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H5N1亚型禽流感病毒A/Guangxi/1/2005株抗药机制的研究

中国预防兽医学报 2012年第9期34卷 682-685页

作者：王飞吴珊珊慈彦鹏刘丽玲田国彬曾显营管雪婷李雁冰陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室/国家禽流感参考实验室黑龙江哈尔滨150001

为研究H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的抗药机制,本研究选取Clade2.3.4亚群中一株对金刚烷胺敏感的人源AIV A/Guangxi/1/2005(H5N1)(S-GX05),用抗流感病毒药物金刚烷胺对其进行定向诱导,筛选出一株抗药性病毒株,命名为R-A/Guangxi/1/2005(R-G... 详细信息

为研究H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的抗药机制,本研究选取Clade2.3.4亚群中一株对金刚烷胺敏感的人源AIV A/Guangxi/1/2005(H5N1)(S-GX05),用抗流感病毒药物金刚烷胺对其进行定向诱导,筛选出一株抗药性病毒株,命名为R-A/Guangxi/1/2005(R-GX05)。通过全基因测序并与S-GX05全基因序列进行对比,结果显示S-GX05只在其M2蛋白中有一个氨基酸位点发生突变,即A30P;抗药性鉴定这两株病毒的半数药物抑制浓度(IC50)分别为0.9μM和48.9μM,表明R-GX05对金刚烷胺表现出一定程度的抗性。动物实验证实,这两株病毒对BALB/c小鼠的致病性基本一致,均表现出高致病性,其MLD50分别为4.7 log10 EID50和5.0 log10 EID50,两株病毒在小鼠体内各组织脏器中的分布及增殖能力也基本相同。这些结果表明,S-GX05在药物压力下产生抗药性后,并未引起其它生物学特性的改变。A30P的发现为进一步从分子水平上研究H5N1亚型AIV的抗药机制及新型抗流感新药的研发奠定了基础。

关键词： H5N1禽流感病毒抗药性金刚烷胺

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抗原表位鉴定方法的研究进展

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中国畜牧兽医 2012年第7期39卷 66-70页

作者：文雪霞陈化兰熊永忠王秀荣中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001

抗原表位是抗原分子中能与相应淋巴细胞表面的受体结合的特殊化学基团,一般由几个氨基酸残基序列或其空间结构组成。它是引起免疫应答的物质基础,其性质决定了抗原的特异性。抗原表位的鉴定方法主要有肽扫描技术、氨基酸定点突变技术、X... 详细信息

抗原表位是抗原分子中能与相应淋巴细胞表面的受体结合的特殊化学基团,一般由几个氨基酸残基序列或其空间结构组成。它是引起免疫应答的物质基础,其性质决定了抗原的特异性。抗原表位的鉴定方法主要有肽扫描技术、氨基酸定点突变技术、X-ray衍射或核磁共振技术、质谱技术、噬菌体展示肽技术及生物信息技术预测等,文章将从这几方面入手对近几年来鉴定抗原表位的方法作一综述。

关键词：抗原表位鉴定方法研究进展

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表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

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中国预防兽医学报 2012年第5期34卷 341-344页

作者：焦同路王靖飞赵双成王世达常晓飞田石柳金雄李雁冰姜永萍陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、疫病诊断与技术服务中心黑龙江哈尔滨150001

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚... 详细信息

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。

关键词： H5亚型禽流感病毒重组禽痘病毒 HA基因

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H9N2亚型禽流感病毒细胞高产株的拯救

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中国预防兽医学报 2012年第12期34卷 937-941页

作者：刘彦云刘春国石薇琳王伟吕让刘明中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030

为构建能够在MDCK细胞中高水平复制的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗株,本研究在对病毒生长特性及HA基因遗传进化分析的基础上,筛选出一株细胞高度适应的国内流行株A/chicken/Shanghai/11/2011(H9N2)(SH11),并通过反向遗传操作技术拯救出... 详细信息

为构建能够在MDCK细胞中高水平复制的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)疫苗株,本研究在对病毒生长特性及HA基因遗传进化分析的基础上,筛选出一株细胞高度适应的国内流行株A/chicken/Shanghai/11/2011(H9N2)(SH11),并通过反向遗传操作技术拯救出全部基因均来自亲本株的AIV rSH11株。生物学试验结果表明rSH11在鸡胚半数感染量(EID50)、组织培养半数感染量(TCID50)、遗传稳定性等方面均与亲本株保持一致,rSH11经MDCK细胞连续传5代后血凝价稳定在1∶1 024,表明该病毒株具有细胞高度增殖的特性。采用rSH11株制备油乳剂灭活苗免疫4周龄SPF鸡,免疫一周即可以检测出HI抗体,免疫3周后HI抗体平均效价高于1∶700,表明其具有良好的免疫原性。rSH11疫苗对不同的H9N2病毒株能够产生良好的免疫保护作用,显著抑制免疫鸡排毒。H9N2亚型AIV细胞高产株的拯救为该亚型AIV细胞苗的研制奠定了基础。

关键词：禽流感 H9N2亚型反向遗传细胞苗

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表达H5亚型禽流感同义(Consensus)HA蛋白的重组质粒构建及体外表达

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中国预防兽医学报 2012年第7期34卷 510-513页

作者：常晓飞赵双成田石柳金雄王靖飞曾显营胡永浩姜永萍陈化兰甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730007 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点开放实验室黑龙江哈尔滨150001 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与技术服务中心黑龙江哈尔滨150001

为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜... 详细信息

为研究禽流感病毒(AIV)H5亚型同义Consensus HA(Cons-HA5)基因的重组表达质粒在体外的表达情况,本研究通过对从NCBI流感数据库中获得的5000条H5亚型AIV的HA蛋白的序列比对、分析获得一条同义HA蛋白,将其相对应的核苷酸序列进行鸡体偏嗜性密码子优化,人工合成Cons-HA5基因并克隆于真核表达载体pCAGGS中构建重组表达质粒pCACons-HA5。将重组质粒转染293-T细胞,在激光共聚焦显微镜下观察转染后不同时间HA蛋白的表达情况,同时在转染后24 h、48 h后分别进行表达蛋白的western blot检测。结果表明,pCACons-HA5转染293-T细胞后,其表达的HA蛋白先分布于细胞质中,而后转移至细胞膜表面;westernblot鉴定结果表明,Cons-HA5重组蛋白可以与AIV多克隆血清反应分子量约为70 ku。该重组质粒的构建将为进一步Cons-HA5核酸免疫对H5亚型不同抗原群AIV的交叉保护免疫效力研究奠定基础。

关键词： H5亚型禽流感病毒同义HA基因表达

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2009年～2011年中国南方H4亚型禽流感病毒生物学特性研究

2009年～2011年中国南方H4亚型禽流感病毒生物学特性研究

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中国畜牧兽医学会禽病学分会第十六次学术研讨会

作者：张文亮张曦朱占松谭丹崔鹏飞施建忠邓国华陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室

我国南方地区一直以来是禽流感的易发地,目前该区域已分离到的禽流感病毒除高致病性禽流感(HPAIV)外,也存在多种低致病性禽流感(IPAIV)并存现象,尤其是近年来H6和H9等LPAIV呈现广泛流行态势。2009年以来,在中国南方地区的正常禽流感疫... 详细信息

我国南方地区一直以来是禽流感的易发地,目前该区域已分离到的禽流感病毒除高致病性禽流感(HPAIV)外,也存在多种低致病性禽流感(IPAIV)并存现象,尤其是近年来H6和H9等LPAIV呈现广泛流行态势。2009年以来,在中国南方地区的正常禽流感疫情监测过程中分离到多株H4亚型禽流感病毒(AIV),发现H4亚型禽流感病毒的分离率逐渐提高。本研究对2009年至2011年间分离的55株病毒进行RNA提取、基因组扩增、序列分析、相关抗原性分析以及对小鼠的感染能力评估,以了解我国当前南方地区H4亚型AIV的遗传进化关系,抗原

关键词：禽流感病毒生物学特性研究中国南方

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禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

禽流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：包红梅王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室／农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨 150001

根据GenBank中登录的A型禽流感病毒(AIr)的M基因序列，设计了一套特异识别M基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物，并以此套引物建立了一种基于RT-LAMP(逆转录环介导等温核酸扩增)技术的A型禽流感病毒诊断方法。结果表明... 详细信息

根据GenBank中登录的A型禽流感病毒(AIr)的M基因序列，设计了一套特异识别M基因序列中6个不同区段的环介导恒等温扩增(LAMP)引物，并以此套引物建立了一种基于RT-LAMP(逆转录环介导等温核酸扩增)技术的A型禽流感病毒诊断方法。结果表明，该方法对M-AIV RNA的最小检测限为10．6，灵敏度高于普通一步法RT-PCR 10倍；全部反应可在1．5h内完成；在反应体系中添加Fluorescent Detection Reagent染料后，可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。灵敏性及特异性试验证明，该方法灵敏度高、特异性好，能够作为A型禽流感病毒的快速诊断方法。

关键词：禽流感病毒逆转录环介导恒等温扩增病毒检测性能评价

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H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA诊断方法的建立

H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA诊断方法的建立

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中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第九次学术研讨会

作者：陈艳孔维乔传玲杨焕良辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室，黑龙江哈尔滨 150001

为了检测H3N2亚型猪流感病毒，将一株H3亚型猪流感病毒特异性单克隆抗体(4E8)进行纯化，建立了以多抗作为包被抗体，单抗作为检测抗体的H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA方法。通过对反应条件的优化。确定多抗1：800倍稀释，单抗0．51μg... 详细信息

为了检测H3N2亚型猪流感病毒，将一株H3亚型猪流感病毒特异性单克隆抗体(4E8)进行纯化，建立了以多抗作为包被抗体，单抗作为检测抗体的H3亚型猪流感病毒抗原捕捉ELISA方法。通过对反应条件的优化。确定多抗1：800倍稀释，单抗0．51μg／孔，酶标抗体1：5000稀释;单抗37 4℃作用***，酶标抗体37℃作用1.0h。并对此方法的特异性和敏感性进行了分析。同时，应用建立的抗原捕捉ELISA方法对84份H3亚型SIV实验室感染猪的拭子和肺脏样品进行检测。结果显示该方法具有良好的特异性和敏感性，可用于H3亚型SIV的临床检测。

关键词：猪流感病毒单克隆抗体病毒检测性能评价

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H5N1亚型禽流感灭活疫苗种毒Re-6株的生物学特性及免疫原性研究

H5N1亚型禽流感灭活疫苗种毒Re-6株的生物学特性及免疫原性研究

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第三届(2012)中国黄羽肉鸡行业发展大会

作者：曾显营 ZENG Xianying TIAN Guobin 田国彬 FENG Huapeng 冯华朋 DENG Guohua 邓国华 SHI Jianzhong 施建忠 ZHANG Pantao 张盼涛 SU Wen 苏文 YANG Jing 杨婧 LIU Jingli 刘景利徐佳 XU Jia CHEN Hualan 陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室国家禽流感参考实验室哈尔滨 150001 State Key Lab of Veterinary Biotechnology/Animal Influenza Laboratory of the Ministry of Agriculture Harbin Weike Biotechnologv Development Company Harbin 150001 哈尔滨维科生物技术开发公司哈尔滨 150001

本研究对经反向遗传方法构建的重组禽流感H5N1亚型变灭活疫苗种毒Re—6株的生物学特性及免疫效力进行研究.将Re—6株接种SPF鸡胚后37℃培养72h,鸡胚存活,且无病变,HA滴度达210;以0.1ml(106.0EID50/0.1ml)的剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡10天... 详细信息

本研究对经反向遗传方法构建的重组禽流感H5N1亚型变灭活疫苗种毒Re—6株的生物学特性及免疫效力进行研究.将Re—6株接种SPF鸡胚后37℃培养72h,鸡胚存活,且无病变,HA滴度达210;以0.1ml(106.0EID50/0.1ml)的剂量鼻腔感染4周龄SPF鸡10天后血清HI抗体转阳,无任何症状,也不排毒;SPF鸡静脉致病指数(IVPI)为0;以Re—6重组株为种毒制备灭活疫苗,免疫SPF鸡和SPF鸭后,3周时平均HI抗体效价达8.310g2和8.4 log2;免疫鸡和免疫鸭对亲本强毒株GD1322攻击提供完全保护.以上结果表明禽流感灭活疫苗种毒Re—6株对SPF鸡胚和SPF鸡无致病性、适合鸡胚增殖、抗原针对性强,且该毒株制备的灭活疫苗具有良好的免疫效力,是理想的疫苗种毒株.

关键词：家禽亚型禽流感灭活疫苗生物学特性免疫原性

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抗猪甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

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畜牧兽医学报 2011年第5期42卷 711-716页

作者：张健陈艳乔传玲杨焕良唐续辛晓光陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室哈尔滨150001

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体。采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293... 详细信息

本研究旨在制备猪甲型H1N1流感病毒血凝素(HA)蛋白的特异性单克隆抗体。采用RT-PCR方法扩增猪甲型H1N1流感病毒的HA基因,将其克隆至真核表达载体pCAGGS上,获得重组质粒pCAGGS-HA,转染293T细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测表明HA蛋白在293T细胞中得到表达。将pCAGGS-HA以100μg.只-1剂量免疫5周龄BALB/c小鼠,获得4株稳定分泌抗HA蛋白单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为11G7、3C10、3G3和2B11。其中11G7诱导小鼠产生的腹水HI效价为14log2,中和效价为1∶8 192,HI试验结果进一步表明11G7只与甲型H1N1流感病毒发生反应,而不与其他H1N1、H1N2、H3N2、H5N1及H9N2亚型流感病毒反应。该MAb的制备将为建立猪甲型H1N1流感病毒与传统亚型SIV的鉴别诊断方法奠定基础。

关键词：甲型H1N1猪流感病毒 HA MAb

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