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绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)丙酮酸脱氢酶E1-α亚单位基因(pdha)的克隆、表达及其免疫学活性测定

农业生物技术学报 2012年第3期20卷 275-282页

作者：许健储岳峰高鹏程赵萍贺英剡根强逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心石河子大学动物科技学院

丙酮酸脱氢酶α-亚单位（PDHA）在病原体丙酮酸脱氢酶的催化过程中发挥着重要作用。为表达绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae）PDHA蛋白并测定其免疫学活性,应用PCR方法扩增出绵羊肺炎支原体pdha基因并对其序列进行分析,将pdha... 详细信息

丙酮酸脱氢酶α-亚单位（PDHA）在病原体丙酮酸脱氢酶的催化过程中发挥着重要作用。为表达绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae）PDHA蛋白并测定其免疫学活性,应用PCR方法扩增出绵羊肺炎支原体pdha基因并对其序列进行分析,将pdha基因中色氨酸密码子TGA优化为TGG后进行全基因合成,插入到pET32-a（+）载体上,构建了pET32-a（+）-pdha重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中诱导表达PDHA蛋白,并通过免疫印迹及小鼠（Mus musculus）免疫试验对其免疫学活性进行测定。结果pdha基因全长1125bp,编码375aa,（G+C）%为34.76%,第304;06位、379;81位、586;88位、592;94位、625;27位、811;13位、889;91位及964;66位TGA在支原体中编码色氨酸而不是作为终止密码子;基因序列比对及进化树分析显示,绵羊肺炎支原体pdha基因与10种支原体的pdha基因序列同源性为32.6%;5.3%,氨基酸序列同源性为39.3%;0.6%,基因序列和氨基酸序列均与猪肺炎支原体（***）有同源性,分别为85.3%和90.6%;绵羊肺炎支原体pdha基因在33℃、IPTG0.25mmol/L诱导6h的表达条件下,表达量最高;重组的PDHA蛋白可与绵羊肺炎支原体高免血清具有免疫印迹条带,在免疫小鼠后血清抗体效价与对照组相比,均显著升高（P<0.05）。本实验首次成功克隆表达了绵羊肺炎支原体pdha基因,并证明其重组PDHA蛋白具有较好的免疫学活性。为绵羊支原体肺炎基因工程疫苗及诊断研究提供候选靶标。

关键词：绵羊肺炎支原体 pdha基因克隆 PDHA蛋白表达免疫学活性

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绵羊肺炎支原体免疫蛋白质组学的初步研究

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中国兽医科学 2012年第2期42卷 150-153页

作者：许健储岳峰高鹏程赵萍贺英剡根强逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心甘肃兰州730046 石河子大学动物科技学院新疆石河子832000

利用双向电泳及免疫印迹方法对绵羊肺炎支原体MoGH3-3分离株的抗原蛋白进行筛选,并采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱对其进行初步鉴定。结果,共筛选到MoGH3-3株3个主要抗原蛋白点,其中2个被鉴定为延伸因子(elongation factor Tu,... 详细信息

利用双向电泳及免疫印迹方法对绵羊肺炎支原体MoGH3-3分离株的抗原蛋白进行筛选,并采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱对其进行初步鉴定。结果,共筛选到MoGH3-3株3个主要抗原蛋白点,其中2个被鉴定为延伸因子(elongation factor Tu,EF-Tu),1个为丙酮酸脱氢酶E1-a亚单位(pyruvate dehydrogenase E1-alpha subunit,PDHA)。结果表明,EF-Tu及PDHA是绵羊肺炎支原体主要的抗原蛋白,这为下一步绵羊支原体肺炎基因工程疫苗的研制提供了靶标。

关键词：绵羊肺炎支原体免疫印迹蛋白质组学

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山羊支原体山羊肺炎亚种培养基的筛选及生长曲线测定

引用

动物医学进展 2012年第2期33卷 17-20页

作者：高珊逯忠新许立华宁夏大学农学院宁夏银川750021 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心甘肃兰州730046

为筛选出山羊支原体山羊肺炎亚种的适宜培养基,将山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601分别接种Thiaucourt肉汤、MEM-KM2和TSA 3种不同的培养基,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了M1601在最适培养基中在不同培养阶段的... 详细信息

为筛选出山羊支原体山羊肺炎亚种的适宜培养基,将山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601分别接种Thiaucourt肉汤、MEM-KM2和TSA 3种不同的培养基,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了M1601在最适培养基中在不同培养阶段的生长滴度。结果表明,添加2g/L丙酮酸钠和150mL/L马血清的Thiaucourt肉汤培养基最适宜山羊支原体山羊肺炎亚种的生长,生长滴度可达109 CCU/mL,在培养6h后开始进入对数生长期,培养60h后进入稳定期,培养72h时后进入衰亡期。此试验结果为山羊支原体山羊肺炎亚种培养特性研究提供了参考数据。

关键词：山羊支原体山羊肺炎亚种培养基生长曲线

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我国17株绵羊肺炎支原体分子分型及其菌体蛋白免疫印迹

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微生物学报 2011年第10期51卷 1421-1426页

作者：许健储岳峰高鹏程赵萍贺英剡根强逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心兰州730046 石河子大学动物科技学院石河子832000

【目的】分别从基因和蛋白水平研究我国部分地区绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)分离株的分子特征,并了解其免疫原性蛋白的差异。【方法】对分离自8个地区的17株绵羊肺炎支原体进行扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Len... 详细信息

【目的】分别从基因和蛋白水平研究我国部分地区绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)分离株的分子特征,并了解其免疫原性蛋白的差异。【方法】对分离自8个地区的17株绵羊肺炎支原体进行扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分析,采用NTsys-2.10e软件对AFLP和SDS-PAGE结果进行聚类,并用绵羊肺炎支原体模式株Y98高免血清对部分分离株进行免疫印迹分析。【结果】当相似系数分别为0.78和0.85时,绵羊肺炎支原体分离株可根据8个来源地区分成8个AFLP群和8个SDS-PAGE群;用8株分离株进行免疫印迹共出现6条蛋白条带,分子质量分别为105 kDa、83 kDa、65 kDa、42 kDa、40 kDa或26 kDa,其中83 kDa和40 kDa蛋白为8个菌株保守的免疫原性蛋白。【结论】我国部分地区绵羊肺炎支原体分离株之间存在遗传差异,不同分离株的主要免疫原性蛋白也存在一定差异,但83 kDa和40 kDa蛋白为其保守的免疫原性蛋白。本研究首次对我国部分地区绵羊肺炎支原体分离株进行了分子分型与免疫印迹分析,结果将为绵羊肺炎支原体病的新型诊断技术开发和疫苗研制奠定理论基础。

关键词：绵羊肺炎支原体 AFLP SDS-PAGE 免疫印迹

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家畜重要支原体病疫苗的研究进展

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中国兽医科学 2011年第12期41卷 1314-1320页

作者：张轩储岳峰逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心甘肃兰州730046

综述了山羊传染性胸膜肺炎、传染性无乳症、猪支原体肺炎、牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病等几种重要的家畜支原体疾病疫苗的优点、缺点、研究进展以及应用情况,展望了利用基因工程技术开发有关新型疫苗的前景,旨在为研制新型家畜支原体... 详细信息

综述了山羊传染性胸膜肺炎、传染性无乳症、猪支原体肺炎、牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病等几种重要的家畜支原体疾病疫苗的优点、缺点、研究进展以及应用情况,展望了利用基因工程技术开发有关新型疫苗的前景,旨在为研制新型家畜支原体疾病疫苗、减少其对家畜养殖带来的损失提供思路。

关键词：家畜支原体病疫苗进展

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中国部分地区绵羊肺炎支原体的基因多态性分析

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畜牧兽医学报 2011年第9期42卷 1295-1301页

作者：许健储岳峰赵萍高鹏程贺英剡根强逯忠新中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心兰州730046 石河子大学动物科技学院石河子832000

为了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)在我国部分地区的流行病学特征,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)及限制性片段长度多态性(RFLP)方法对26株Mo基因多态性进行了研究,并利用NTsys-2.10e软件对获得的多态性图谱进行了聚类... 详细信息

为了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)在我国部分地区的流行病学特征,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)及限制性片段长度多态性(RFLP)方法对26株Mo基因多态性进行了研究,并利用NTsys-2.10e软件对获得的多态性图谱进行了聚类分析。结果在相似系数为0.70时,26株Mo可分成6个RAPD群或6个RFLP群;相似系数为0.90时,分成18个RAPD群或18个RFLP群;相似系数为1.00时,分成25个RAPD群或26个RFLP群。结果表明,我国Mo存在高度的基因多态性,这种多态性与地域差异相关,与宿主来源也具有一定的相关性。研究结果为了解我国Mo的分子流行病学特征打下了基础,也为建立有效的Mo诊断方法和疫苗研制提供了参考依据。

关键词：绵羊肺炎支原体随机扩增多态性DNA 限制性片段长度多态性基因多态性流行病学

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绵羊肺炎支原体GH3-3株在改良KM2培养基中的增殖情况

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动物医学进展 2011年第11期32卷 46-48页

作者：许健储岳峰赵萍高鹏程贺英张莹剡根强逯忠新石河子大学动物科技学院新疆石河子832000 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心甘肃兰州730046

绵羊肺炎支原体GH3-3MoGH3-3株是我国绵羊支原体肺炎灭活疫苗制苗菌株。为研究MoGH3-3株在改良KM2培养基中的生长及繁殖特性,利用活菌计数方法对其在不同培养阶段的生长滴度(颜色变化单位)进行测定,并绘制生长曲线。结果表明,传代稳定的... 详细信息

绵羊肺炎支原体GH3-3MoGH3-3株是我国绵羊支原体肺炎灭活疫苗制苗菌株。为研究MoGH3-3株在改良KM2培养基中的生长及繁殖特性,利用活菌计数方法对其在不同培养阶段的生长滴度(颜色变化单位)进行测定,并绘制生长曲线。结果表明,传代稳定的MoGH3-3株在改良KM2培养基中培养12h开始进入对数生长期,培养72h进入稳定期,培养120h时进入衰亡期。本研究可为绵羊肺炎支原体培养特性研究和疫苗生产工艺研究提供参考数据。

关键词：绵羊肺炎支原体 MoGH3-3株增殖

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