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生物技术通讯 2018年第6期29卷 748-751页

作者：张晶晶肖红剑龙琼浦滔李智华寸韡中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的:制备抗树鼩IgE高亲和力受体α亚基(FcεRIα)的单克隆抗体,并对其免疫学特性进行检测。方法:采用大肠杆菌原核表达树鼩IgE FcεRIα蛋白,经过纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合;通过ELISA法和有限稀释法筛选杂... 详细信息

目的:制备抗树鼩IgE高亲和力受体α亚基(FcεRIα)的单克隆抗体,并对其免疫学特性进行检测。方法:采用大肠杆菌原核表达树鼩IgE FcεRIα蛋白,经过纯化后免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合;通过ELISA法和有限稀释法筛选杂交瘤细胞;利用Protein A纯化单克隆抗体,Western印迹检测其特异性,间接免疫荧光及免疫组化对单克隆抗体进行分析。结果:用纯化的树鼩IgE FCεRIα蛋白免疫小鼠,选取效价高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经过3轮亚克隆筛选,筛选出5株抗树鼩IgE FCεRIα单克隆抗体,分别命名为HC020、HC021、HC022、HC023和HC024,细胞间接免疫荧光表明5株单克隆抗体均能检测到293T细胞中表达的IgE FCεRIα,其中HC020、HC022、HC024能够通过免疫组化检测组织切片中的IgE FCεRIα。结论:制备了5株IgE FCεRIα单克隆抗体,为今后研究树鼩IgE FCεRIα奠定了基础。

关键词：树鼩 IgE高亲和力受体α亚基单克隆抗体

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狂犬病病毒糖蛋白表达及纯化及其记忆性B细胞结合能力的分析

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生物工程学报 2017年第11期33卷 1840-1849页

作者：严丽蔚巩蔚朱文兵张雪梅徐婧雯吴忠香卢孔杰孙明董少忠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

表达纯化不同标签、不同大小3个狂犬病病毒糖蛋白,分析其结合功能后,得到具备高亲和力的、可特异性结合记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。本实验通过基因工程的方法,采用不同的原核表达系统分别表达带有不同标签的、全长和膜外区的RVG,... 详细信息

表达纯化不同标签、不同大小3个狂犬病病毒糖蛋白,分析其结合功能后,得到具备高亲和力的、可特异性结合记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。本实验通过基因工程的方法,采用不同的原核表达系统分别表达带有不同标签的、全长和膜外区的RVG,纯化蛋白并分析比较其结合功能,荧光标记候选蛋白,结合CD19及CD27的抗体,流式细胞术检测狂犬疫苗免疫后PBMCs中抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞的情况,确认候选蛋白与抗狂犬病毒特异性记忆性B细胞的结合功能。本实验成功构建了3个表达载体pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G,优化表达纯化条件成功获得了糖蛋白GST-RVG、His-RVG和His-G。纯化后的GST-RVG、His-RVG和His-G经Western blotting和ELISA鉴定均有抗原特异性;由竞争ELISA法测得3个纯化后糖蛋白与抗狂犬病病毒抗体的亲和力。通过流式细胞术可以检测到狂犬疫苗免疫后阳性志愿者PBMCs中的抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞,从而获得了高亲和力、可用于分选抗原特异性的记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白抗原特异性记忆性B细胞流式细胞术

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树鼩粪便中病毒三种浓缩方法的效果比较

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实验动物科学 2018年第2期35卷 38-41,46页

作者：陈玲霞尹博文苗雨润宋庆凯李晓飞代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室树鼩种质资源中心昆明650118

目的比较树鼩粪便中病毒的三种浓缩方法,评价各方法的浓缩效果,为病毒浓缩方法的最佳选择提供依据。方法将指示病毒(树鼩呼肠孤病毒,tree shrew’s reovirus,TRV)加入经离心过滤处理后的野生树鼩粪便上清中,采用PEG(聚乙二醇,polyehhyle... 详细信息

目的比较树鼩粪便中病毒的三种浓缩方法,评价各方法的浓缩效果,为病毒浓缩方法的最佳选择提供依据。方法将指示病毒(树鼩呼肠孤病毒,tree shrew’s reovirus,TRV)加入经离心过滤处理后的野生树鼩粪便上清中,采用PEG(聚乙二醇,polyehhylene glycol)沉淀结合超声分离法、铁离子絮凝的化学方法和GBviroFast病毒浓缩试剂盒对树鼩粪便上清分别进行浓缩,经实时荧光定量PCR技术对指示病毒进行绝对定量,比较各方法的浓缩效果。结果 TRV病毒悬液的载量为1.34E+05;铁离子絮凝的化学方法浓缩的TRV载量为1.86E+04,浓缩效率为49.57%;GBviroFast病毒浓缩试剂盒浓缩的TRV载量为0.98E+04,浓缩效率为26.12%;PEG沉淀结合超声分离法浓缩的TRV载量为2.30E+03,浓缩效率为6.13%。结论三种方法均能浓缩粪便上清中低浓度的肠道病毒,铁离子絮凝方法最佳,GBviroFast病毒浓缩试剂盒其次,PEG结合超声分离效果最差。

关键词：实时荧光定量PCR 病毒浓缩粪便树鼩

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CV-A16和EV-A71感染对肠道上皮细胞间连接分子排布和表达的影响

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病毒学报 2017年第6期33卷 861-867页

作者：宋杰胡雅洁黄星刘龙丁中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

柯萨奇病毒A组16型(Coxsakievirus A 16,CV-A16)与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)是引发手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的两种主要病原体,然而两者的致病机理仍未完全被阐明。病毒感染对肠道上皮细胞间连接分子排布... 详细信息

柯萨奇病毒A组16型(Coxsakievirus A 16,CV-A16)与肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV-A71)是引发手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)的两种主要病原体,然而两者的致病机理仍未完全被阐明。病毒感染对肠道上皮细胞间连接分子排布和表达直接与病毒感染造成的后果相关。本研究通过右旋糖苷穿透实验、免疫荧光以及蛋白免疫印迹等技术检测了CV-A16和EV-A71感染对肠道上皮细胞系(Intestinal epithelial cell)FHC后细胞通透性的变化以及细胞间连接分子排布和表达情况。研究结果表明,CV-A16和EV-A71感染FHC可导致其通透性显著增强、连接分子Nectin1、Claudin4、Claudin5、ZO-1以及E-Cadherin的排布被破坏,且表达量显著性降低。这一结果提示了CV-A16和EV-A71感染肠道FHC细胞并在细胞中复制引起肠道上皮细胞损伤,导致肠道上皮细胞间连接分子排布的改变和表达量的减少。

关键词：柯萨奇病毒A组16型(CV-A16) 肠道病毒71型(EV-A71) 手足口病(HFMD) 肠道上皮通透性细胞间连接分子

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树突状细胞、CD8^+ T细胞与单纯疱疹病毒1型的潜伏感染

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中国科学：生命科学 2017年第6期47卷 606-615页

作者：张小龙李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)属于疱疹病毒α亚科,是一种在人群中广泛传播的病原体.HSV-1病毒感染机体后可在宿主神经系统中建立起长期的潜伏感染,并不时地从潜伏状态"重激活"导致临床症状及体液排毒.病毒抗原特异性CD8+T细胞具有... 详细信息

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)属于疱疹病毒α亚科,是一种在人群中广泛传播的病原体.HSV-1病毒感染机体后可在宿主神经系统中建立起长期的潜伏感染,并不时地从潜伏状态"重激活"导致临床症状及体液排毒.病毒抗原特异性CD8+T细胞具有抑制神经细胞中HSV-1"重激活",维持病毒潜伏感染状态的能力.本文从树突状细胞对病毒抗原的递呈,病毒抗原特异性CD8+T细胞的来源、种类、抗原特异性及功能等方面对近年来的研究进展做一综述.

关键词：单纯疱疹病毒1型树突状细胞 CD8+T细胞,潜伏感染

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人诺如病毒最新研究进展

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病毒学报 2017年第5期33卷 785-790页

作者：宋杰董少忠中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

人诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是杯状病毒科(Caliciviridae)的一种单股正链RNA病毒,它是导致全球急性非细菌性肠胃炎暴发的主要病原体之一。自1972年美国学者Kapikian利用透射电镜首次观察到首株诺瓦克病毒(Norwalk virus,NV)以... 详细信息

人诺如病毒(Human noroviruses,HuNoVs)是杯状病毒科(Caliciviridae)的一种单股正链RNA病毒,它是导致全球急性非细菌性肠胃炎暴发的主要病原体之一。自1972年美国学者Kapikian利用透射电镜首次观察到首株诺瓦克病毒(Norwalk virus,NV)以来,该病毒在全球范围内多次广泛流行。据报道,全球每年有超过1亿人因感染HuNoVs而发病,其临床症状主要为恶心、呕吐、腹痛和腹泻,多数患者表现为自限性,但也会导致少数婴幼儿、老人和免疫缺陷患者发展成重症,甚至死亡。HuNoVs引起的疫情暴发给全球的公共卫生安全带来了较大的威胁。本文将对HuNoVs的病原学及流行病学、体外培养体系、动物模型、免疫反应和疫苗研发的最新研究进展进行概述。

关键词：诺如病毒(NoVs) 体外培养系统动物模型免疫反应疫苗研发

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柯萨奇病毒A16型抗原与呼吸道黏膜上皮组织内先天淋巴细胞的相互关系及其疫苗应用价值

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微生物与感染 2018年第6期13卷 350-361页

作者：王永蓉廉亚茹蒋国润范胜涛冯敏杨二霞姜莉董承红赵志梅王丽春廖芸张莹李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 艾美康淮生物制药(江苏)有限公司泰州225300

柯萨奇病毒A16型(coxsakievirus A16,CA16)是引起手足口病的主要病原,但其发病及相关免疫机制尚不清楚,导致其疫苗研发面临诸多困难。众多研究表明,呼吸道黏膜上皮细胞及其相关免疫细胞尤其是天然淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC),... 详细信息

柯萨奇病毒A16型(coxsakievirus A16,CA16)是引起手足口病的主要病原,但其发病及相关免疫机制尚不清楚,导致其疫苗研发面临诸多困难。众多研究表明,呼吸道黏膜上皮细胞及其相关免疫细胞尤其是天然淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC),在很大程度上促进病毒感染中天然免疫和适应性免疫反应的激活。然而,ILC在CA16感染诱导的免疫反应中如何发挥作用仍未知晓。为揭示CA16感染过程中ILC与病原的相互关系及发挥的作用,首先利用定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测CA16感染的人支气管上皮细胞16HBE和以特别配制的佐剂导入CA16灭活抗原的小鼠支气管上皮细胞CP-M175中对ILC具有激活效应的重要基因表达情况。然后,将特别配制的CA16灭活疫苗通过鼻腔免疫BALB/c小鼠,分析呼吸道黏膜组织中ILC与病毒抗原之间的相互关系。体内外实验结果均显示,CA16活病毒和灭活的病毒抗原能诱导ILC活化所需信号通路分子的表达增加,且ILC分泌的细胞因子表达增加。免疫荧光和共聚焦显微镜观察结果亦证实,病毒抗原与ILC1/ILC3分别存在共定位现象。比较4种途径/程序免疫的小鼠体内抗CA16中和抗体和特异性细胞免疫应答情况,发现采用特别配制的CA16灭活疫苗免疫小鼠能诱导产生较好的抗病毒免疫应答。结果提示,CA16抗原能通过激活ILC及其相关信号通路诱导产生有效的免疫反应。

关键词：柯萨奇病毒A16型天然淋巴细胞树突细胞呼吸道黏膜

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云南汉族人群NKG2D基因多态性与宫颈癌发生发展的相关性

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贵州医科大学学报 2018年第3期43卷 259-263,304页

作者：杨晓蕾戴书颖王小娜张新文刘舒媛付杰牛步青杨欢唐军王培智李传印中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明医科大学基础医学院云南昆明650500

目的:探讨云南汉族人群NKG2D(member D)基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点rs2255336(T>C)及rs2617160(A>T)的多态性与宫颈癌的相关性。方法:选取云南地区汉族宫颈上皮内瘤变(CIN)患者136例作为CIN组、227例宫颈癌患者作为癌症组及... 详细信息

目的:探讨云南汉族人群NKG2D(member D)基因中的单核苷酸多态性(SNP)位点rs2255336(T>C)及rs2617160(A>T)的多态性与宫颈癌的相关性。方法:选取云南地区汉族宫颈上皮内瘤变(CIN)患者136例作为CIN组、227例宫颈癌患者作为癌症组及483例健康体检人群作为对照组,采用Taqman基因分型法对3组受检者NKG2D基因中2个SNP位点rs2255336(T>C)、rs2617160(A>T)进行基因分型,研究rs2255336(T>C)、rs2617160(A>T)位点的等位基因、基因型及所构建的单倍型在各组中分布频率,用遗传模式分析软件SNPStats分析2个SNP位点的基因型与宫颈癌的相关性。结果:对照组与CIN组NKG2D基因中rs2617160(A>T)等位基因C和T分布频率比较,差异有统计学意义(P=0.049),该位点等位基因A可能是云南汉族人群CIN发生的风险因素(OR=1.31,95%CI为1.00~1.72),而该位点在对照组与癌症组、CIN组与癌症组中的分布频率比较差异无统计学意义(P>0.05);recessive模式为CIN组与对照组分析的最优遗传模式,该模式下TT-AT基因型相对于AA基因型是CIN发生的保护性因素(OR=0.58,95%CI为0.37~0.92);rs2255336(T>C)位点等位基因和基因型在对照组、CIN组、癌症组间的分布频率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:NKG2D基因中多态性位点rs2617160(A>T)的等位基因A可能是云南汉族人群宫颈癌发生的风险因素。

关键词：多态性,单核苷酸 NKG2D 宫颈肿瘤宫颈上皮内瘤变基因型云南汉族相关性

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Benzonase酶去除流感疫苗中Vero细胞DNA条件的优化

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中国生物制品学杂志 2017年第5期30卷 540-545页

作者：徐国峰耿兴良宋绍辉马磊廖国阳李卫东中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的优化非限制性内切酶Benzonase去除Vero细胞制备的H5N1流感疫苗中残余细胞DNA的条件,并结合两步柱层析法使疫苗中DNA残余达到质量要求。方法向H5N1流感病毒浓缩液中添加不同终浓度的Benzonase酶(10、20、30、40、50、60 U/ml),置于3... 详细信息

目的优化非限制性内切酶Benzonase去除Vero细胞制备的H5N1流感疫苗中残余细胞DNA的条件,并结合两步柱层析法使疫苗中DNA残余达到质量要求。方法向H5N1流感病毒浓缩液中添加不同终浓度的Benzonase酶(10、20、30、40、50、60 U/ml),置于37℃酶解不同时间(0.5、1、1.5、2、2.5、3 h),经100 k D超滤离心管,用不同p H(7.10、7.30、7.50、7.70、7.90)的PBS进行洗滤浓缩。将Benzonase酶处理的病毒液经蔗糖密度梯度离心纯化,去除部分杂蛋白,电镜下观察病毒的形态。结合两步柱层析法进一步去除Vero细胞DNA。结果 H5N1流感病毒液经终浓度为10 U/ml的Benzonase酶,37℃处理2.5 h后,用p H为7.50的PBS溶液进行洗滤,其DNA去除率可达99%以上。Benzonase酶处理前后病毒形态一致,结构完整,轮廓清晰。在用酶处理去除原液中大部分Vero细胞残余DNA的基础上,结合两步柱层析法基本可使疫苗残余外源DNA达到100 pg/剂的限定标准。结论非限制性核酸内切酶Benzonase可高效降解H5N1流感病毒液中的DNA,此方法降低流感疫苗中Vero细胞DNA简单可行,大大降低了后续工艺去除DNA的压力,同时结合两步柱层析法可使疫苗中DNA残余达到限定标准,为以Vero细胞为基质大流行流感疫苗的研发奠定了基础。

关键词： Benzonase酶 H5N1流感病毒 Vero细胞 DNA 超滤柱层析

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两种凝胶过滤介质纯化Sabin株脊髓灰质炎病毒效果的比较

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中国生物制品学杂志 2017年第10期30卷 1086-1091,1095页

作者：王虓宇朱云沈武玲平玲蔡玮孙明波中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的比较两种不同的凝胶过滤介质对Sabin株脊髓灰质炎病毒的分离纯化效果。方法将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒收获液各3批经超滤浓缩后,分别采用Sepharose CL-6B和Sepharose 6FF填料进行凝胶过滤纯化,分段收集各纯化峰,检测D抗... 详细信息

目的比较两种不同的凝胶过滤介质对Sabin株脊髓灰质炎病毒的分离纯化效果。方法将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒收获液各3批经超滤浓缩后,分别采用Sepharose CL-6B和Sepharose 6FF填料进行凝胶过滤纯化,分段收集各纯化峰,检测D抗原及蛋白含量,计算比活性、蛋白去除率及抗原回收率,确定病毒峰收集范围。取抗原含量最高的病毒收获液,利用DEAE Sepharose FF离子交换填料进行纯化后,检测Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量。结果 Sepharose 6FF填料按6%柱体积上样进行凝胶纯化,纯化的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒收获液抗原回收率均值分别为78.69%、78.03%和78.37%,与Sepharose CL-6B填料按3%柱体积上样(77.29%、78.60%和77.36%)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。两种填料纯化的各型收获液再经离子交换纯化后,蛋白去除率、比活性、Vero细胞DNA残留量、Vero细胞蛋白残留量、牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量检测结果均符合《中国药典》三部(2015版)相关要求,两种填料纯化的各型收获液比活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论使用Sepharose 6FF纯化的各型病毒纯化液抗原回收率和比活性与Sepharose CL-6B无明显差异,但可以减少纯化的上样次数,大幅提高纯化效率,可用Sepharose 6FF替换Sepharose CL-6B。

关键词：脊髓灰质炎病毒层析纯化凝胶过滤离子交换

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