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中国预防兽医学报 2005年第5期27卷 332-335页

作者：刘丽玲王秀荣陈化兰邓国华乔传玲李呈军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

通过反转录_聚合酶链式反应(RT_PCR)技术对禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA分别进行扩增,然后将其克隆到PMD18_T载体后进行序列测定和拼接;并将克隆到的8个基因片段与以下毒株... 详细信息

通过反转录_聚合酶链式反应(RT_PCR)技术对禽流感病毒A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)的8个基因片段即PA、PB1、PB2、NS、NP、M、HA、NA分别进行扩增,然后将其克隆到PMD18_T载体后进行序列测定和拼接;并将克隆到的8个基因片段与以下毒株各个基因的相应序列进行比较分析:Duck/HongKong/Y280/97(DHKY280/97)、Duck/HongKong/YT439/97(DHKY439/97)、Quail/HongKong/G1/97(QHKG1/97)、A/Chicken/Beijing/1/94(CBJ1/94)、Chicken/HongKong/G9/97(CHKG9/97)、A/Turkey/California/1/66(TC/1/66)。结果表明:我们克隆到的TW1/66株的8个基因片段均含有相应病毒基因的完整开放阅读框架:TW1/66的各基因与TC/1/66株相应各基因同源性最高(NS基因除外,同源性只有67.4%)。与其它各毒株各基因同源性均较低,但与DHKY439/97各基因同源性高于与DHKY280/97、QHKG1/97、CBJ1/94、CHKG9/97各基因同源性。

关键词：禽流感病毒基因克隆序列测定

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鸡传染性支气管炎病毒S1基因和鸡II型干扰素基因在重组鸡痘病毒中的共表达

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畜牧兽医学报 2005年第8期36卷 800-806页

作者：孙永科田占成王云峰童光志智海东刘胜旺王玫杨增岐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 西北农林科技大学动物科技学院杨凌712100

将鸡II型干扰素(ChIFNγ)基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插入到鸡痘病毒转移载体中,构建含有这2个基因的鸡痘病毒转移载体pSY-ChIFNγS1。采用脂质体法将该质粒转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经过8轮蓝斑筛选,得到纯化... 详细信息

将鸡II型干扰素(ChIFNγ)基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插入到鸡痘病毒转移载体中,构建含有这2个基因的鸡痘病毒转移载体pSY-ChIFNγS1。采用脂质体法将该质粒转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经过8轮蓝斑筛选,得到纯化的能够同时表达鸡II型干扰素和鸡传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒rFPV-ChIFNγS1。rFPV-ChIFNγS1接种28日龄的SPF鸡1周后,可以检测到针对传染性支气管炎病毒S1基因的ELISA抗体,重组病毒接种鸡的CD4+、CD8+和γδTCR阳性T淋巴细胞的百分比含量显著高于非免疫对照鸡(P<0.05);免疫4周后用传染性支气管炎LX4强毒株攻击,rFPV-ChIFNγS1免疫组仅有1只出现轻微的呼吸道症状(1/16),而非免疫对照组则有16只发病(16/16),并有2只出现死亡(2/16),表明rFPV-ChIFNγS1对接种鸡可以产生良好的保护效果。

关键词：传染性支气管炎病毒鸡Ⅱ型干扰素重组鸡痘病毒

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表达鸡Ⅱ型干扰素重组鸡痘病毒的构建及其特性分析

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农业生物技术学报 2005年第1期13卷 81-85页

作者：孙永科王云峰智海东刘胜旺王玫童光志杨凌712100 哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001 西北农林科技大学动物科技学院

将鸡Ⅱ型干扰素(ChIFNγ)基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681-ChIFNγ。将pSY681-ChIFNγ转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组,产生表达Ch... 详细信息

将鸡Ⅱ型干扰素(ChIFNγ)基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681-ChIFNγ。将pSY681-ChIFNγ转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组,产生表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒rFPV-ChIFNγ。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,通过PCR和间接免疫荧光等实验证实获得纯化的、表达ChIFNγ的重组鸡痘病毒。将在鸡胚成纤维细胞中培养72h的rFPV-ChIFNγ上清接种小鼠成纤维细胞(L929),通过细胞病变抑制实验证明重组ChIFNγ具有抑制水疱性口炎病毒复制的活性,培养上清的抗病毒效价为2048U/mL。

关键词：鸡IFN-Ⅱ基因重组鸡痘病毒

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传染性喉气管炎病毒王岗株gB基因gC基因和gD基因的真核表达

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中国兽医科技 2005年第7期35卷 520-524页

作者：王利丽王云峰智海东王玫步志高冉多良童光志中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点,经过酶切、测序分析,筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒,分别命名为pCAGGgB、pCAGGgC、pCAGGgD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进... 详细信息

将传染性喉气管炎病毒(ILTV)王岗(WG)株的gB、gC、gD基因分别克隆到真核表达载体pCAGGS的EcoRⅠ位点,经过酶切、测序分析,筛选鉴定出含有gB、gC、gD基因的重组质粒,分别命名为pCAGGgB、pCAGGgC、pCAGGgD。用质粒纯化试剂盒对重组质粒进行了纯化,将纯化后的质粒转染293T细胞,用间接免疫荧光技术检测了目的蛋白的表达情况。检测结果表明,目的蛋白得到了真实的表达。

关键词：传染性喉气管炎病毒 gB基因 gC基因 gD基因真核表达

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镉致鸡脾脏淋巴细胞DNA损伤的研究

引用

畜牧兽医学报 2005年第4期36卷 362-364页

作者：李金龙熊永忠徐世文王秀荣李术东北农业大学动物医学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150001

应用片段化DNA定量分析法和碱性单细胞凝胶电泳法,检测了10μmol/L镉对体外不同时间培养的鸡脾脏淋巴细胞DNA损伤的情况,结果表明:10μmol/L的镉能够明显损伤鸡脾脏淋巴细胞DNA,并且呈现时间效应。提示镉致淋巴细胞DNA损伤是镉对禽类免... 详细信息

应用片段化DNA定量分析法和碱性单细胞凝胶电泳法,检测了10μmol/L镉对体外不同时间培养的鸡脾脏淋巴细胞DNA损伤的情况,结果表明:10μmol/L的镉能够明显损伤鸡脾脏淋巴细胞DNA,并且呈现时间效应。提示镉致淋巴细胞DNA损伤是镉对禽类免疫毒性的重要机制之一。

关键词：脾脏淋巴细胞 DNA损伤镉鸡凝胶电泳法定量分析法时间效应免疫毒性 mol 单细胞片段化禽类

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禽痘病毒感染对禽流感重组禽痘病毒疫苗免疫效力的影响

引用

中国预防兽医学报 2005年第2期27卷 154-156页

作者：乔传玲李呈军于康震田国彬刘宝全陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室及兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 全国畜牧兽医总站东北农业大学

表达禽流感病毒 (AIV)HA和NA基因的重组禽痘病毒rFPV_HA_NA能够诱导鸡体产生 10 0 %抵抗高致病性禽流感病毒 (HPAIV)H5N1的攻击。而当鸡群已进行禽痘疫苗免疫或者感染了禽痘病毒的情况下 ,此重组疫苗的免疫效力如何 ?首先用禽痘病毒S_FP... 详细信息

表达禽流感病毒 (AIV)HA和NA基因的重组禽痘病毒rFPV_HA_NA能够诱导鸡体产生 10 0 %抵抗高致病性禽流感病毒 (HPAIV)H5N1的攻击。而当鸡群已进行禽痘疫苗免疫或者感染了禽痘病毒的情况下 ,此重组疫苗的免疫效力如何 ?首先用禽痘病毒S_FPV_0 17人工感染SPF试验鸡 ,既而在感染后的不同间隔时间接种重组疫苗 ,免疫后检测鸡群的HI抗体水平 ,同时用 10 0LD50 的HPAIVH5N1进行攻击。结果重组疫苗免疫与禽痘病毒人工感染时间间隔在 4周 (或以上 )时 ,预先感染禽痘病毒对重组疫苗的免疫效力不构成影响 ,对禽流感的保护力为 10 0 % ,而间隔时间在 1、2、3周时 ,重组疫苗的免疫保护效力则受到不同程度的影响。

关键词：禽痘病毒禽流感重组禽痘病毒疫苗免疫效力

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杆状病毒表达SARS冠状病毒纤突蛋白及其抗原性分析

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中国预防兽医学报 2005年第6期27卷 549-552页

作者：王喜军胡森王清华邓国华王笑梅吴东来申之义步志高中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 内蒙古农业大学动物科学与医学学院内蒙古呼和浩特010018

本研究构建了SARS冠状病毒纤突蛋白(S)重组杆状病毒(rBac-SS)。SDS-PAGE及Western-Blot分析表明约190 Ku左右的重组SARS纤突蛋白(rSS)在rBac-SS感染sf9昆虫细胞获得表达,并具有特异免疫反应原性。以rBac-SS感染的昆虫细胞裂解物稀释后... 详细信息

本研究构建了SARS冠状病毒纤突蛋白(S)重组杆状病毒(rBac-SS)。SDS-PAGE及Western-Blot分析表明约190 Ku左右的重组SARS纤突蛋白(rSS)在rBac-SS感染sf9昆虫细胞获得表达,并具有特异免疫反应原性。以rBac-SS感染的昆虫细胞裂解物稀释后直接包被ELISA板,与Vero细胞培养的全病毒裂解物比较,检测SARS-CoV康复病人血清特异抗体,表现出同样的敏感性和特异性;rBac-SS感染的昆虫细胞用于间接免疫荧光,快速检测血清特异抗体反应,具有良好的敏感性和特异性。结果显示,杆状病毒表达的rSS有望替代SARS-CoV全病毒,作为安全、敏感和特异的重组诊断抗原,并为探索重组亚单位疫苗的可行性奠定基础。

关键词： SARS冠状病毒纤突蛋白重组杆状病毒 ELISA IFA

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鹅细小病毒分离株HG5/82的分子特征分析

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中国病毒学 2005年第1期20卷 28-32页

作者：孔宪刚李桂霞刘胜旺冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

本研究应用PCR技术扩增得到GPV中国分离株HG5/82的非结构基因与结构基因,片段大小分别约为1.9kb、2.2kb的片段。将该片段分别进行克隆及序列测定,并与 GPV 国内外部分已发表的毒株及番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的对应... 详细信息

本研究应用PCR技术扩增得到GPV中国分离株HG5/82的非结构基因与结构基因,片段大小分别约为1.9kb、2.2kb的片段。将该片段分别进行克隆及序列测定,并与 GPV 国内外部分已发表的毒株及番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)的对应序列比较。结果表明:HG5/82 株非结构蛋白(Non structure, NS)基因长为1884bp,编码627个氨基酸。HG5/82株结构蛋白基因长为2199bp,编码732个氨基酸。序列分析结果表明,我国地方分离株与国内外鹅细小病毒相比,ns基因、vp基因均表现出较高的同源性,并且具有共同的分子特征。为进一步研究GPV的基因功能、遗传变化规律及病毒分子致病机理提供了一定的分子基础。结构基因 VP3 间变异较小,这是目前GPV只有一个血清型的分子基础,为基因工程苗的研制提供了可行性。HG5/82 与番鸭细小病毒相应序列比较发现,与细小病毒其它成员相比两者具有较近的亲源关系,但这种同源性明显低于鹅细小病毒之间的同源性。

关键词：鹅细小病毒 ns基因 vp基因分子特征

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鹅细小病毒vp2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备

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中国病毒学 2005年第4期20卷 383-387页

作者：侯秋莲王静刘胜旺孔宪刚韩宗玺冉多良中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830052

根据鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖。筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用NcoI酶切后回收... 详细信息

根据鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖。筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用NcoI酶切后回收目的片断,进行定向连接,产物转化入感受态DH5α,重组质粒经酶切和测序证实目的基因正确克隆到表达载体的预期位点且插入方向正确,构建了含有HG5/82主要结构基因vp25’端969bp片段的原核表达载体。经IPTG诱导后表达出与预期大小相符的约36kDa的融合蛋白,表达形式为包涵体。薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%。包涵体通过6mol/L盐酸胍裂解后,利用镍离子亲和树脂进行纯化,用纯化的分子量为36kDa的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体。Westernblot分析表明该多克隆抗体与HG5/82毒株具有反应性,说明该融合蛋白具有抗原性。

关键词：鹅细小病毒 vp2基因克隆表达多克隆抗体

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H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化的研究

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中国预防兽医学报 2005年第1期27卷 13-17页

作者：陈君彦李海燕申之义陈化兰于康震毕英佐中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室内蒙古农业大学动物科学与医学学院全国畜牧兽医总站北京100026 华南农业大学动物科学学院

对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型... 详细信息

对 2 0 0 1年中国华南及东北地区的 15株H1N1亚型猪流感病毒 (SIV)分离株的血凝素 (HA)基因进行了序列测定和分析 ,并绘制了进化树。研究结果表明 ,15株H1N1SIV和HA基因核苷酸全长为 1778bp ,共编码 5 6 6个氨基酸 ;而且 ,15株H1N1亚型SIV的HAI蛋白在 10、11、2 3、87、2 87位都存在高度保守的糖基化位点 ,此外 ,在 2 76位多了一个“_NTT_”糖基化位点 ,与参考毒株SW /IW / 93/ 0 1一致 ,这可能是近期H1N1亚型SIV的一个分子特征。本研究进一步发现 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因切割位点氨基酸组成为IPSIQSR↓G ,具有非高致病力毒株分子特征 ;而其受体结合位点在HA蛋白上第 2 2 6位是Q ,第 2 2 8位是G ,可能具有感染禽的潜力。经同源性比较 ,15株H1N1亚型SIV的HA基因与古典型H1N1猪谱系中的WIS/ 4 75 4 / 94的同源性相对最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别达到 95 7%～ 96 1%和96 5 %～ 97 2 %。由同源性比较结果和进化树分析可见。

关键词： H1N1亚型猪流感病毒中国分离株血凝素基因分子演化序列分析

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