检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧兽医学报 2020年第4期51卷 794-800页

作者：吴寒光孙军峰梁雨萌刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道传染病创新团队哈尔滨150069

本研究旨在明确新城疫病毒(NDV)溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检... 详细信息

本研究旨在明确新城疫病毒(NDV)溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检测NDV在各细胞系的蛋白表达水平;利用流式细胞术检测NDV感染对各细胞系的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明,NDV在三个细胞系内的基因组复制水平和蛋白表达水平没有显著差异,但对三个细胞系的溶瘤作用存在明显差异;进一步流式细胞术检测发现,NDV感染能诱发HEK293T和HCT116的细胞周期发生G1期停滞,但对A549的细胞周期没有明显影响;此外,NDV感染24 h后,A549细胞以早期凋亡为主,而HCT116细胞以坏死/晚期细胞凋亡为主。NDV的溶瘤作用并不依赖于其复制水平,而且NDV对不同类型肿瘤细胞的溶瘤作用存在不同机制。

关键词：新城疫病毒复制溶瘤病毒细胞周期细胞凋亡

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中国部分地区鸡传染性贫血流行病学调查及病原分离鉴定

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中国预防兽医学报 2020年第8期42卷 760-765页

作者：李岳闫娜娜刘爱晶兰兴鸽杨搏刘长军高玉龙高宏雷祁小乐崔红玉高立李凯潘青王永强张艳萍王笑梅中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150069

为了调查近年来鸡传染性贫血病(CIA)在我国发病鸡群中的流行特点、分布及其危害,本研究于2016年1月~2019年9月,从黑龙江、北京、山东等13个省市的381个疑似CIA发病鸡群中采集肝脏样品1677份,PCR检出鸡传染性贫血病毒(CAV)阳性样品共242... 详细信息

为了调查近年来鸡传染性贫血病(CIA)在我国发病鸡群中的流行特点、分布及其危害,本研究于2016年1月~2019年9月,从黑龙江、北京、山东等13个省市的381个疑似CIA发病鸡群中采集肝脏样品1677份,PCR检出鸡传染性贫血病毒(CAV)阳性样品共242份,分布于85个鸡群,阳性样品检出率为14.43%(242/1677),阳性鸡群率为22.31%(85/381)。CAV与鸡马立克氏病病毒、鸡白血病病毒等免疫抑制病病毒混合感染在检测鸡群中普遍存在,占CAV感染总量的52.94%(45/85)。将来自山东临沂某CAV阳性鸡场的病鸡肝脏样品处理后接种MDCC-MSB 1细胞,连续传代6次,经PCR及间接免疫荧光鉴定,确定分离到一株CAV细胞适应病毒株,命名为CAV-SD19/4604。对分离株VP1基因测序并与GenBank中19株CAV参考株VP1基因序列比对,显示同源性为95.00%~98.80%,遗传进化树表明CAV-SD19/4604与多数亚洲病毒株位于同一分支。本研究为CAV感染的研究和疾病防控提供了数据支持。

关键词：鸡传染性贫血病鸡传染性贫血病毒流行病学调查分离鉴定序列分析

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一株G6P型牛轮状病毒的分离鉴定与全基因组序列分析

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中国预防兽医学报 2021年第9期43卷 939-945页

作者：曹存于德斌徐晓静于力常继涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术有限公司研发部黑龙江哈尔滨150069 内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010010

为了对患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛轮状病毒(BRV)的流行病学数据,本研究采用RT-PCR方法对8份腹泻犊牛的粪便样品进行BRV VP7基因检测,结果显示有1份样品为阳性。将该阳性病料样品接种Marc-145细胞。对产生细胞病... 详细信息

为了对患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定,并进一步丰富我国牛轮状病毒(BRV)的流行病学数据,本研究采用RT-PCR方法对8份腹泻犊牛的粪便样品进行BRV VP7基因检测,结果显示有1份样品为阳性。将该阳性病料样品接种Marc-145细胞。对产生细胞病变(CPE)的阳性样品连续传5代后,经间接免疫荧光试验(IFA)和电镜观察,结果表明从粪便样品中分离的病毒为BRV,命名为DZ株。对DZ株的11个基因节段进行RTPCR扩增、测序、拼接后对11个基因节段进行同源性及分型分析;构建分离病毒VP7、VP4基因进化树,分析其遗传进化关系及其氨基酸序列的变异情况。结果显示,DZ株基因组10个基因节段分别与来源于牛(VP2、VP7、NSP1、NSP3)、犬(VP3、NSP5)、羔羊(NSP2)、马(VP6)、猕猴(VP1)、人(NSP4)以及人-牛基因重配(VP4)的轮状病毒株。其中VP1基因与猕猴轮状病毒(RRV)的同源性最高,为81.3%,但低于VP1基因分型的临界值83%,因此DZ株的VP1为新出现的基因型,命名为R17;分离株NSP3基因与法国RF株NSP3基因的同源性高达98%,DZ株与RF株的NSP3属于同一基因型,命名为T18型。所以,本研究分离的BRV DZ株的基因型为G6-P5-I2-R17-C2-M2-A3-N2-T18-E2-H5。VP7和VP4基因遗传进化分析结果显示,DZ株VP7基因来源于韩国KJ69-1株,VP4基因来源于美国疫苗株RotaTeq-SC2-9。与同源性最高的病毒株相比,DZ株VP4、VP7蛋白氨基酸序列分别发生了9处和8处突变。这些突变可能会引起VP7和VP4蛋白的抗原性和组织嗜性变化,进而影响病毒的免疫原性、宿主嗜性以及致病性。综上所述,DZ株是多宿主来源的基因重配病毒株,且主要抗原蛋白VP7和VP4发生了较大变异。本研究为我国BRV遗传进化及其分子流行病学和疫苗的研究奠定了实验基础。

关键词：牛轮状病毒基因序列分析重配株分离鉴定

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牛轮状病毒NSP5基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

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中国预防兽医学报 2021年第4期43卷 399-404,424页

作者：于德斌曹存徐晓静于力常继涛中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069 哈尔滨维科生物技术有限公司研发部黑龙江哈尔滨150069 内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010010

为建立检测牛轮状病毒(BRV)快速特异的荧光定量RT-PCR方法,本研究针对BRV NSP5基因设计了一对特异性引物经PCR扩增目的片段,并克隆于pCI载体作为重组质粒标准品(pCI-NSP5),经优化反应条件,建立了基于NSP5基因的BRV荧光定量RT-PCR方法,... 详细信息

为建立检测牛轮状病毒(BRV)快速特异的荧光定量RT-PCR方法,本研究针对BRV NSP5基因设计了一对特异性引物经PCR扩增目的片段,并克隆于pCI载体作为重组质粒标准品(pCI-NSP5),经优化反应条件,建立了基于NSP5基因的BRV荧光定量RT-PCR方法,并对其进行了特异性、敏感性及重复性试验。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法最佳引物浓度为10μmol/L,模板为2μL,退火温度为58℃;特异性试验结果显示,该方法除对BRV的检测结果为阳性外,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的最低检测限为12拷贝/μL,对BRV的最低检测限为1×102TCID50/反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法检测30份BRV接种犊牛的粪便样品,结果 25份呈阳性,而利用VP7基因的常规RT-PCR和病毒分离方法检出的阳性样品分别为20份和25份,表明本研究建立的检测方法的敏感性高于VP7基因的常规RT-PCR方法,而与病毒分离方法的符合率为100%。以上结果表明,本研究建立的BRV NSP5基因荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以用于BRV的快速检测、病原流行病学调查以及疫苗免疫攻毒试验的病毒载量定量等研究。

关键词：牛轮状病毒 NSP5基因荧光定量RT-PCR

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猪流行性腹泻病毒中和抗体PC10-IgG重组腺病毒的构建及其抗病毒效果的研究

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中国预防兽医学报 2020年第5期42卷 487-493页

作者：罗毅符芳李亮尹灵丹郭珊珊薛美孙元单玲玲李忍刘翔冯力刘平黄中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪消化道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069

为研制用于治疗仔猪PED的制剂,本研究将PEDV中和抗体PC10-IgG基因序列整合至人5型腺病毒(Ad5)骨架质粒中,构建的重组质粒经转染构建重组腺病毒Ad5-PC10-IgG。通过ELISA检测Ad5-PC10-IgG感染HEK293细胞的上清,以及采用SDS-PAGE、western ... 详细信息

为研制用于治疗仔猪PED的制剂,本研究将PEDV中和抗体PC10-IgG基因序列整合至人5型腺病毒(Ad5)骨架质粒中,构建的重组质粒经转染构建重组腺病毒Ad5-PC10-IgG。通过ELISA检测Ad5-PC10-IgG感染HEK293细胞的上清,以及采用SDS-PAGE、western blot检测上清中纯化的IgG,结果显示Ad5-PC10-IgG感染HEK293细胞能够分泌表达PC10-IgG,且该抗体效价较高。又将分泌表达的PC10-IgG进行了PEDV病毒结合试验[间接免疫荧光试验(IFA)]和病毒抑制试验(荧光定量PCR和IFA)。结果显示Ad5-PC10-IgG分泌表达的PC10-IgG不仅对PEDV具有良好的结合活性还能显著抑制PEDV感染Vero E6细胞。将Ad5-PC10-IgG感染猪小肠类器官模型肠小体,通过ELISA检测其感染后上清以及IFA检测感染的肠小体,结果表明Ad5-PC10-IgG可以感染肠小体并分泌表达PC10-IgG。将Ad5-PC10-IgG接种小鼠,ELISA方法检测采集的小鼠血清与肛拭子,并采用前述方法检测小鼠血清中的PC10-IgG对PEDV的结合活性及病毒抑制效果。结果显示,在接种后的第1 d、3 d、5 d的小鼠血清中均有较高含量的PC10-IgG,但在其肛拭子中没有检测到PC10-IgG,且该PC10-IgG对PEDV具有很好的结合活性和抑制其复制的效果。以上结果表明Ad5-PC10-IgG能够在体外与小鼠体内分泌表达有活性的中和抗体PC10-IgG。本研究为后续Ad5-PC10-IgG接种猪的试验以及研发PED治疗性抗体制剂奠定基础。

关键词： PEDV PC10-IgG 腺病毒载体中和抗体

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坦布苏病毒Du/CH/LSD/110128株原代毒及其鸡胚传代致弱毒在不同物种细胞中毒性和增殖能力的检测

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黑龙江畜牧兽医 2020年第5期 15-19,25,148页

作者：梁雨萌马勇陈志杰吴寒光刘胜旺李海中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽呼吸道传染病创新团队哈尔滨150069

为了寻找坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)致病机制的研究模型,试验利用实时荧光定量PCR技术检测坦布苏病毒Du/CH/LSD/110128株原代毒CF1及其鸡胚传代致弱毒CF100在不同物种细胞中的增殖情况,并将CF1与CF100分别在鸭胚中传代以检测病毒... 详细信息

为了寻找坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV)致病机制的研究模型,试验利用实时荧光定量PCR技术检测坦布苏病毒Du/CH/LSD/110128株原代毒CF1及其鸡胚传代致弱毒CF100在不同物种细胞中的增殖情况,并将CF1与CF100分别在鸭胚中传代以检测病毒对鸭胚的损伤情况。结果表明:CF1可在禽类细胞、哺乳类细胞中增殖,但不引起细胞损伤,CF100在禽类细胞、哺乳类细胞中不能增殖,只能在Vero细胞中增殖,且不引起细胞损伤;CF1和CF100在鸭胚中传代发现,传代CF1的鸭胚全身出现明显的出血,但传代CF100的鸭胚未见出血。说明相对于原代毒CF1,鸡胚传代毒CF100对细胞、鸭胚的损伤均降低,具有一定的安全性,可作为坦布苏病毒致病机制的研究模型。

关键词：坦布苏病毒(Tembusu virus,TMUV) 病毒感染实时荧光定量PCR 病毒增殖致细胞病变效应研究模型

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稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系的建立

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中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 893-898页

作者：刘燕飞那雷王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系... 详细信息

为建立基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除细胞文库,本研究利用慢病毒载体pMD2.G、pSPAX2(HIV-1的gag-pol表达质粒)和lentiCRISPR v2-Hyg包装慢病毒,感染HeLa细胞2 d后用400μg/mL潮霉素培养液筛选两周,获得稳定表达Cas9蛋白的多克隆细胞系。利用流式细胞分选系统分选及western blot鉴定获得9株HeLa-Cas9单克隆细胞系。为获得具有高效率敲除内源基因的HeLa细胞系,利用同时表达绿色荧光蛋白(GFP)和GFP sgRNA的慢病毒感染HeLa-Cas9单克隆细胞系,经1μg/mL嘌呤霉素培养液筛选一周,流式细胞术检测表达绿色荧光蛋白细胞的百分比,以计算HeLa细胞株的敲除效率,进而建立了一株稳定表达Cas9蛋白的具有高敲除效率的HeLa单克隆细胞系。该细胞的Cas9敲除效率为87%,CCK-8检测结果表明其具有很好的细胞活性。本研究获得的具有高敲除效率的稳定表达Cas9蛋白的HeLa细胞系可以用于CRISPR敲除文库的转导,建立基因敲除细胞文库,为筛选参与特定功能的未知蛋白提供细胞平台。

关键词： Cas9蛋白 HeLa细胞系基因敲除效率

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马M2型CD163单克隆抗体的制备及其在巨噬细胞极化类型检测中的应用

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中国预防兽医学报 2020年第11期42卷 1159-1166页

作者：段盈伊王欣慧陈克伟刘荻萩戚亭郭奎杜承王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

本研究分别采用M1型诱导剂LPS+IFN-γ,M2型诱导剂IL-4或者IL-10刺激马巨噬细胞后,经荧光定量PCR检测巨噬细胞中5种细胞因子和3种表面标记物的转录水平,以确定M1和M2型马巨噬细胞的极比标志物和分泌的细胞因子。为方便快捷地检测马巨噬... 详细信息

本研究分别采用M1型诱导剂LPS+IFN-γ,M2型诱导剂IL-4或者IL-10刺激马巨噬细胞后,经荧光定量PCR检测巨噬细胞中5种细胞因子和3种表面标记物的转录水平,以确定M1和M2型马巨噬细胞的极比标志物和分泌的细胞因子。为方便快捷地检测马巨噬细胞经不同病原感染后的极化表型,本实验截取马巨噬细胞极化标志物CD163基因的SRCR1~SRCR4区域,并分别经原核和真核表达系统表达该重组蛋白CD163。将原核表达的马CD163蛋白免疫小鼠制备CD163的单克隆抗体(MAb),经western blot和激光共聚焦检测该MAb的反应性。以上述实验为基础,采用荧光定量PCR检测不同病原感染巨噬细胞后的3种极化标志物和3种细胞因子基因的转录水平以确定感染后的巨噬细胞的极化表型;将不同病原感染马巨噬细胞24 h后,利用制备的CD163 MAb分别采用流式细胞术检测表达CD163蛋白的马巨噬细胞数量,以及采用western blot检测不同病原感染巨噬细胞后的CD163蛋白的表达量,以进一步鉴定马巨噬细胞的极化状态。荧光定量PCR结果表明,经LPS+IFN-γ诱导后,马巨噬细胞向M1型发生了极化,TNF-α、IL-1β、IL-12、CD80基因可以作为鉴定M1型马巨噬细胞的标记基因;而经IL-4或者IL-10诱导后,马巨噬细胞向M2型发生了极化,TGF-β、IL-10、CD206、CD163基因可以作为鉴定M2型马巨噬细胞的标记基因。MAb western blot和激光共聚焦结果显示,该MAb与真核表达的CD163蛋白以及经IL-10诱导后马巨噬细胞表达的内源性CD163蛋白均能够很好反应,可以用于马巨噬细胞极化状态的检测。荧光定量PCR结果显示,马流产沙门氏菌(*** equi)、马疱疹病毒(EHV-1)和马动脉炎病毒(EAV)感染马巨噬细胞24 h后,M1型细胞因子TNF-α、IL-1β和其表面标记物CD80基因mRNA的转录水平均显著上调(p<0.05),而EIAV感染24 h后,M2型细胞因子IL-10和其表面标记物CD206、CD163基因的mRNA的转录水平均不同程度的上调。表明*** equi、EHV-1和EAV均能诱导马巨噬细胞极化为M1型,并释放大量促炎性因子,而EIAV则可以诱导巨噬细胞极化为M2型,产生了抑炎因子。利用制备的CD163 MAb经流式细胞术和westen blot鉴定结果均表明,在各病原感染早期,EIAV感染可以诱导马巨噬细胞极化为M2型,而其余3种病原未能诱导马巨噬细胞发生M2型的极化。本研究制备了CD163 MAb并利用其检测了不同病原感染后马巨噬细胞极化的表型,丰富了相关疾病发生机制研究的生物学工具。

关键词：马 M2型巨噬细胞 CD163蛋白单克隆抗体

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基于Gluc的马源NLRP3炎症小体激活系统的建立

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中国预防兽医学报 2020年第10期42卷 1039-1044页

作者：王岩刘聪那雷王雪峰林跃智王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立一种快速、敏感的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统,本研究利用PCR扩增马IL-1β(eqIL-1β)、马Caspase-1(eqCaspase-1)、马ASC(eqASC)和马NLRP3(eqNLRP3),构建重组真核表达质粒pCAGGS-eqIL-1β-flag、pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag、pCAGGS-eqCaspase-1-HA、pcDNA3.1-eqASC-HA和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA,分别转染HEK 293T细胞,培养24 h后采用western blot方法检测细胞中各蛋白的表达,结果显示各重组质粒均构建正确,且均在HEK 293T细胞中正确表达;通过质粒共转染HEK 293T细胞依次对NLRP3炎症小体复合物中不同组分进行剂量依赖性试验,培养24 h后采用western blot检测细胞中切割的eqIL-1β蛋白,利用荧光素酶底物检测细胞上清中的荧光强度,结果显示NLRP3炎症小体体外激活系统中各质粒的最适转染剂量分别为pCAGGS-eqIL-1β-GLuc-flag 250 ng、pCAGGS-eqCaspase-1-HA 3.12 ng、pcDNA3.1-eqASC-HA 3.12 ng和pcDNA3.1-eqNLRP3-HA 6.25 ng;通过在该系统中加入不同剂量的NLRP3炎症小体激活剂(Nigericin),检测该系统有效性,结果显示细胞中切割的IL-1β蛋白水平以及上清中的荧光强度与Nigericin存在剂量依赖性,表明基于Gluc的马源NLRP3炎症小体体外激活系统正确构建,且其能对马源NLRP3炎症小体激活的相关蛋白和药物进行筛选。本研究建立的马源NLRP3炎症小体的体外激活检测系统为马属动物炎症及炎症小体调控方面的研究提供重要的工具。

关键词： NLRP3炎症小体 IL-1β Gluc

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A型流感病毒NP蛋白双单抗夹心ELISA检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2020年第6期42卷 572-578页

作者：徐菱张振宇郭兴于萌萌王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为建立广谱型A型流感病毒(IAV)快速检测方法,本研究选用流感病毒中高度保守的核糖核蛋白(NP)为抗原,采用真核表达系统纯化NP蛋白,并免疫小鼠,按常规方法制备IAV NP蛋白单克隆抗体(MAb)。以制备的SC06 MAb作为捕获抗体,XJ04 MAb作为检测... 详细信息

为建立广谱型A型流感病毒(IAV)快速检测方法,本研究选用流感病毒中高度保守的核糖核蛋白(NP)为抗原,采用真核表达系统纯化NP蛋白,并免疫小鼠,按常规方法制备IAV NP蛋白单克隆抗体(MAb)。以制备的SC06 MAb作为捕获抗体,XJ04 MAb作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IAV NP蛋白的双单抗夹心ELISA方法。结果显示,该检测方法捕获抗体浓度为2 mg/mL,0.1μg/孔,检测抗体浓度为1 mg/mL,0.05μg/孔,NP蛋白浓度在6.07 ng/mL^101.57 ng/mL时与OD450nm呈良好的线性关系,相关系数R2>0.99。该双单抗夹心ELISA方法可以特异性检测多个亚型IAV,特异性强;与血凝试验相比,该双单抗夹心ELISA方法具有很高的灵敏度,可以检测到20 ng/mL的病毒NP蛋白;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好。利用本研究建立的双单抗夹心ELISA方法与RT-PCR方法同时对28份马鼻拭子样品进行检测,结果显示二者总符合率为71.43%。本研究建立的ELISA方法可以用于甲型流感的快速诊断,也可为NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。

关键词： A型流感病毒 NP蛋白双单抗夹心ELISA

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