检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医杂志 2012年第4期48卷 21-23,I0003页

作者：石达吕茂杰陈建飞时红艳张志榜冯力中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)核蛋白N对Vero E6细胞核仁蛋白B23.1的影响,将本实验室构建的DsRed-N1/B23.1重组质粒转染Vero E6细胞,转染6h后接种PEDV,分别在转染后12、18h和24h三个时间点,进行病毒感染细胞的间接免疫试验,同时设未感... 详细信息

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)核蛋白N对Vero E6细胞核仁蛋白B23.1的影响,将本实验室构建的DsRed-N1/B23.1重组质粒转染Vero E6细胞,转染6h后接种PEDV,分别在转染后12、18h和24h三个时间点,进行病毒感染细胞的间接免疫试验,同时设未感染对照组,而后利用激光共聚焦显微镜分析感染和转染细胞中B23.1蛋白的变化。结果表明,PEDV N蛋白与Vero E6核蛋白B23.1有共定位特征,在PEDV感染Vero E6细胞12h后,B23.1蛋白开始发生变化,随着时间的延长逐渐碎裂、分散。这个结果提示,病毒可能通过破坏核仁的结构和核仁蛋白的功能,进而为病毒的复制提供便利。

关键词：猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白 VeroE6细胞核蛋白B23.1

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表达鸡新城疫病毒F蛋白的重组马立克氏病毒的构建及其鉴定

引用

中国预防兽医学报 2012年第6期34卷 423-427页

作者：闫帅崔红玉李巧玲赵妍石星明赵晓岩胡顺磊王玫高明李越王云峰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的重组马立克氏病毒(MDV),本研究采用RT-PCR方法从NDV强毒株F48E9基因组中扩增出病毒的融合蛋白F基因,构建由CMV启动子和BGH polyA组成的2.7 kb F基因表达盒。将其插入带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核... 详细信息

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的重组马立克氏病毒(MDV),本研究采用RT-PCR方法从NDV强毒株F48E9基因组中扩增出病毒的融合蛋白F基因,构建由CMV启动子和BGH polyA组成的2.7 kb F基因表达盒。将其插入带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)和MDV US2同源臂的中间转移载体pUAB-gpt中获得重组MDV转移载体pUAB-gpt-wF。将该转移载体与MDV-814疫苗株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA共转染CEF,经同源重组及gpt选择系统筛选,获得带有F基因表达盒的重组MDV(rMDV814-wF)。其体外增殖与亲本病毒没有差异。经间接免疫荧光试验、PCR、Southern-blot及western blot等试验证明,重组病毒在CEF中传至13代以上仍稳定表达NDV的F蛋白。该重组病毒的构建为MDV活载体疫苗的筛选及应用奠定了基础。

关键词：马立克氏病毒转移载体重组病毒 F基因

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鸭肠炎病毒gL蛋白在鸡胚成纤维细胞中动态表达的检测

引用

中国预防兽医学报 2012年第1期34卷 19-23页

作者：李冰李慧昕王钰韩宗玺邵昱昊刘小丽孔宪刚中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究鸭肠炎病毒(DEV)gL蛋白在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程中的表达情况,本研究以DEVClone-03基因组为模板,应用PCR方法分别扩增得到截短的(gLt,181 bp～711 bp)和全长的gL(1 bp～711 bp)两个基因片段。将gLt基因片段克隆至pET-30a原... 详细信息

为研究鸭肠炎病毒(DEV)gL蛋白在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程中的表达情况,本研究以DEVClone-03基因组为模板,应用PCR方法分别扩增得到截短的(gLt,181 bp～711 bp)和全长的gL(1 bp～711 bp)两个基因片段。将gLt基因片段克隆至pET-30a原核表达载体,转化*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化复性,免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗gL蛋白多克隆抗体。同时将全长gL基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA-gL,转染293T细胞。采用获得的抗gL蛋白抗体检测DEV感染CEF后及真核表达质粒pcDNA-gL转染293T细胞后gL蛋白在不同时间点的表达情况。结果表明,在pcDNA-gL转染293T细胞后12 h应用western blot方法能够检测到gL蛋白的表达,其表达量随着转染时间增加而增加;在病毒感染CEF后24 h应用间接免疫荧光方法能够检测到gL蛋白少量的表达,western blot方法在病毒感染CEF48 h后检测到gL蛋白的表达,其表达量随着病毒感染时间增加而增加。上述结果提示,编码gL蛋白基因可能是病毒复制的晚期表达基因。

关键词：鸭肠炎病毒 gL糖蛋白原核表达真核表达

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新城疫病毒感染鸡肾脏组织蛋白质组学方法条件的优化

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中国预防兽医学报 2012年第5期34卷 360-364页

作者：于德民韩宗玺邵昱浩刘晓丽孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为研究新城疫病毒(NDV)与宿主组织细胞之间的相互作用关系,本研究以NDV疫苗(La Sota)接种的鸡肾脏组织为材料,对其差异蛋白的表达进行分析,通过条件的优化,建立了NDV感染鸡肾脏组织的双向凝胶电泳检测方法。采用ImageMaster2D Platinum ... 详细信息

为研究新城疫病毒(NDV)与宿主组织细胞之间的相互作用关系,本研究以NDV疫苗(La Sota)接种的鸡肾脏组织为材料,对其差异蛋白的表达进行分析,通过条件的优化,建立了NDV感染鸡肾脏组织的双向凝胶电泳检测方法。采用ImageMaster2D Platinum version 6.0软件对电泳图谱分析后显示:24 cm IPG胶条(pH4～pH7)对应的凝胶中可检测到约1 400个蛋白点,蛋白点匹配率达90%,表明NDV感染鸡肾脏组织蛋白质组双向凝胶电泳模型稳定、分辨率高、重复性好,在对4个时间点对照和人工感染凝胶分析过程中发现差异蛋白点主要集中于接种后7 d,该样品的2-DE电泳图谱中共有29个差异表达明显的蛋白点,其中上调表达蛋白点有15个,下调表达蛋白点有14个,利用荧光定量PCR对其中4个差异蛋白在mRNA水平进行检测,结果与双向电泳结果一致,NDV接种鸡肾脏组织蛋白质组学方法的建立为NDV致病机理的研究提供有效的方法。

关键词：新城疫病毒双向凝胶电泳差异蛋白质组学鸡肾脏组织

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禽传染性支气管炎病毒单克隆抗体的制备及其B细胞抗原表位的鉴定

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中国预防兽医学报 2012年第4期34卷 309-312页

作者：王芳刘晓丽赵飞韩宗玺邵昱昊孔宪刚刘胜旺中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为鉴定传染性支气管炎病毒(IBV)的抗原表位,本研究将IBV ck/CH/LDL/091022株免疫6周龄～8周龄BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经过有限稀释法克隆筛选,得到一株针对IBV核衣壳(N)蛋白的单克隆抗体(MAb)2F2,经鉴定其染... 详细信息

为鉴定传染性支气管炎病毒(IBV)的抗原表位,本研究将IBV ck/CH/LDL/091022株免疫6周龄～8周龄BALB/c小鼠,将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,经过有限稀释法克隆筛选,得到一株针对IBV核衣壳(N)蛋白的单克隆抗体(MAb)2F2,经鉴定其染色体数目为101条,MAb亚类鉴定其重链属于IgG1,轻链属于к链。用肽扫描方法将IBV ck/CH/LDL/091022株N基因截短为具有相互部分重叠的23段,表达带GST标签的重组蛋白,与MAb 2F2进行western blot和ELISA反应后,鉴定其表位为397INWGDSAL404。将表位序列进行Blast结果表明,本研究鉴定的表位在大部分IBV株中均为保守抗原表位,为进一步建立IBV的检测方法奠定了基础。

关键词：传染性支气管炎病毒单克隆抗体肽扫描表位

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鸡马立克氏病病毒LMS分离株基因组重复区的测定及分析

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中国预防兽医学报 2012年第6期34卷 492-494页

作者：成云张艳萍李志杰郑永胜谭成章刘长军中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为分析鸡马立克氏病病毒(MDV)LMS分离株的分子遗传特性,本研究对该分离株基因组重复区(包括连接长重复区和短重复区的α样序列)进行了测定。LMS分离株基因组的长重复区为11 746 bp,α样序列为997 bp,短重复区为12 431 bp。在重复区内,... 详细信息

为分析鸡马立克氏病病毒(MDV)LMS分离株的分子遗传特性,本研究对该分离株基因组重复区(包括连接长重复区和短重复区的α样序列)进行了测定。LMS分离株基因组的长重复区为11 746 bp,α样序列为997 bp,短重复区为12 431 bp。在重复区内,预测存在43个ORF,与参考病毒株序列相比存在5个变异较大的ORF。重复区的遗传进化分析表明,LMS分离株与国内814株和欧洲pC12-130株亲缘关系较近。LMS分离株在短重复区潜伏相关转录本(LATs)编码序列的预测转录起始位点位置存在缺失;LMS分离株在α样序列内存在一个新的短重复序列。

关键词：鸡马立克氏病病毒序列测定与分析重复区 α样序列

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禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2012年第9期42卷 916-920页

作者：贠炳岭刘文李德龙秦立廷刘在斯吴关祁小乐王永强高宏雷王笑梅高玉龙中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

为建立一种快速有效的检测禽白血病病毒(ALV)的方法,以原核表达的HB09JY03(ALV-J)p27蛋白制备的单克隆抗体作为包被抗体,p27蛋白制备的多克隆抗体作为检测抗体建立了检测ALV的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法。该方法对p27的最小检出量... 详细信息

为建立一种快速有效的检测禽白血病病毒(ALV)的方法,以原核表达的HB09JY03(ALV-J)p27蛋白制备的单克隆抗体作为包被抗体,p27蛋白制备的多克隆抗体作为检测抗体建立了检测ALV的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法。该方法对p27的最小检出量为1.25ng/mL,且与禽类常见的病毒鸡传染性支气管炎病毒、马立克病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒等无交叉反应。动物感染试验结果表明,用该方法可在感染动物12d后有效检测泄殖腔分泌物中的禽白血病病毒。利用该方法检测了491份蛋清样品和180份肛拭子样品,与PCR方法的符合率分别为96.5%和93.8%。证实,该方法具有方便、快速、敏感等优点,该方法的建立为ALV的早期诊断及种鸡场的净化提供了有效工具。

关键词：禽白血病病毒单克隆抗体多克隆抗体双抗体夹心ELISA

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非洲猪瘟病毒高效纳米PCR检测方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2012年第10期34卷 807-809页

作者：崔尚金胡泉博刘业兵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 中国兽医药品监察所北京100081

为将纳米PCR技术引入非洲猪瘟病毒(ASFV)检测,本研究建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法,该方法采用纳米金颗粒作为热导介子,提高了PCR反应效率,采用该方法同时检测ASFV、大肠杆菌、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、典型猪瘟病毒、猪繁殖与... 详细信息

为将纳米PCR技术引入非洲猪瘟病毒(ASFV)检测,本研究建立了ASFV的高效纳米PCR检测方法,该方法采用纳米金颗粒作为热导介子,提高了PCR反应效率,采用该方法同时检测ASFV、大肠杆菌、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、典型猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪捷申病毒、猪脑心肌炎病毒等,结果只有ASFV能够扩增出552 bp的目的片段。敏感性试验表明纳米PCR检测技术是常规PCR检测技术敏感性的1 000倍以上,最低核酸拷贝数检出量可以达到10个拷贝。采用该方法对黑龙江、吉林和河南3个省份的8个地区临床送检的69份样品进行检测,检测结果显示均为阴性,在以上3个地区均未发现ASFV感染情况。

关键词：纳米PCR 非洲猪瘟病毒 P54基因

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鸽β-防御素5基因克隆及其抗菌活性

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生物工程学报 2012年第11期28卷 1294-1305页

作者：辛胜男张可心张名岳韩宗玺邵昱昊刘晓丽刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001

从鸽的骨髓和肝组织中扩增到2个禽β-防御素(AvBD)基因,在大肠杆菌中高效表达,检测其重组蛋白的抗菌活性。应用RT-PCR方法从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增AvBD5基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-5的氨基酸序列构建系... 详细信息

从鸽的骨髓和肝组织中扩增到2个禽β-防御素(AvBD)基因,在大肠杆菌中高效表达,检测其重组蛋白的抗菌活性。应用RT-PCR方法从鸽的骨髓和肝脏组织中扩增AvBD5基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-5的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。测序得到这2个基因的cDNA大小均为201 bp,编码66个氨基酸残基,内含6个位置保守的半胱氨酸残基。经遗传进化分析发现,该基因推导的两组氨基酸序列与鸭AvBD5的同源性最高,分别为87.9%和78.8%,这两组氨基酸序列的同源性为83.3%。因此,将其分别命名为鸽AvBD5α(骨髓)和鸽AvBD5β(肝脏)。进一步将这两个基因分别亚克隆到大肠杆菌pGEX-6p-1载体中进行原核表达。两个重组融合蛋白经纯化后,通过菌落计数法测定其体外抗菌活性,盐离子浓度对其抗菌活性的影响,及其融合蛋白的溶血活性。结果表明,重组鸽AvBD 5α、AvBD 5β融合蛋白的分子量约为32 kDa。具有明显的抗菌活性,对12种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性显著影响。此外,这两个重组蛋白对红细胞无显著溶血活性。

关键词：鸽β-防御素5 重组蛋白抗菌活性

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鹅β-防御素10基因的分离、鉴定与表达

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中国农业科学 2012年第5期45卷 999-1009页

作者：周财源张名岳韩宗玺邵昱昊刘胜旺马得莹东北农业大学动物营养研究所中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10(avianβ-defensin 10,AvBD10)基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分... 详细信息

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10(avianβ-defensin 10,AvBD10)基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进化分析表明,该基因推导的氨基酸序列与鸭AvBD10的同源性最高,达92.7%。通过对重组蛋白抗菌活性的检测发现,该蛋白对12种致病性细菌均具有较强抑菌作用,但在高盐离子浓度下活性减弱。并且重组蛋白不具有溶血的特性。【结论】成功克隆并表达了鹅AvBD10基因,原核表达产物具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。

关键词：鹅AvBD10 克隆遗传进化分析组织表达抗菌活性

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