检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2011年第4期33卷 261-264页

作者：梁立滨赵东明李俊平李雁冰施建忠姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为鉴定禽流感病毒(AIV)感染状态下的差异表达蛋白,本研究将H5N1亚型AIV感染组与对照组小鼠肺组织蛋白样品分别进行双向电泳分离,并采用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件进行分析。在AIV感染72h后,共有9个表达差异显著的蛋白点(ratio>... 详细信息

为鉴定禽流感病毒(AIV)感染状态下的差异表达蛋白,本研究将H5N1亚型AIV感染组与对照组小鼠肺组织蛋白样品分别进行双向电泳分离,并采用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件进行分析。在AIV感染72h后,共有9个表达差异显著的蛋白点(ratio>2,p<0.05),而且该蛋白在感染组均呈上调表达。将差异蛋白进行串联质谱分析,并对其中7个蛋白进行鉴定,包括:interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3(IFIT-3)、ATP依赖的干扰素反应蛋白1(ADIR1)、γ干扰素诱导的p47鸟苷三磷酸酶(IRG)、T细胞受体a TA27、气味受体S86、胞苷单磷酸激酶2(Cmpk2)和肌球蛋白。将前3个蛋白基因采用荧光定量PCR方法进行mRNA水平的验证,所获得的结果与双向电泳结果一致。本研究为在蛋白质组水平进一步分析H5N1亚型AIV与宿主相互作用奠定了基础。

关键词： H5N1亚型禽流感病毒双向凝胶电泳蛋白质组病原宿主相互作用

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一株H5亚型禽流感病毒NP蛋白两个鸡MHC分子限制性T细胞表位的鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第6期33卷 457-460页

作者：侯艳霞郭莹莹沈楠吴春艳姜永萍王靖飞中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／疫病诊断中心黑龙江哈尔滨150001 国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

为验证一株禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)中的3条T细胞表位候选肽NP89-97(PKKTGGPIY)、NP198-206(KRGINDRNF)和NP64-71(ERMVLSAF)的免疫原性,本研究构建了含有NP基因的重组质粒pCAGGS-NP,将其转染293T细胞,间接免疫荧光和western blot检测表明NP蛋白在293T细胞中获得表达。重组质粒免疫鸡后,用间接酶联免疫实验检测发现重组质粒在鸡体内能诱导产生相应的抗体。将多肽NP89-97、NP198-206、NP64-71和不相关肽N71-78(WRRQARYK)在体外刺激免疫后鸡的脾淋巴细胞,流式细胞术检测发现CD8+T淋巴细胞增殖分别为13.7%、11.9%、0.6%和0.4%;ELISA检测结果显示多肽NP89-97、NP198-206刺激后的淋巴细胞中IFN-γ的分泌量明显增加。本实验表明多肽NP89-97和NP198-206能在体外诱导活化的鸡淋巴细胞产生细胞毒性T淋巴细胞反应,为AIV NP的T细胞表位。该研究结果对研究禽类抗流感病毒的免疫机制及抗流感疫苗具有重要的意义。

关键词：禽流感病毒 NP蛋白 T细胞表位鉴定

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糖蛋白G基因在基因组P-M位的插入重组表达对狂犬病毒Flury LEP致病力的影响

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微生物学报 2011年第8期51卷 1098-1105页

作者：翟洪月陶丽红葛金英王喜军冯娜帅磊马良步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨150001 军事医学科学院军事兽医研究所长春130122 东北农业大学动物医学学院哈尔滨150030

【目的】研究狂犬病病毒Flury鸡胚低代毒株(Flury LEP)在基因组P-M位增加糖蛋白基因(G基因)的重组表达对病毒致病力的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,构建了P、M基因之间额外插入G基因的重组狂犬病病毒Flury LEP株(rLEP-PGM),并对... 详细信息

【目的】研究狂犬病病毒Flury鸡胚低代毒株(Flury LEP)在基因组P-M位增加糖蛋白基因(G基因)的重组表达对病毒致病力的影响。【方法】利用反向遗传操作技术,构建了P、M基因之间额外插入G基因的重组狂犬病病毒Flury LEP株(rLEP-PGM),并对重组病毒的生物学特性及对小鼠的致病性进行了初步研究。【结果】亲本株和重组病毒具有相似的生长特性,LEP和rLEP-PGM在BHK-21细胞的生长滴度分别为4×106 FFU/mL和2.5×106 FFU/mL,在小鼠神经母细胞(NA)的生长滴度分别为4×107 FFU/mL和2.5×107 FFU/mL;嗜神经指数均为1;Western blot显示,rLEP-PGM在感染细胞的G蛋白表达量比LEP显著提高;小鼠感染试验显示,rLEP-PGM与LEP脑内注射小鼠的LD50分别为3 FFU和1 FFU,肌肉注射途径的LD50分别为4×104 FFU和3.2×105 FFU。【结论】P、M基因之间插入一个额外的G基因能够提高G蛋白的表达水平,同时增强重组病毒外周侵入中枢神经系统的能力。

关键词：反向遗传技术狂犬病毒重组表达糖蛋白致病性

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两株鸭源H6N2亚型禽流感病毒的序列分析及对鸡的致病性研究

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中国预防兽医学报 2011年第4期33卷 270-275页

作者：丁晴微邓国华施建忠李印崔鹏飞齐瑛琳于杨崔佳莹邱伯根陈化兰湖南农业大学动物医学院湖南长沙410128 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为了解鸭源H6N2亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对两株鸭源H6N2亚型AIV[A/duck/Hubei/Sd061/2008(HB/061/08)和A/duck/Fujian/S2080/2009(FJ/080/09)]进行序列分析和致病性试验。序列分析显示:两株病毒的HA和NA基因均来源于我国近年流行的H6亚型病毒株,但是HB/061/08株的内部基因可能来源于H9、H5等其他亚型。与病毒株HB/061/08NP、PA、PB2基因的核苷酸同源性最高的病毒株为A/environment/Hunan/2-84/2007(H9N2);与M、PB1和NS基因的核苷酸同源性最高的病毒株分别为A/duck/Zhejiang/11/2000(H5N1)、A/chicken/Hebei/7/2008(H9N2)和A/chicken/Henan/L1/2008(H9N2)。两株病毒的抗原差异性较显著,相关系数为0.49;用106EID50病毒剂量感染4周龄SPF鸡,结果显示FJ/080/09株不能感染鸡,而HB/061/08株在鸡体内能够高效复制,并通过咽喉和泄殖腔持续排毒。鸡群感染后第3d采取脏器样品,在气管和肺部能够检测到病毒存在,部分脏器和器官的组织学观察显示存在一定程度的病理变化。以上数据表明,H6亚型AIV在跨越不同宿主感染的传播过程中,对新宿主适应能力的差异导致对其致病性的差异。

关键词：禽流感病毒 H6N2 基因组分析抗原分析致病性

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H5亚型禽流感DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭免疫保护效力的研究

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中国预防兽医学报 2011年第3期33卷 211-213页

作者：李俊平赵双成常晓飞柳金雄曾显营卫星辉李福基姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 格兰柏生化科技有限公司香港999077

为评价H5亚型禽流感病毒(AIV)DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭的免疫保护效力,本研究将pCAGGoptiHA5以20μg、30μg和50μg剂量免疫3周龄SPF鸭,首次免疫后3周加强免疫一次。2周后以105EID50的鸭源高致病力AIV由鼻腔攻毒,观察SPF鸭发病和死亡情... 详细信息

为评价H5亚型禽流感病毒(AIV)DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭的免疫保护效力,本研究将pCAGGoptiHA5以20μg、30μg和50μg剂量免疫3周龄SPF鸭,首次免疫后3周加强免疫一次。2周后以105EID50的鸭源高致病力AIV由鼻腔攻毒,观察SPF鸭发病和死亡情况。分别于攻毒后3d、5d和7d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离,检测鸭排毒情况及免疫和攻毒后血凝抑制(HI)抗体、中和(NT)抗体的动态变化。结果表明:30μg和50μg免疫组均可对免疫鸭产生100%保护,而20μg剂量组则可对免疫鸭提供80%保护。

关键词：禽流感 DNA疫苗 pCAGGoptiHA5

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湖南湖北两省H_6亚型禽流感病毒表面基因的序列分析

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基因组学与应用生物学 2011年第3期30卷 282-287页

作者：丁晴微于杨崔鹏飞齐瑛琳李印施建忠崔佳莹邱伯根陈化兰邓国华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 湖南农业大学动物医学院长沙410128

2008年至2009年间,在湖南和湖北两省的活禽市场中分离到了14株H6亚型禽流感病毒,为了解这14株病毒之间的分子特征和差异,我们运用PCR和测序鉴定对这14株病毒的NA基因进行了分型,并对其表面基因HA和NA进行序列测定及序列分析。14株H6亚... 详细信息

2008年至2009年间,在湖南和湖北两省的活禽市场中分离到了14株H6亚型禽流感病毒,为了解这14株病毒之间的分子特征和差异,我们运用PCR和测序鉴定对这14株病毒的NA基因进行了分型,并对其表面基因HA和NA进行序列测定及序列分析。14株H6亚型病毒中,H6N2亚型12株,H6N6亚型2株。序列测定和进化分析结果显示:DK/HN/284的HA基因与其它13株的HA差异性较大,差异性达到19.4%～20.2%,其余13株毒同源性在94.2%～99.9%;N2亚型NA基因的同源性在91.1%～99.9%,差异性比较大;两株N6亚型NA基因同源性为89.5%,差异明显。这些数据表明:不同毒株呈现一定的地域性差异。与我国周边其它地区的H6亚型禽流感毒株序列进行比较发现,只有DK/HN/284的HA基因与香港早期的毒株可能有着共同的来源,其余都与香港和韩国等的毒株有着较大的差异性,并且各个毒株的HA基因上潜在的糖基化位点和受体结合位点也有所不同,这些数据表明,这些毒株表现出明显的异源性。

关键词：禽流感病毒 H6亚型 HA NA 基因分析

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蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

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中国预防兽医学报 2011年第6期33卷 465-470页

作者：王凌凤杨涛孙恩成耿宏伟秦永丽赵晶蔡绪禹刘霓红李文京吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 中国动物疫病预防控制中心北京100125

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳... 详细信息

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳定分泌抗BTV17 VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株,分别命名为3F4和4H10。Ig亚类鉴定2株MAbs均为IgG1/κ链。Western blot证明,2株MAbs均能识别重组VP2蛋白。间接免疫荧光试验表明:2株MAbs均与BTV17呈阳性反应,其中MAb 3F4与BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV11、BTV13、BTV16、BTV23、茨城病病毒(IBAV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)均呈阴性反应,但与BTV10和BTV24呈弱阳性反应。利用合成多肽对VP2抗原表位鉴定结果表明,MAb 3F4识别的抗原表位为540DPWNNR545,MAb 4H10识别的抗原表位为540DPWNNRA546。本研究结果为建立BTV17型特异性检测方法及VP2功能研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒血清17型 VP2 原核表达单克隆抗体抗原表位

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野禽源AIV PB1-F2基因的遗传进化及部分氨基酸位点组成分析

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中国兽医学报 2011年第5期31卷 674-680页

作者：张进李雁冰柴洪亮张兰兰华育平东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

在完成14株野禽源AIV PB1-F2基因克隆、测序的基础上,对其进行了同源性、遗传进化关系及氨基酸编码特征的比较分析。结果发现,H5N1亚型高致病性毒株A/lesser_kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)PB1-F2的第37,48,50位氨基酸分别为精氨酸、脯... 详细信息

在完成14株野禽源AIV PB1-F2基因克隆、测序的基础上,对其进行了同源性、遗传进化关系及氨基酸编码特征的比较分析。结果发现,H5N1亚型高致病性毒株A/lesser_kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)PB1-F2的第37,48,50位氨基酸分别为精氨酸、脯氨酸、甘氨酸,与其他13个低致病性毒株均不相同(其分别为谷氨酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸)。为探讨这一现象,从NCBI Influenza Virus Resource中选取1 061个AIV毒株的PB1-F2基因序列进一步展开分析,结果表明:在第37,48,50位氨基酸位点上,97香港H5N1、其他H5N1及其他亚型AIV在此3个位点上氨基酸的构成存在着较为明显的差异,而且还呈现出了一定的规律和特点;并且研究还发现在此3个位点上,H9N2亚型毒株也表现出了较强的时间和空间分布特征。针对PB1-F2基因的遗传进化关系分析表明,H5N1及香港系毒株较其他AIV存在较远的遗传距离。随机的突变和重组似乎不足以解释这种差异及遗传距离形成的原因,其生物学意义有待于进一步探讨。

关键词：野禽源禽流感病毒 PB1-F2基因遗传进化氨基酸组成

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禽流感DNA疫苗重组质粒组织分布的实时荧光定量PCR方法建立

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中国预防兽医学报 2011年第3期33卷 203-207页

作者：熊杰彭广能王国俊李俊平姜永萍陈化兰四川农业大学动物医学院四川雅安625014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究禽流感病毒(AIV)DNA疫苗重组质粒在组织中的分布情况,本研究以AIV DNA疫苗pCAGGoptiHA 5HA基因为检测对象,分别建立检测AIV DNA疫苗重组质粒的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法和TaqMan MGB实时定量PCR方法。经优化比较两种方法的特... 详细信息

为研究禽流感病毒(AIV)DNA疫苗重组质粒在组织中的分布情况,本研究以AIV DNA疫苗pCAGGoptiHA 5HA基因为检测对象,分别建立检测AIV DNA疫苗重组质粒的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法和TaqMan MGB实时定量PCR方法。经优化比较两种方法的特异性、敏感性、重复性和污染率。结果表明,两种方法的标准曲线线性关系均较好,相关系数均达到0.999;最低检测量为42 copies,特异性强;探针法的重复性优于染料法,污染率低于染料法,因此采用TaqMan MGB实时定量PCR方法检测AIV DNA疫苗重组质粒组织分布情况。

关键词：禽流感 DNA疫苗组织分布实时荧光定量PCR

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流感病毒RNA聚合酶串联亲和纯化方法的建立

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中国预防兽医学报 2011年第11期33卷 841-844页

作者：李印邓国华崔佳莹于洋丁晴薇陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 华南农业大学广东广州510642 湖南农业大学湖南长沙410127

为建立流感病毒RNA聚合酶的串联亲和纯化方法,本实验由鸡胚尿囊液中提取病毒核酸,经过RT-PCR和常规PCR方法扩增禽流感病毒株A/Duck/Guangxi/35/01(H5N1)的PB1、PB2和PA的cDNA。分别将PB2基因连接于pcDNATAP载体中,PB1和PA基因连接于pcDN... 详细信息

为建立流感病毒RNA聚合酶的串联亲和纯化方法,本实验由鸡胚尿囊液中提取病毒核酸,经过RT-PCR和常规PCR方法扩增禽流感病毒株A/Duck/Guangxi/35/01(H5N1)的PB1、PB2和PA的cDNA。分别将PB2基因连接于pcDNATAP载体中,PB1和PA基因连接于pcDNA3A载体中构建了pcDNA-35PB2TAP、pcDNA-35PB1和pcDNA-35PA重组质粒。将构建的真核表达重组质粒共转染293T细胞,经过串联亲和纯化方法获得流感病毒依赖RNA的RNA聚合酶复合体(RdRp)。利用RNA体外合成试验验证获得的RdRp具有生物学活性。

关键词： H5亚型禽流感病毒 RNA聚合酶复合体串联亲和纯化

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