检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物工程杂志 2018年第7期38卷 67-74页

作者：李亚芳赵颖慧刘赛宝王伟曾为俊王金泉陈洪岩孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽... 详细信息

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体pOV_（1.1k）-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及HA试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以10~6EID_（50）H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,无排毒现象,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护;为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白奠定了基础。

关键词：鸡卵清蛋白启动子 HA 禽流感病毒免疫保护输卵管生物反应器

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稳定表达人、马Tetherin蛋白的MDCK细胞系的构建及其限制流感病毒活性的研究

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中国预防兽医学报 2018年第7期40卷 626-629页

作者：王美月张振宇王晓钧中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队黑龙江哈尔滨150069

为评估人、马Tetherin(hu Tetherin、eq Tetherin)限制流感病毒的活性,本研究将huTetherin、eqTetherin克隆于慢病毒表达载体pLPCX中,分别构建重组质粒pLPCX-HA-hu Tetherin、pLPCX-HA-eqTetherin,并构建pLPCX-HA作为阴性对照。将上述构建的重组质粒,pVSV-G以及pcGP共转染293T细胞,获得假病毒后感染MDCK细胞,并利用嘌呤霉素筛选、纯化,建立稳定表达huTetherin和eqTetherin的MDCK细胞系。经western blot鉴定显示,该细胞系中huTetherin和eqTetherin可稳定表达。以反向遗传救获的马流感病毒(A/equine/Jilin/1/1989)(JL89)感染这两种细胞系,结果显示eqTetherin和huTetherin均对该流感病毒株具有显著限制作用。该研究为进一步评价和探索huTetherin和eqTetherin限制流感病毒的作用和机制奠定了基础。

关键词：人、马Tetherin MDCK细胞系流感病毒

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稳定表达犬SLAM受体的Vero细胞系的建立与应用

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内蒙古农业大学学报（自然科学版） 2018年第6期39卷 7-12页

作者：朱璐宇彭丽艳周雨霞王喜军步志高内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

信号淋巴细胞活化分子是(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)和麻疹病毒(Measles virus,MV)等麻疹病毒属病毒的主要细胞受体,在病毒入侵细胞的过程中具有重要作用。为了构建稳定表... 详细信息

信号淋巴细胞活化分子是(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)和麻疹病毒(Measles virus,MV)等麻疹病毒属病毒的主要细胞受体,在病毒入侵细胞的过程中具有重要作用。为了构建稳定表达犬SLAM(d SLAM)受体的Vero细胞系,本研究将d SLAM基因克隆至真核表达质粒p CAGG-TK-neo中,在d SLAM基因3’端引入Flag标签序列作为分子标记,并在其下游引入9 nt的Linker序列、猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV) 2A基因以及红色荧光蛋白m Cherry基因,构建了重组质粒p CAGG-dSLAMFlag-mCherry。用该重组质粒转染Vero细胞,经G418压力筛选、红色荧光蛋白表达及表达绿色荧光蛋白的重组CDV(r20/8-EGFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达d SLAM的细胞系。CDV野生型分离株JL17感染试验结果显示,JL17株在第15代次的Vero-dSLAM细胞上可良好生长,而在Vero细胞上不能形成细胞病变。结果表明,Vero-dSLAM细胞可稳定表达d SLAM,为CDV野生型毒株的分离和致病机制研究奠定了基础。

关键词：信号淋巴细胞活化分子 Vero细胞犬瘟热病毒病毒分离

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基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台:发掘病毒复制相关宿主分子的新途径

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微生物学报 2018年第11期58卷 1897-1907页

作者：王文静李素肖书奇仇华吉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 西北农林科技大学动物医学院陕西杨凌712100

病毒作为严格的细胞内寄生生物,需要多种宿主蛋白辅助其完成生命周期。寻找与病毒复制相关的宿主因子并揭示其作用机制,将有助于阐明病毒的感染机制,为疫病的防治提供新靶标。与RNA干扰技术相比,近年来兴起的CRISPR/Cas9技术能更特异、... 详细信息

病毒作为严格的细胞内寄生生物,需要多种宿主蛋白辅助其完成生命周期。寻找与病毒复制相关的宿主因子并揭示其作用机制,将有助于阐明病毒的感染机制,为疫病的防治提供新靶标。与RNA干扰技术相比,近年来兴起的CRISPR/Cas9技术能更特异、高效、准确地实现基因组编辑,因而在功能基因研究中得到更广泛应用。而基于CRISPR/Cas9系统的宿主全基因组sgRNA文库高通量筛选技术平台,可快速发现参与病毒侵入、复制等生物学过程的关键宿主因子,通过明确病毒-宿主分子相互作用进而揭示病毒的生命周期,为分子病毒学和免疫学提供了强大的研究工具。本文主要总结了基于CRISPR/Cas9技术的高通量筛选平台的具体筛选流程,归纳和讨论了该平台在筛选调控病毒复制相关宿主因子中的应用现状和发展前景。

关键词： CRISPR/Cas9 高通量筛选 sgRNA文库病毒-宿主相互作用宿主因子

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马抗中东呼吸综合征冠状病毒特异性F(ab’)_2的制备

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中国生物制品学杂志 2019年第2期32卷 173-180页

作者：邱泊宁胡星星闫飞虎王翀崔健男盖微微曹增国王化磊赵永坤杨松涛夏咸柱吉林大学动物医学学院吉林长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室吉林长春130122 吉林农业大学动物科技学院吉林长春130118 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

目的采用免疫亲和层析技术纯化制备马抗中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)特异性IgG与F(ab’)_2。方法以经MERS-Co V病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)对马匹进行多次免疫所制备的高免血清为原料,原核表达的MERS-CoV刺突蛋白S受体结合域(S-receptor binding domain,S-RBD)为抗原蛋白制备免疫亲和柱,提取制备抗原特异性IgG或F(ab’)_2。间接ELISA法检测各样品的活性,MERS假病毒中和试验检测样品的中和活性,BCA法测定样品的浓度,并计算收率。结果所制备的特异性IgG与特异性F(ab’)2的纯度分别为90. 1%和92. 8%,收率分别为8. 7%和3. 07%;在相同的浓度下,所制备的特异性IgG或F(ab’)_2的活性和中和活性均高于对照组中的血清总Ig G或总F(ab’)_2。结论成功制备了马抗MERS-CoV特异性IgG或F(ab’)_2,为建立更加安全与高效的抗MERS-CoV免疫球蛋白F(ab’)_2制备工艺奠定了基础。

关键词：中东呼吸综合征冠状病毒病毒样颗粒免疫亲和层析免疫球蛋白 F(ab’)2

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慢病毒与microRNA研究进展

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中国预防兽医学报 2018年第9期40卷 862-867页

作者：韩亚儒杜承王晓钧内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

MicroRNA （miRNA）作为一类重要的调控分子广泛存在于动植物体内并且对调控基因表达有着重要的作用。miRNA是一类高度保守且长度为18-25个核苷酸（nt）的小分子,它不编码蛋白质但却可以通过与蛋白编码基因的mRNA互补结合调控基因的表... 详细信息

MicroRNA （miRNA）作为一类重要的调控分子广泛存在于动植物体内并且对调控基因表达有着重要的作用。miRNA是一类高度保守且长度为18-25个核苷酸（nt）的小分子,它不编码蛋白质但却可以通过与蛋白编码基因的mRNA互补结合调控基因的表达。在植物中,通过完全配对结合靶基因而裂解靶mRNA;动物中,通过与靶基因不完全配对结合而抑制蛋白质的翻译。

关键词：基因组宿主细胞 microRNA 病毒编码 HIV 疱疹病毒自身复制编码基因 SIV 研究进展

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不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白的比较分析

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中国家禽 2018年第7期40卷 14-17页

作者：张莹刘琳徐海峰曾显营施建忠王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150069

为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Fla... 详细信息

为明确高致病性和低致病性H7N9亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的血清学特性是否有差异,通过体外表达两种H7N9亚型流感病毒HA蛋白并进行分析。利用RT-PCR方法扩增出高、低致病性H7N9亚型流感病毒HA基因,测序,并克隆于真核表达载体pCAGGS-Flag中,构建两个重组表达质粒,命名为pCAF-H7HPHA和pCAF-H7LPHA,分别转染293T细胞,用间接免疫荧光试验和Western blot试验观察HA蛋白的表达情况。结果显示:与低致病H7N9亚型流感病毒比较,高致病性H7N9亚型流感病毒HA基因裂解位点有连续的碱性氨基酸插入,糖基化位点和受体结合位点没有差异。不同致病性毒株的HA蛋白均能表达良好,表达蛋白分子量约为70 ku;高致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白(或血清)可以与低致病H7N9流感血清(或蛋白)发生反应。结果表明:不同致病性H7N9亚型流感病毒HA蛋白在血清学上没有差异性,为H7N9亚型流感病毒HA蛋白的研究奠定基础。

关键词： H7N9亚型流感 HA蛋白血清学

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高致病性PRRSV感染对仔猪骨髓细胞影响的初步鉴定

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中国预防兽医学报 2018年第4期40卷 321-324页

作者：郑琳琳赵识非刘永刚张冲涂亚斌王刚蔡雪辉东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染对仔猪骨髓细胞的影响,本研究体外培养仔猪骨髓细胞后感染HP-PRRSV,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测骨髓细胞生长情况,并通过流式细胞分析技术检测病毒感染骨髓内细胞的类... 详细信息

为了研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染对仔猪骨髓细胞的影响,本研究体外培养仔猪骨髓细胞后感染HP-PRRSV,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测骨髓细胞生长情况,并通过流式细胞分析技术检测病毒感染骨髓内细胞的类型。实验结果显示:HP-PRRSV HuN4感染骨髓细胞72h后病毒感染率达到峰值,骨髓细胞存活率显著下降;流式细胞分析结果显示,HP-PRRSV感染的骨髓细胞为髓系前体细胞(SWC3~LSWC8^-)与巨噬细胞(SWC3~HSWC8^-)。本实验结果表明:HP-PRRSV在骨髓内除能够感染巨噬细胞外,还能感染髓系前体细胞,引起仔猪骨髓损伤并影响机体的正常免疫反应。本研究为进一步探究HP-PRRSV感染机体免疫抑制机制奠定了前期基础。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒骨髓细胞 SWC3 SWC8

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兼顾H5亚型高致病性禽流感病毒不同分支HA蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2018年第7期40卷 639-642页

作者：徐海峰张莹刘琳曾显营谷琳琳熊晓宇王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立针对我国主要流行的H5亚型Clade7.2、Clade 2.3.2和Clade2.3.4.4分支高致病性禽流感病毒(HPAIV)不同流行株的免疫学快速检测方法,本研究将Clade7.2分支禽流感疫苗株CK/LN/S4092/2011(H5N1)(Re-7)、Clade2.3.4.4分支疫苗株DK/GZ/4/2013(H5N1)(Re-8)和Clade2.3.2.1e分支疫苗株DK/AH/S1246/14(H5N1)(Re-10)混合作为免疫原免疫4周龄BALB/c雌鼠,4次免疫后无菌取其脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)在聚乙二醇促融剂的作用下融合,通过间接ELISA方法及HI试验筛选获得6株能稳定分泌抗血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞,分别命名为1B10、2A10、2C8、3E6、4G9和H2B1。经检测1B10、2A10、2C8和H2B1能够与当前AIV流行的分支反应,具有较好的广谱性。本研究为H5亚型AIV快速诊断技术的研发提供基础材料。

关键词： H5亚型禽流感病毒基因型分支单克隆抗体

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猪脑心肌炎病毒3AB蛋白与宿主蛋白RPL11相互作用的鉴定

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中国预防兽医学报 2018年第5期40卷 375-380页

作者：薛娟张昆丽张元峰黄丽杨玉莹翁长江长江大学动物科学学院湖北荆州434025 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础免疫创新团队/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了研究与猪脑心肌炎病毒(EMCV)3AB相互作用的宿主蛋白,本实验采用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库,获得6个与EMCV 3AB相互作用的宿主蛋白(RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20和LGALS1),经分析显示这些蛋白分别参与DNA... 详细信息

为了研究与猪脑心肌炎病毒(EMCV)3AB相互作用的宿主蛋白,本实验采用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞cDNA酵母表达文库,获得6个与EMCV 3AB相互作用的宿主蛋白(RFC5、LRWD1、PIH1D1、RPL11、RPS20和LGALS1),经分析显示这些蛋白分别参与DNA复制、有丝分裂和细胞凋亡等过程;酵母共转化试验与免疫共沉淀试验证实EMCV 3AB和RPL11两者之间存在特异性结合;激光共聚焦试验显示EMCV 3AB与RPL11共同过度表达时,二者共定位在细胞核中,而在EMCV感染状态下,3AB与RPL11主要共定位在细胞质中。另外,EMCV感染HeLa细胞能降低细胞中p53的蛋白水平,但3AB并不直接促进p53蛋白降解,表明EMCV 3AB对RPL11-MDM2-p53通路无影响。本研究发现并证实了RPL11与EMCV 3AB之间的相互作用,为进一步研究RPL11蛋白在EMCV复制中的作用奠定了基础。

关键词：猪脑心肌炎病毒 3AB蛋白 60S核糖体蛋白L11 病毒-宿主相互作用

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