真核细胞中ZNF259为维持细胞存活所必需，其在早期胚胎发育中起着重要作用，其缺乏能够引起生长圆锥回缩、轴突缺陷以及细胞凋亡。Gangwani L同时证明了ZNF259在Hela细胞中分布在细胞质和细胞核，在增殖时主要表现为亚细胞分布的变化。ZNF259在S期定位于细胞核，能够加速细胞周期的进程，ZNF259缺乏能够引起转录和细胞周期进程的缺陷。　　然而，迄今为止，ZNF259在人类肺癌中的表达模式和分子机制尚无报道。在本实验中，我们用免疫组织化学的方法检测了人类非小细胞肺癌标本中ZNF259的表达，发现ZNF259在癌旁组织细胞质中高表达，而在非小细胞肺癌标本中呈现微弱的细胞质表达，提示ZNF259在恶性肿瘤中可能发挥独特的生物学功能。　　在本研究中，我们探索了ZNF259在肺癌组织和细胞系中的蛋白表达水平和亚细胞分布，以及它们的临床病理相关性。我们也研究了在非小细胞肺癌细胞系中过表达或者消耗ZNF259后对细胞增殖和侵袭的影响。我们发现ZNF259能够通过抑制FAK-AKT信号传导通路的激活来抑制非小细胞肺癌细胞系的增殖和侵袭。我们的研究为ZNF259作为肺癌治疗的潜在靶点提供了初步的理论和实验依据。　　方法:　　病人和标本:本研究是由中国医科大学的地方机构审查委员会批准开展的，组织标本来源于114例病人（男性86例、女性28例），均为2012-2014年间在中国医科大学附属盛京医院被诊断为非小细胞肺癌而在胸外科接受完整的手术切除的患者，114例中有35例有相对应的癌旁肺组织。患者在手术前均没有接受放疗或者化疗。按照世界卫生组织(WHO)2015年肺部肿瘤分类方法进行组织学诊断和分级。所有114例标本都进行了组织学亚型分类、分化程度分析和肿瘤分期。肿瘤分期是按照国际抗癌联盟(UICC)肺癌TNM分期系统第七版来进行的。114例病人的中位数年龄是57岁（从29岁到79岁），其中有68位病人大于或等于57岁，46位病人小于57岁。样本中分别包括42例肺鳞状细胞癌、54例肺腺癌和18例其他组织学类型的肺癌，16例高分化、44例中分化和34例低分化肺癌。114例患者中有52例出现淋巴结转移，Ⅰ-Ⅱ期患者61例，Ⅲ期患者53例。此外，其中20例有新鲜的包括肿瘤组织和配对癌旁组织的标本，切除后立即保存在-80℃冰箱内，用于提取蛋白和免疫印记检测ZNF259在肺癌组织的表达情况。　　免疫组织化学:标本固定、包埋、切片，免疫染色采用链霉亲和素-过氧化物酶方法。染色强度评分分为0分（无着色）、1分（淡黄着色）、2分（黄色着色、细颗粒状）、3分（褐色着色）。染色细胞百分比评分分为0分（无着色）、1分（1-25％着色）、2分（26-50％着色）、3分（51-75％着色）、4分（76-100％着色）。两者乘积得分≥4定义为ZNF259阳性表达，得分0-3定义为阴性表达。　　细胞系:HBE细胞系从美国模式菌种收集中心获得，A549、H460、SPC、H1299细胞系从上海细胞库获得，LK2细胞系由Hiroshi Kijima教授赠送，人肺ADC Anip973和AGZY83a细胞系从上海拜力生物科技有限公司购买。　　蛋白免疫印迹:总蛋白使用裂解缓冲液提取，用Bradford法定量。取60微克的总蛋白通过10％浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳，然后转印到PVDF膜上。膜用一抗4℃过夜孵育，洗膜后用过氧化物酶标记的二抗37℃孵育2小时。结合蛋白用电化学发光进行显像，用生物成像系统进行检测。实验重复3次。　　质粒转染和小干扰RNA处理:质粒pCMV6-ddk-myc和pCMV6-ddk-myc-ZNF259购于Origene，ZNF259-siRNA和NC-siRNA购于Santa Cruz Biotechnology。使用试剂Lipofectamine3000按照说明书进行转染。　　基质胶侵袭:使用含有8μm孔滤膜的transwell小室，底部用基质胶包被。细胞转染48小时后消化，将含有3×105个细胞的100μl无血清培养基转移到基底膜的上室，下室放含有10％小牛血清的培养基，18小时后，通过滤膜的细胞固定、染色。用显微镜随机取10个高倍视野计数，实验重复三次，取平均值。　　划痕实验:转染48小时后当培养细胞至密度小于90％时进行划痕，在

关键词：非小细胞肺癌锌指蛋白细胞增殖细胞侵袭 FAK信号通路 AKT信号通路

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RNAi沉默AEG-1基因对人肾癌细胞生物学行为的影响

RNAi沉默AEG-1基因对人肾癌细胞生物学行为的影响

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作者：王鹏中国医科大学

学位级别：博士

目的：　　本研究通过构建AEG-1的shRNA干扰质粒，稳定转染体外培养的肾癌细胞株，探讨下调AEG-1的表达对肾癌细胞增殖、细胞周期、癌细胞凋亡和对5-氟尿嘧啶敏感性的影响及相关生物学机制。这些结果表明沉默AEG-1基因可以抑制细胞的增... 详细信息

目的：　　本研究通过构建AEG-1的shRNA干扰质粒，稳定转染体外培养的肾癌细胞株，探讨下调AEG-1的表达对肾癌细胞增殖、细胞周期、癌细胞凋亡和对5-氟尿嘧啶敏感性的影响及相关生物学机制。这些结果表明沉默AEG-1基因可以抑制细胞的增殖和集落形成，延缓及阻滞细胞周期于G0/G1期，最终促进肾癌细胞凋亡，并增加了化学药物敏感性。因此，AEG-1在肾细胞癌的形成和发展中发挥重要的作用并可能成为对肾细胞癌进行基因治疗的潜在靶点。　　材料和方法：　　一、细胞培养　　人类肾癌细胞株Caki-1从中科院上海细胞所获取，培养瓶中加入McCOY's5A培养液(Sigma-Aldrich，USA)和10％胎牛血清，在条件为37℃和5％ C02的恒温培养箱中培养。每隔2-3天细胞密度为80％左右，更换培养液并加入0.25％的胰蛋白酶进行细胞消化传代。　　二、质粒构建　　用pGCsi-H1作为载体(GeneChem，China)构建pGCsi-H1-AEG-1的干扰质粒。　　三、细胞转染和稳转细胞筛选　　肾癌Caki-1细胞铺于6孔板中，调整细胞密度为1.0×105/孔，过夜培养。　　四、Real-time PCR　　总RNA提取试剂盒(Invitrogen)提取各组细胞总RNA，按照cDNA第一链合成试剂盒说明(Takara,中国)反转录成cDNA。反应结束后采用BIONEER公司ExicyclerTM96荧光定量仪进行定量分析。　　五、Western Blot　　加入蛋白裂解液(Beyotime Institute of Biotechnology，China)及PMSF提取总蛋白，冰上放置40 min，4℃12000 rpm/min离心40 min，取上清，BCA法定量蛋白。用Image J software检测条带的灰度值，进而确定各组蛋白的表达量。β-actin作为内参。　　六、免疫组化和免疫荧光　　免疫组化:临床病理标本取下后多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片，免疫组化SP法进行染色，倒置显微镜观察。免疫荧光:肾癌Caki-1细胞铺在载玻片上，进行细胞制片用4％多聚甲醛固定，4℃孵育过夜。　　七、细胞增殖实验　　细胞增殖通过3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法进行检测。　　八、克隆形成实验　　细胞以300个/皿的密度接种培养，每隔3天换液，37℃下培养细胞10-14天可形成肉眼可见的克隆，PBS洗涤细胞两次后用甲醇固定细胞。去除甲醇，PBS清洗3次，用瑞姬氏复合染料染色10 min，清水冲洗3次后拍照。显微镜下计数，大于等于50个细胞的细胞团为克隆数。　　九、流式细胞术检测细胞周期和凋亡　　对于检测细胞周期，细胞用胰酶消化后用70％预冷的乙醇固定过夜。在细胞中加入碘化丙啶(PI)和RNase(50μg/ml)，37℃孵育30min。通过流式细胞仪(BDBiosciences，美国)检测不同时期的细胞百分数。细胞凋亡用AnnexinV FITC/PI凋亡试剂盒(KeyGen Biotech，中国)进行检测。细胞密度达到80％后，用胰蛋白酶消化细胞，PBS清洗细胞。用500μl Annexin V结合缓冲液重悬细胞。加入5μl FITC-标记AnnexinV溶液和5μl PI溶液，室温下避光孵育15 min。冰浴避光存放，流式细胞仪进行检测。　　十、Hoechst33258染色　　Hoechst33258染色用来检测细胞核的变化和凋亡小体的形成。细胞达到80％融合以后，用4％多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤细胞。用Hoechst33258染色液(Beyotime Institute of Biotechnology)室温下孵育30 min。弃去染色液滴加抗荧光淬灭封片液封片，于荧光显微镜下观察，400倍镜下进行图像采集数据分析。　　十一、统计学分析　　所有的实验重复三次，数据以均数±标准差表示。组间的差异用单因素方差分析(one way ANOVA)进行分析，多因素分析使用Bonferroni因果分析，GraphpadPrism5.0用于计算数据和制作图形表格。P＜0.05认为差异有统计学意义。　　结果：　　一、AEG-1在肾癌组织中表达升高。　　免疫组化实验中AEG-1在肾癌组织蜡块切片中明显高表达，相反的，正常的癌旁肾脏上皮细胞免疫组化实验或是没有蛋白表达或是表达微弱。实验可见，AEG-1主要在细胞质和核周显色，AEG-1蛋白的表达与肿瘤T分期、肿瘤病理分级和远处转移密切相关(P＜0.05)。　　二、形成沉默AEG-1基因的稳转Caki-1细胞株。　　为了研究AEG-1在肾癌中的作用，我们构建了质粒携带AEG-1 shRNA和阴性对照shRNA。质粒转染肾癌Caki-1细胞后，筛选并获得经过G418

关键词：肾癌细胞核糖核酸干扰现象星形胶质细胞升高基因-1 基因沉默生物学行为

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leT-7a miRNA在血管平滑肌细胞增殖及移植血管内膜增生中的作用及其机制研究

leT-7a miRNA在血管平滑肌细胞增殖及移植血管内膜增生中的作用及...

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作者：曹辉中国医科大学

学位级别：博士

前言　　慢性动脉闭塞是老龄化病人一种常见的疾病，它往往导致间歇性跛行，静息痛和组织损伤。外周静脉移植术是解决动脉闭塞的优选方法，研究表明利用自体静脉改善通畅情况优于人工材料。虽然静脉移植术的起初疗效非常好，但是种种迹... 详细信息

前言　　慢性动脉闭塞是老龄化病人一种常见的疾病，它往往导致间歇性跛行，静息痛和组织损伤。外周静脉移植术是解决动脉闭塞的优选方法，研究表明利用自体静脉改善通畅情况优于人工材料。虽然静脉移植术的起初疗效非常好，但是种种迹象表明由于内膜增生其移植血管的管腔会逐渐狭窄甚至闭塞。最近的研究表明，手术治疗的第一年内静脉移植的通畅率达85％-90％，然而十年内移植静脉再狭窄的发生率达50％。血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖是在内膜增生主要原因，这是早期移植静脉阻塞发病机制的关键。　　miRNA是一种长度为18～25个核苷酸单链的内源性非编码性小RNA。它存在于多种生物的基因组中，包括从病毒到植物以及多细胞动物。miRNA最初是在线虫中发现的，现在的研究表明miRNA在大多数生物体基因表达中发挥关键作用。miRNA的功能是作为转录后调节剂，通过结合到靶mRNA调控基因的表达，参与多种生物学过程，进化过程相对保守。到目前为止，已经发现的人类基因组miRNAs超过1500个，根据研究估计60％以上的基因可以通过miRNA来调控。因此，这些小内源性沉默子作为关键调节剂出现在不同的生物学过程中，如细胞增殖，发育，血管新生，胆固醇代谢，肿瘤发生或细胞凋亡等。除了miRNAs基因表达调节剂的内源性生理作用外，细胞也可被动和/或主动释放miRNA，这种分子的旁分泌作用可以调节其他细胞的基因表达。因此，像癌症、代谢、脑疾病或动脉粥样硬化等疾病，都与miRNA的功能障碍有关。最近研究发现miRNA在血管疾病中也起着重要的作用，它通过调节脉管系统中参与细胞活动的关键的靶基因来发挥作用。let-7miRNA是最早发现的miRNA之一，在脊椎动物和无脊椎动物中高度表达。虽然let-7在血管系统也表达，但是其在VSMCs的增殖和移植血管中作用仍不清楚。在本研究中，通过微阵列基因芯片分析确定静脉移植模型的microRNA表达谱。并且通过实时定量聚合酶链反应（real-timePCR）方法进一步验证个别失调的miRNA。我们发现，let-7a在静脉移植模型中表达是下调。因此，我们推测，let-7a参与静脉移植术后内膜增生。在本研究中，我们发现let-7a在静脉移植模型中的潜在作用，以及let-7a抑制VMSC增殖的作用机制。　　实验材料与方法　　1、主要试剂　　雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购买于中国医科大学实验动物中心;CCK-8（Dojindo公司，日本）、pluronicF-127和二甲基亚砜购买于sigma公司;DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶买于HyClone公司;下面是各种蛋白的抗体及其购买公司:α-SMA(Proteintech，Chicago，IL，USA)，PCNA（Proteintech公司，美国），K-Ras（Proteintech公司，美国）和c-Myc（Bioworld公司，美国），流式细胞增殖检测试剂盒购买BD公司。SP法免疫组织化学试剂盒、DAB显色液（福州迈新公司）;原位杂交试剂盒（博士德，中国）;Real-timePCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）。let-7a慢病毒表达载体及其阴性对照购自上海吉玛制药技术有限司（病毒滴度1×108）。　　2、动物模型　　10％水合氯醛腹腔麻醉3ml/kg，显微镜下(SXP-1B)行无菌显微外科手术:取小鼠右侧颈总静脉长约4.5mm，肝素盐水冲洗后用11-0血管缝合线端-端吻合于肾下腹主动脉，术后分笼标记，由动物实验中心统一饲养。　　3、基因筛查　　提取组织中的总RNA，运用miRNA基因芯片筛查移植血管模型中差异性表达的miRNA，并通过real-timePCR进一步验证。　　4、体内转染　　以F-127为介质，将let-7amimics及阴性对照转染进入移植血管大鼠体内。实验分为四组:未处理组（untreated组）、凝胶组（Gel组）、阴性对照组(negativecontrols，NC组)、处理组(let-7amimics组)　　5、real-timePCR检测let-7a的表达　　Trizol法提取各实验组细胞总RNA，异丙醇浓缩RNA，分光光度计测定总RNA的纯度。取2μL总RNA，用OneStepPrimeScript(@)miRNAcDNASynthesisKit逆转录试剂盒按操作说明进行反转录反应。按照SYBRPremixExTaq荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR反应。　　6、组织学分析　　于术后28天取组织，福尔马林固定后包埋，进行HE染色和弹力纤维EVG染色，使用光学显微镜观察内膜增生的情况，并且测量内膜和中膜的比例。　　7、免疫组化和原位杂交　　石蜡切片行免疫组织化学检测α-SMA、PCNA、c-Myc与K-Ras的表达。原位杂交检测let-7a的表达。　　

关键词：慢性动脉闭塞血管平滑肌细胞增殖机制静脉移植术内膜增生 let-7miRNA

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单细胞水平的输尿管癌和膀胱癌转录组特征比较分析

单细胞水平的输尿管癌和膀胱癌转录组特征比较分析

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作者：张庆云广西医科大学

学位级别：博士

背景及目的:输尿管癌属于上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma,UTUC),具有起病隐匿、临床进展快、复发率高和生存预后差的特点。目前泌尿外科临床医生的共识是UTUC较膀胱癌恶性程度更高、预后更差,因此会采取更积极的治... 详细信息

背景及目的:输尿管癌属于上尿路尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma,UTUC),具有起病隐匿、临床进展快、复发率高和生存预后差的特点。目前泌尿外科临床医生的共识是UTUC较膀胱癌恶性程度更高、预后更差,因此会采取更积极的治疗手段,但由于输尿管癌发病率低相关研究较少,而且与膀胱癌有着相同的临床表现和组织学外观,所以目前输尿管癌的诊疗方案几乎都是参照膀胱癌的方案执行,对其病因及发病机制却知之甚少。越来越多的证据表明,输尿管癌相对于膀胱癌是一种独特的疾病类型,应该区别看待。随着医疗技术的迅猛发展,输尿管癌早期检出率大大提高,手术操作技术也由传统的开放手术发展到腹腔镜甚至机器人手术和腔内微创手术。与此同时,精准治疗理念的提出,包括尿路上皮癌在内的新的肿瘤分子分型不但可以为患者提供个体化的精准治疗方案而且还可以对患者的预后进行精准评估。尽管如此,输尿管癌的治疗效果并未得到实质性的提高,早期患者手术后复发率仍居高不下,晚期患者治疗方法有限,以铂类为基础的化疗和免疫治疗总体反应率低,治疗有效持续时间短,急需找到治疗UTUC新的突破点。二代高通量测序技术的发展使得我们对疾病的转录组和基因组进行全貌分析成为可能,但本身也存在一定的局限性,因为这种方法得到的结果反映的是所有细胞的平均表达水平,不能准确的定位到具体细胞类群,一些具有重要功能但数量并不多的细胞群信息也会被淹没。单细胞转录组测序(single cell RNA sequencing,sc RNA-seq)技术的出现弥补了这方面的不足,使得传统的批量组织学研究转向单个细胞层面的研究。通过sc RNA-seq技术分析,不仅可以了解每个细胞的独特变化,而且还可以发现新的细胞类型和新的细胞标记基因。使得复杂组织中的细胞类型得到精准区分,以单个细胞为单位对功能状态相同的细胞进行聚类,从而在单细胞水平上进行更加精准的分子机制研究。本研究利用sc RNA-seq技术优势描绘输尿管癌单细胞转录组图谱景观及对各细胞类群功能进行深入分析。同时希望通过与膀胱癌sc RNA-seq数据进行比对,找到导致输尿管癌恶性表型明显和预后不良的原因,为输尿管癌的治疗提供单细胞层面的依据和潜在的新的治疗靶点。方法:3例人输尿管癌标本经酶消化的方法制备成单细胞悬液。通过10X Genomics设备将悬液制备成单细胞油包水结构,构建c DNA文库后进行测序。使用10X Genomics提供的Cell Ranger软件对测序数据进行初步分析,R包Seurat、Monocle2等单细胞相关分析软件对人类输尿管癌sc RNAseq数据进行质量控制和深入分析。通过q PCR、Western Blot、免疫组织化学实验对输尿管癌组织和正常输尿管组织的PPP4C表达水平进行验证。构建PPP4C重组质粒DNA转染正常尿路上皮细胞,通过细胞增殖实验、克隆形成实验和细胞迁移、侵袭实验观察过表达PPP4C基因对正常尿路上皮细胞生物学行为的影响。3例人膀胱癌标本同样通过10X Genomics设备将单细胞悬液制备成单细胞油包水结构,构建c DNA文库进行测序。将测序数据进行初步分析后采用Harmony包把输尿管癌和膀胱癌数据进行整合。使用Find Clusters、Find All Marker函数将合并后的数据进行无偏聚类分析并算出不同类型细胞之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。结果:描绘了输尿管癌单细胞水平的转录组图谱景观。通过主成份分析和无偏聚类分析,最终把人输尿管癌单细胞转录组图谱分成17群不同的细胞类型,在分类出的7种不同的肿瘤细胞亚群中,各群高表达基因富集通路不一样,通过拟时态分析重建了人输尿管癌肿瘤细胞的发育轨迹并找到了在输尿管癌分化发育过程中的关键基因。输尿管癌中的肿瘤相关成纤维细胞高表达ACTA2和TAGLN,同时表达PDGFRB和TGF-β。在验证了输尿管癌具有较高FGFR表达的同时发现输尿管癌内PPP4C基因表达上调,尤其是在肿瘤细胞核中表达显著增加,正常尿路上皮细胞过表达PPP4C后增殖和迁移的能力显著增强。成功捕获了包括人输尿管癌和膀胱癌样本在内的46180个高质量单细胞转录组信息,全面描绘了尿路上皮癌单细胞转录组图谱景观,通过主成份分析和无偏聚类分析将人尿路上皮癌细胞图谱分成27群不同的细胞类型。通过比对输尿管癌和膀胱癌单细胞转录组数据我们发现:输尿管癌和膀胱癌肿瘤微环境中各自细胞亚群的构成比不一样,输尿管癌的细胞图谱构成中以肿瘤细胞为主,占81.3%,基质细胞和免疫细胞占比较少,而膀胱癌的细胞图谱中免疫细胞却占了绝大多数,肿瘤细胞仅占22.8%;其次,输尿管癌和膀胱癌内肿瘤细胞的构成比不一样,尤其是第10群肿瘤细

关键词：上尿路尿路上皮癌输尿管癌膀胱癌单细胞RNA测序

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