检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2009年第9期39卷 779-785页

作者：黄立平刘长明危艳武陆月华郭龙军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法。用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%... 详细信息

利用PCV2-Cap蛋白中和性单克隆抗体建立了一种检测猪血清中PCV2中和抗体的阻断ELISA方法。用该方法与免疫过氧化物酶单层细胞试验对353份试验猪血清样品进行平行检测,结果两种方法的符合率为96.0%;该方法的敏感性为97.9%,特异性为92.4%,且与其他几种猪病毒参考阳性血清无交叉反应。该阻断ELISA与血清中和试验的检测结果呈显著正相关(r=0.997 0),其敏感性还优于血清中和试验。用阻断ELISA对PCV2灭活疫苗免疫与攻毒试验猪血清样品进行检测,结果显示,疫苗接种后第2周就能检测到PCV2中和抗体,4周后阳转率达100%。另外,用该方法对东北三省不同地区送检的703份血清样品进行检测,结果阳性检出率为73.0%。表明,东北三省猪场中的PCV2感染率较高,危害严重。

关键词：猪圆环病毒2型中和抗体单克隆抗体阻断ELISA

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立

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中国预防兽医学报 2007年第9期29卷 704-709页

作者：郝晓芳周艳君田志军韦天超安同庆彭金美华荣虹童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory ... 详细信息

2006年5月以来,我国部分猪场暴发了一种以高热、高发病率和高死亡率为特征的传染性疾病,经病原分离及分子流行病学分析证明是由一种带有nsp2部分缺失的、对猪呈高致病性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的。本实验参考GenBank发表的以及本实验室分离鉴定的PRRSV的nsp2基因序列,在nsp2缺失区的两端的保守区设计并合成了一对引物,建立了一种PRRSV的RT-PCR检测方法。该方法扩增高致病性PRRSV基因组时可获得230bp的片段,扩增经典型PRRSV时则获得320bp的片段,根据RT-PCR产物大小可将二者区分开来。通过大量临床病料的检测,并配合PCR产物测序验证,结果表明该方法简便、快速、特异,可以鉴别高致病性PRRSV,为进一步的PRRS流行病学研究提供了重要的技术手段。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒基因缺失 RT-PCR 鉴别诊断

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猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1R株致弱过程中ORF5基因遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2007年第9期29卷 665-670页

作者：吴国军蔡雪辉刘永刚王洪峰王淑杰石文达马平张琪李成君中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行R... 详细信息

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株在Marc-145细胞上传代,用85代(S85)病毒对35日龄的仔猪进行人工感染试验,证实该毒株已经被致弱,将其命名为CH-1R株。利用RT-PCR扩增10个不同代次的CH-1a株和CH-1R株病毒的ORF5基因,并与9株参考毒株进行RFLP分析,发现了一个特异性的内切酶酶切位点-TspEⅠ。根据该酶切位点,可以区分CH-1R株、CH-1a株、其它野生型毒株和参考毒株。ORF5基因的变异分析显示,该致弱毒株与CH-1a株以及其它8株参考毒株存在着差异,并且它们的氨基酸同源性在88.5%～97.0%之间。系统进化树研究表明该弱毒株仍属于CH-1a亚支。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 CH—1R株 ORF5 变异分析

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与猪圆环病毒2型基因组茎环结构相互作用的宿主细胞蛋白的筛选

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中国兽医科学 2013年第12期43卷 1211-1216页

作者：张辉唐青海危艳武黄立平张志慧刘建波吴洪丽刘长明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库... 详细信息

利用酵母单杂交技术对猪圆环病毒2型(PCV2)基因组复制起始处茎环结构序列与PK-15细胞中的互作蛋白进行了筛选和鉴定。首先将合成的PCV2复制起始处的茎环结构序列整合到酵母染色体中构建诱饵酵母菌株;采用SMART技术合成PK-15细胞cDNA文库,将总cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化酵母诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建,以药物筛选阳性克隆;通过酵母菌落PCR得到阳性克隆中的cDNA插入片段,通过序列分析对此予以确认。本试验成功地构建了酵母单杂交文库,筛选出1.01×106个酵母克隆,其中196个为阳性克隆。经PCR产物测序,并通过NCBI Blast法进行序列比对,确定有4种蛋白可与PCV2基因组茎环序列发生作用。本研究从宿主细胞cDNA文库中筛选到4种可与PCV2基因组茎环序列发生作用的蛋白,为下一步阐明这些宿主蛋白对PCV2复制的调节作用奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型茎环结构宿主细胞互作蛋白

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HBR变异株第125代的毒力试验

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中国兽医科学 2011年第2期41卷 152-158页

作者：危艳武刘长明范培虎吴洪丽温士刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/... 详细信息

从临床病例中分离到1株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株HBR,经细胞传代和蚀斑克隆获得了1株增殖性能稳定的传代毒株。为了检测该毒株在Marc-145细胞传代过程中毒力的变化,用PRRSV-HBR株第125代培养物(毒价为107.5 TCID50/mL)经肌肉注射和滴鼻途径接种18头35日龄PRRSV抗体阴性猪,同时设未接种对照组。结果试验猪未出现明显的临床症状。用RT-PCR法检测试验猪血清,从第3天开始出现阳性,第7～14天达到高峰,第28天后转为阴性。对同一时间迫杀的试验猪检测各脏器组织中的病毒抗原分布情况,结果表明,感染后第7～14天试验猪多数脏器呈阳性反应,第21～42天病毒集中在脾、腹股沟淋巴结、颌下淋巴结等组织。病理学观察发现,第7～14天试验猪淋巴结及肺出现轻度病变。动物感染试验表明,尽管试验猪未显示明显的临床症状,但从病毒血症、病毒体内分布、病理变化等方面看,该毒株仍然具有一定的毒力,用于弱毒疫苗的研制还有待进一步驯化致弱。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒变异毒株细胞传代毒力试验

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猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5和ORF6在真核细胞中表达

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中国预防兽医学报 2007年第7期29卷 501-505,514页

作者：闫丽萍周艳君侯艳红华荣虹安同庆童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基... 详细信息

用PCR方法从重组质粒pOKCH-1a扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因ORF3、ORF5、ORF6,将它们分别定向克隆到含有鸡β-actin启动子的高效真核表达载体pCAGGS的多克隆位点,经酶切、PCR及测序分析,筛选鉴定出含有ORF3、ORF5、ORF6基因的重组质粒,分别命名为pCAGGS-ORF3、pCAGGS- ORF5、DCAGGS-ORF6。将重组质粒纯化后转染293T细胞,用RT-PCR扩增出了特征性的基因片段,并采用特异性单抗进行间接免疫荧光检测,结果在胞浆内有亮绿色荧光,而在细胞膜上没有见到荧光,这说明表达的蛋白在胞浆内而不在细胞膜上。通过Westerm blot检测确定表达的GP3、GP5和M蛋白的分子量分别为42 Ku、25 Ku和19 Ku。本试验结果为进一步研究PRRSV膜蛋白伪病毒粒子及DNA疫苗奠定了基础。

关键词：繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白基因真核表达

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高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及其体外传代遗传变异分析

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中国预防兽医学报 2008年第5期30卷 329-334页

作者：刘长明危艳武张朝霞袁婧黄立平中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从临床"高热综合征"病例分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代和蚀斑克隆,培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-HBR。该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),随传代次数增加毒价显著提升,第4... 详细信息

从临床"高热综合征"病例分离到高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株,经细胞传代和蚀斑克隆,培育成功增殖性能稳定的新毒株,命名为PRRSV-HBR。该毒株接种细胞后能够产生细胞病变(CPE),随传代次数增加毒价显著提升,第45～60代毒价测定达107.5TCID50/mL。采用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)检测病毒抗原分布在细胞浆中;电镜观察到的病毒粒子呈圆形,直径约50nm～55nm。分离株Nsp2基因序列中第483位和535～563位氨基酸存在缺失,属PRRSV变异株。该毒株Nsp2基因序列比较发现,经细胞传40代后第3115位核苷酸处插入12个碱基序列(GAGATCGCCTTT)。用该毒株第5代培养物滴鼻接种试验猪(1.0×104.5TCID50),临床表现为持续高热(≥40.5℃,9d～12d)、食欲下降、精神萎靡、消瘦、眼睑水肿、体表淋巴结肿大等,发病率为100%(10/10),死亡率为30%(3/10)。研究表明,PRRSV-HBR分离株对靶动物具有高致病力,培育的细胞适应毒株体外繁殖能力稳定,并产生了标志性基因突变,为该病毒致病机理、遗传变异规律、疫苗免疫等研究奠定了基础。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性遗传变异分析

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共表达PRRSVGP5蛋白和CSFV E2蛋白的“自杀性”DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答

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生物工程学报 2008年第10期24卷 1714-1722页

作者：孙建富赵和平李娜孙元夏照和周艳君王煜祁巧芬鲁承仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室哈尔滨150001 延边大学农学院动物医学系龙井133400

为了获得新型双价"自杀性"DNA疫苗,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的甲病毒复制子载... 详细信息

为了获得新型双价"自杀性"DNA疫苗,将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5基因克隆于此前构建的表达猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的甲病毒复制子载体疫苗pSFV1CS-E2中。为了增强免疫效果,在密码子优化的GP5基因中插入了泛DR表位(PADRE),在CSFV E2基因后融合伪狂犬病病毒(PrV)UL49基因,获得了6种重组质粒。间接免疫荧光试验显示,PRRSV GP5和CSFV E2基因在瞬时转染的293T细胞中得到同时表达。将6种重组质粒和空载体pSFV1CS分别免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA方法检测血清抗体水平,通过基于CSFE/WST-8的淋巴细胞增殖试验和细胞因子ELISA评价疫苗诱导的细胞免疫。结果显示,除pSFV1CS组外,从各疫苗组小鼠血清中均可检测到低水平的针对GP5和E2蛋白的抗体;各疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后均能诱导特异性的淋巴细胞增殖;部分疫苗组小鼠脾细胞经CSFV和PRRSV刺激后可分泌较高水平的IFN-γ和IL-4;引入UL49的疫苗组细胞免疫应答显著高于其它疫苗组。结果表明,这些共表达GP5和E2蛋白的自杀性DNA疫苗可以诱导体液免疫和细胞免疫,PrV UL49可以增强其细胞免疫应答。

关键词： “自杀性”DNA疫苗猪繁殖与呼吸综合征病毒猪瘟病毒泛DR表位 VP22转导蛋白共表达

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传染性支气管炎重组鸡痘病毒免疫鸡对LHLJ04XI株病毒攻击的免疫保护作用

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中国预防兽医学报 2008年第1期30卷 47-52页

作者：石星明王云峰王玫刘胜旺童光志何来贺笋崔红玉胡文玮韩文雄中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

将表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγ S1)接种SPF鸡后,用与S1基因亲本毒株具有相同致病型且遗传关系较近的现地分离株LHLJ04XI病毒进行攻击,评价重组疫苗对现地分离病毒的保护效果。结果显示,重组... 详细信息

将表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒(rFPV-IFNγ S1)接种SPF鸡后,用与S1基因亲本毒株具有相同致病型且遗传关系较近的现地分离株LHLJ04XI病毒进行攻击,评价重组疫苗对现地分离病毒的保护效果。结果显示,重组病毒在免疫后1周即可检出ELISA抗体,并且免疫组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞含量均有显著上升。当用LHLJ04X I株病毒及亲本毒LX4攻击后,免疫鸡的肝脏、肾脏、脾脏及肺脏等脏器的病理损伤程度明显轻于非免疫对照组,排毒时间缩短,攻毒后现地分离株攻击的免疫组的发病率为27.3%(3/11),死亡率为9.1%(1/11),亲本毒攻击的免疫组发病率为26.67%(4/15),死亡率为6.67%(1/15),两者没有明显差异,而非免疫对照组的发病率和死亡率分别为100%(11/11)和45.5%(5/11),与免疫组相比差异显著,说明重组疫苗对免疫鸡具有较好的保护效果。体重测定结果表明,攻毒前重组疫苗免疫组和非免疫对照组的体重差异不显著(P>0.05),攻毒以后免疫组体重的增加幅度高于非免疫对照组。以上结果表明,共表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒活载体疫苗能对异源现地分离株的攻击产生较好的免疫保护,同时也减轻了重组疫苗对体重增长的抑制作用。

关键词：传染性支气管炎鸡痘病毒免疫保护

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表达O型口蹄疫病毒VP1中和表位的重组猪圆环病毒2型毒株的构建及其生物学特性

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中国兽医科学 2012年第5期42卷 448-453页

作者：张飞雁唐青海黄立平危艳武吴洪丽郭龙军付玉洁刘长明中国农业科学院、哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室、猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组... 详细信息

为构建以猪圆环病毒2型(PCV2)为载体,表达O型口蹄疫病毒(FMDV)中和表位的重组病毒,将FMDV-VP1蛋白中和抗原表位(第141～160位氨基酸)插入PCV2-ORF2编码的Cap蛋白C-末端,利用感染性克隆技术拯救出1株表达FMDV-VP1的中和抗原表位PCV2重组毒株(命名为recPCV2-CL-VP1);采用免疫过氧化物酶单层试验、捕获ELISA和免疫电镜技术鉴定该重组病毒。结果表明,在重组病毒感染细胞中检出PCV2特异性抗原及VP1表位抗原;重组病毒的形态学特征与亲本病毒相似,可采用PCR和ELISA法相鉴别;拯救毒株的繁殖能力较亲本毒差,经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定。证实成功构建了1株表达FMDV-VP1中和抗原表位的PCV2重组病毒,为进一步研制基因工程疫苗奠定了基础。

关键词：猪圆环病毒2型口蹄疫病毒 VP1蛋白中和表位重组病毒

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