检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2011年第3期33卷 211-213页

作者：李俊平赵双成常晓飞柳金雄曾显营卫星辉李福基姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 格兰柏生化科技有限公司香港999077

为评价H5亚型禽流感病毒(AIV)DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭的免疫保护效力,本研究将pCAGGoptiHA5以20μg、30μg和50μg剂量免疫3周龄SPF鸭,首次免疫后3周加强免疫一次。2周后以105EID50的鸭源高致病力AIV由鼻腔攻毒,观察SPF鸭发病和死亡情... 详细信息

为评价H5亚型禽流感病毒(AIV)DNA疫苗pCAGGoptiHA5对鸭的免疫保护效力,本研究将pCAGGoptiHA5以20μg、30μg和50μg剂量免疫3周龄SPF鸭,首次免疫后3周加强免疫一次。2周后以105EID50的鸭源高致病力AIV由鼻腔攻毒,观察SPF鸭发病和死亡情况。分别于攻毒后3d、5d和7d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离,检测鸭排毒情况及免疫和攻毒后血凝抑制(HI)抗体、中和(NT)抗体的动态变化。结果表明:30μg和50μg免疫组均可对免疫鸭产生100%保护,而20μg剂量组则可对免疫鸭提供80%保护。

关键词：禽流感 DNA疫苗 pCAGGoptiHA5

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湖南湖北两省H_6亚型禽流感病毒表面基因的序列分析

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基因组学与应用生物学 2011年第3期30卷 282-287页

作者：丁晴微于杨崔鹏飞齐瑛琳李印施建忠崔佳莹邱伯根陈化兰邓国华中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 湖南农业大学动物医学院长沙410128

2008年至2009年间,在湖南和湖北两省的活禽市场中分离到了14株H6亚型禽流感病毒,为了解这14株病毒之间的分子特征和差异,我们运用PCR和测序鉴定对这14株病毒的NA基因进行了分型,并对其表面基因HA和NA进行序列测定及序列分析。14株H6亚... 详细信息

2008年至2009年间,在湖南和湖北两省的活禽市场中分离到了14株H6亚型禽流感病毒,为了解这14株病毒之间的分子特征和差异,我们运用PCR和测序鉴定对这14株病毒的NA基因进行了分型,并对其表面基因HA和NA进行序列测定及序列分析。14株H6亚型病毒中,H6N2亚型12株,H6N6亚型2株。序列测定和进化分析结果显示:DK/HN/284的HA基因与其它13株的HA差异性较大,差异性达到19.4%～20.2%,其余13株毒同源性在94.2%～99.9%;N2亚型NA基因的同源性在91.1%～99.9%,差异性比较大;两株N6亚型NA基因同源性为89.5%,差异明显。这些数据表明:不同毒株呈现一定的地域性差异。与我国周边其它地区的H6亚型禽流感毒株序列进行比较发现,只有DK/HN/284的HA基因与香港早期的毒株可能有着共同的来源,其余都与香港和韩国等的毒株有着较大的差异性,并且各个毒株的HA基因上潜在的糖基化位点和受体结合位点也有所不同,这些数据表明,这些毒株表现出明显的异源性。

关键词：禽流感病毒 H6亚型 HA NA 基因分析

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野禽源AIV PB1-F2基因的遗传进化及部分氨基酸位点组成分析

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中国兽医学报 2011年第5期31卷 674-680页

作者：张进李雁冰柴洪亮张兰兰华育平东北林业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150040 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

在完成14株野禽源AIV PB1-F2基因克隆、测序的基础上,对其进行了同源性、遗传进化关系及氨基酸编码特征的比较分析。结果发现,H5N1亚型高致病性毒株A/lesser_kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)PB1-F2的第37,48,50位氨基酸分别为精氨酸、脯... 详细信息

在完成14株野禽源AIV PB1-F2基因克隆、测序的基础上,对其进行了同源性、遗传进化关系及氨基酸编码特征的比较分析。结果发现,H5N1亚型高致病性毒株A/lesser_kestrel/Harbin/194/2007(H5N1)PB1-F2的第37,48,50位氨基酸分别为精氨酸、脯氨酸、甘氨酸,与其他13个低致病性毒株均不相同(其分别为谷氨酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸)。为探讨这一现象,从NCBI Influenza Virus Resource中选取1 061个AIV毒株的PB1-F2基因序列进一步展开分析,结果表明:在第37,48,50位氨基酸位点上,97香港H5N1、其他H5N1及其他亚型AIV在此3个位点上氨基酸的构成存在着较为明显的差异,而且还呈现出了一定的规律和特点;并且研究还发现在此3个位点上,H9N2亚型毒株也表现出了较强的时间和空间分布特征。针对PB1-F2基因的遗传进化关系分析表明,H5N1及香港系毒株较其他AIV存在较远的遗传距离。随机的突变和重组似乎不足以解释这种差异及遗传距离形成的原因,其生物学意义有待于进一步探讨。

关键词：野禽源禽流感病毒 PB1-F2基因遗传进化氨基酸组成

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禽流感DNA疫苗重组质粒组织分布的实时荧光定量PCR方法建立

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中国预防兽医学报 2011年第3期33卷 203-207页

作者：熊杰彭广能王国俊李俊平姜永萍陈化兰四川农业大学动物医学院四川雅安625014 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究禽流感病毒(AIV)DNA疫苗重组质粒在组织中的分布情况,本研究以AIV DNA疫苗pCAGGoptiHA 5HA基因为检测对象,分别建立检测AIV DNA疫苗重组质粒的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法和TaqMan MGB实时定量PCR方法。经优化比较两种方法的特... 详细信息

为研究禽流感病毒(AIV)DNA疫苗重组质粒在组织中的分布情况,本研究以AIV DNA疫苗pCAGGoptiHA 5HA基因为检测对象,分别建立检测AIV DNA疫苗重组质粒的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法和TaqMan MGB实时定量PCR方法。经优化比较两种方法的特异性、敏感性、重复性和污染率。结果表明,两种方法的标准曲线线性关系均较好,相关系数均达到0.999;最低检测量为42 copies,特异性强;探针法的重复性优于染料法,污染率低于染料法,因此采用TaqMan MGB实时定量PCR方法检测AIV DNA疫苗重组质粒组织分布情况。

关键词：禽流感 DNA疫苗组织分布实时荧光定量PCR

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流感病毒RNA聚合酶串联亲和纯化方法的建立

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中国预防兽医学报 2011年第11期33卷 841-844页

作者：李印邓国华崔佳莹于洋丁晴薇陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 华南农业大学广东广州510642 湖南农业大学湖南长沙410127

为建立流感病毒RNA聚合酶的串联亲和纯化方法,本实验由鸡胚尿囊液中提取病毒核酸,经过RT-PCR和常规PCR方法扩增禽流感病毒株A/Duck/Guangxi/35/01(H5N1)的PB1、PB2和PA的cDNA。分别将PB2基因连接于pcDNATAP载体中,PB1和PA基因连接于pcDN... 详细信息

为建立流感病毒RNA聚合酶的串联亲和纯化方法,本实验由鸡胚尿囊液中提取病毒核酸,经过RT-PCR和常规PCR方法扩增禽流感病毒株A/Duck/Guangxi/35/01(H5N1)的PB1、PB2和PA的cDNA。分别将PB2基因连接于pcDNATAP载体中,PB1和PA基因连接于pcDNA3A载体中构建了pcDNA-35PB2TAP、pcDNA-35PB1和pcDNA-35PA重组质粒。将构建的真核表达重组质粒共转染293T细胞,经过串联亲和纯化方法获得流感病毒依赖RNA的RNA聚合酶复合体(RdRp)。利用RNA体外合成试验验证获得的RdRp具有生物学活性。

关键词： H5亚型禽流感病毒 RNA聚合酶复合体串联亲和纯化

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新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备

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中国畜牧兽医 2011年第9期38卷 94-97页

作者：于杨崔佳莹丁晴微崔鹏飞李印邓国华任涛陈化兰华南农业大学兽医学院广东广州510642 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为制备新城疫病毒HN蛋白的单克隆抗体,本研究采用新城疫病毒CK/AH/100/2010作为免疫原,免疫6～8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后取脾细胞与SP2/0融合,用血凝抑制(HI)方法检测筛选,具有HI活性的单抗有6株:PX1-PX6。6株单抗与AIV、EDS等其它具... 详细信息

为制备新城疫病毒HN蛋白的单克隆抗体,本研究采用新城疫病毒CK/AH/100/2010作为免疫原,免疫6～8周龄BALB/c小鼠,3次免疫后取脾细胞与SP2/0融合,用血凝抑制(HI)方法检测筛选,具有HI活性的单抗有6株:PX1-PX6。6株单抗与AIV、EDS等其它具有血凝活性的病毒的交叉血凝抑制试验结果表明,6株单抗具有良好的特异性。间接免疫荧光试验结果表明,PX1、PX3可与新城疫病毒CK/GD/263/2010HN抗原发生特异性反应,而其它单抗不反应。

关键词：新城疫病毒单克隆抗体 HN基因 HI

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一株H4亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传演化分析

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中国预防兽医学报 2011年第3期33卷 185-188页

作者：刘丽玲李雁冰张翼段振华施建忠田国彬曾显营刘娣华育平陈化兰黑龙江省农业科学院黑龙江哈尔滨150086 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北林业大学黑龙江哈尔滨150040

2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定一株H4亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/912/2008(H4N2)(缩写为DK/GX/912/08)。为了解该株H4亚型AIV的来源、特征及其分子演化规律,本研究对其全基因序列进行测定... 详细信息

2008年对我国南方活禽市场进行流行病学监测时从鸭体内分离鉴定一株H4亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/duck/Guangxi/912/2008(H4N2)(缩写为DK/GX/912/08)。为了解该株H4亚型AIV的来源、特征及其分子演化规律,本研究对其全基因序列进行测定,并与GenBank登录的相关病毒进行遗传演化分析。结果表明:DK/GX/912/08HA基因切割位点附近的氨基酸序列(PEKASR↓GLF)符合低致病力AIV的特征,其分子遗传演化关系属于东半球谱系的欧亚分支;NA基因与A/duck/Jiangxi/1286/2005(H5N2)在同一分支内,核苷酸同源性为98.1%;PB2基因与A/duck/Nanchang/4-165/2000(H4N6)处于同一分支;而NS基因与A/duck/Jiangxi/1786/03(H7N7)同源性最高。因此,推测DK/GX/912/08可能是不同来源的基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。

关键词：禽流感病毒 H4亚型遗传演化分析

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H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

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东北农业大学学报 2011年第12期42卷 86-90页

作者：石锐包红梅姜永萍乔传玲陈化兰王秀荣陈维多黑龙江民族职业学院哈尔滨150081 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(H9N2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9。将此重组... 详细信息

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(H9N2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9。将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,产物处理后进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹和薄层扫描分析。结果发现HA蛋白可被大量表达,主要以包涵体形式存在,表达产物分子质量约64 ku,与理论推测值一致;菌液OD600值为1.0、IPTG终浓度为0.3 mmol.L-1、诱导时间4 h,其蛋白表达量最大,约占菌体蛋白总量的35%左右;通过免疫印迹试验发现,表达的蛋白可被禽流感H9亚型阳性血清特异性识别。研究结果表明,可以用原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,其产物具有免疫原性,可以用作禽流感抗体检测的免疫诊断试剂。

关键词：禽流感 H9 原核表达

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重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP对小鼠免疫保护性的研究

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中国兽医学报 2011年第1期31卷 1-5页

作者：吴运谱乔传玲杨焕良展小过陈艳辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 辽宁省动物疫病预防控制中心辽宁沈阳110164 辽宁省动物医学研究院辽宁沈阳110164

将重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP以不同免疫剂量接种BALB/c小鼠,通过检测小鼠免疫后的抗体以及抵抗H5N1亚型流感病毒攻击的保护对rAd-H5HA-EGFP的免疫保护性进行了评估。分别以108 TCID50、107 TCID50的rAd5-H5HA-EGFP免疫小鼠,初次免疫后3... 详细信息

将重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP以不同免疫剂量接种BALB/c小鼠,通过检测小鼠免疫后的抗体以及抵抗H5N1亚型流感病毒攻击的保护对rAd-H5HA-EGFP的免疫保护性进行了评估。分别以108 TCID50、107 TCID50的rAd5-H5HA-EGFP免疫小鼠,初次免疫后3周进行加强,剂量为2×108 TCID50和2×107 TCID50,同时以接种rAd5-EGFP和PBS的小鼠作为对照。二免后3周,将各组试验小鼠随机分为2组,分别应用106 EID50的SW/FJ/1/01株和CK/HuN/77/05两株H5N1亚型流感病毒进行攻击。结果显示,重组病毒108 TCID50和107 TCID50的免疫剂量均能够诱导高水平的HI抗体生成,rAd-H5HA-EGFP免疫小鼠在受到病毒SW/FJ/1/01和CK/HuN/77/05攻击后,与接种腺病毒rAd-EGFP和PBS的对照组小鼠相比,没有出现明显的体质量减轻,攻毒后病毒在免疫小鼠体内的复制被完全或部分抑制,脏器内检测到的病毒含量明显低于对照组小鼠;免疫小鼠在受到CK/HuN/77/05毒株攻击时,没有出现死亡(0/5),而接种rAd-EGFP和PBS的对照组小鼠均有死亡,死亡比例分别为4/5和5/5。以上结果表明,该重组rAd-H5HA-EGFP对小鼠具有良好的免疫保护性,有望成为1株新型H5N1亚型动物流感疫苗的候选重组毒株。

关键词：重组腺病毒 rAd-H5HA-EGFP 流感病毒 H5N1亚型免疫保护性

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H9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2010年第4期40卷 384-389页

作者：包红梅王秀荣陶启蒙蔡东东王馥梅赵玉辉陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒（AIV）不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量... 详细信息

通过分析流感数据库中123个HA序列,根据HA保守区序列设计并合成了1对引物,建立了一步法RT-PCR检测方法,预期扩增片段大小为732 bp。通过对H9亚型禽流感病毒（AIV）不同稀释度的尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,证实病毒尿囊液的最低检出量为1×10^4.7EID50/mL;阳性棉拭子的最低检出量为1×10^2.5EID50/mL。用该方法检测H1-H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,结果仅有H9亚型AIV出现特异性目的条带,而其他均未出现目的条带。脏器及咽喉、泄殖腔棉拭子样品在1∶10稀释度下,病毒分离和RT-PCR方法可以达到相同的阳性检出率。表明建立的AIV H9亚型RT-PCR方法具有较好的特异性和敏感性。

关键词：禽流感病毒一步法RT-PCR H9亚型

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