检索结果-内蒙古大学图书馆

2018年湖南省登革病毒2型分离株非结构蛋白1基因的鉴定及分析

中国生物制品学杂志 2020年第12期33卷 1357-1362页

作者：冯石军刘雨陈珺段素琴饶清陈俊英管娇琼长沙医学院附属祁阳县人民医院湖南永州426100 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650031

目的鉴定并分析2018年湖南省登革病毒2型(dengue virus 2,DENV-2)分离株的非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1)基因。方法利用试剂盒提取登革热患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型及扩增11株分离株NS1基因,并进行基因测序。应用ME... 详细信息

目的鉴定并分析2018年湖南省登革病毒2型(dengue virus 2,DENV-2)分离株的非结构蛋白1(non-structural protein 1,NS1)基因。方法利用试剂盒提取登革热患者血清RNA,RT-PCR法鉴定病毒类型及扩增11株分离株NS1基因,并进行基因测序。应用MEGA 7.0软件分析分离株与DENV-2标准株(KM204118)的NS1基因核苷酸及氨基酸序列,利用最大似然法(1000 Boot strap replicate)构建NS1基因的系统进化树。结果共获得11株分离株的NS1基因,经比对发现,除分离株HNNS201804和HNNS201810外,其余分离株在NS1基因第585位碱基由T变为C(无义突变);HNNS201806的NS1基因第936位碱基由C变为T(无义突变)。11株分离株NS1基因其他突变位点均相同,共68处发生碱基突变,其中9个为有义突变。11株分离株与China-ZJ(2017-MH110594)、China-GZ(2018-MK564485、2015-KX621245、2017-MK564483)、Thailand(2017-LC410191)、Singapore(2016-MF314189)、Philippines(2015-KU517847)有较近的亲缘关系。结论2018年湖南省11株分离株均为DENV-2,可能是浙江或广州输入株,也可能是泰国、新加坡和菲律宾等东南亚国家的输入株。

关键词：登革病毒2型 NS1基因基因突变系统进化树

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候选无细胞百白破-Sabin株灭活脊髓灰质炎联合疫苗在大鼠上的免疫保护效果研究

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中国医药生物技术 2020年第1期15卷 18-24页

作者：姬秋彦江文文梁疆莉顾琴高娜马艳牟大超史荔孙明波中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室

目的观察候选无细胞百白破-Sabin株灭活脊髓灰质炎联合疫苗(DTaP-sIPV)在大鼠中的免疫保护效果,为疫苗临床前研究提供依据。方法将候选疫苗DTaP-sIPV、无细胞百白破-灭活脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTaP-IPV/Hib)、吸附无细胞... 详细信息

目的观察候选无细胞百白破-Sabin株灭活脊髓灰质炎联合疫苗(DTaP-sIPV)在大鼠中的免疫保护效果,为疫苗临床前研究提供依据。方法将候选疫苗DTaP-sIPV、无细胞百白破-灭活脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTaP-IPV/Hib)、吸附无细胞百白破-b型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTaP/Hib)、百日咳疫苗效力参考品(全细胞疫苗,wP)按0、30、60 d 3剂免疫程序免疫Wistar大鼠,检测各组大鼠每剂免疫后的血清中各组分抗体水平。在免疫完成后3周,用百日咳18323株通过气雾攻击的方式感染大鼠。在感染后的第3、7、14、21和28天检测各组白细胞数、肺部菌落克隆形成数以及百日咳疫苗组分抗体变化水平。结果候选疫苗组3剂次免疫完成后PT抗体几何平均滴度(GMT,log2)为16.74,FHA抗体GMT为18.44,PRN抗体GMT为10.75,DT抗体GMT为17.34,TT抗体GMT为17.84,针对3种Sabin脊髓灰质炎病毒株(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)的抗体的GMT分别为7.57、8.41和9.70,均达到100%阳转。候选疫苗抗原组分抗体除了PRN和I型IPV外,其他组分抗体水平均与疫苗对照组相比无显著性差异。在基础免疫完成后3周对大鼠进行百日咳杆菌气雾攻击,各疫苗组均表现较好的保护效果,白细胞水平都呈现平稳状态,虽然在肺部也检测到少量细菌定植,但各疫苗组间差异不明显,且在感染后第28天都清除至检测限;而空白对照组在肺部则检测到了大量细菌定植,且在感染后第28天都并未清除至检测限,百日咳特异性的FHA和PRN抗体在感染后的第14天也出现了相应的升高。结论候选疫苗在Wistar大鼠模型上具有较好的免疫保护效果。

关键词：无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗免疫感染保护效果

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一株柯萨奇病毒A组6型毒株RYN-A1205的分子特征及其在KMB17细胞上的遗传稳定性研究

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中国病毒病杂志 2020年第2期10卷 102-108页

作者：刘红波张捷许丹菡丛山日黄小琴孙浩杨昭庆马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的研究1株手足口病相关柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CV-A6)毒株RYN-A1205的分子特征及其在KMB17细胞中连续传代的遗传稳定性。方法利用MEGA7.0软件并采用neighborjoining法对RYN-A1205株及65株CV-A6代表株基于全长VP1序列进... 详细信息

目的研究1株手足口病相关柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CV-A6)毒株RYN-A1205的分子特征及其在KMB17细胞中连续传代的遗传稳定性。方法利用MEGA7.0软件并采用neighborjoining法对RYN-A1205株及65株CV-A6代表株基于全长VP1序列进行种系进化分析。另外,将RYNA1205株以MOI=1接种至KMB17细胞中于37℃连续传代培养,提取适应前及适应后第1、5、10、15代毒株的RNA,以其为模板,RT-PCR分段扩增全基因组序列并进行测序分析。结果RYN-A1205株属于D3基因亚型中的D3a分支,能较好地适应KMB17细胞。与适应前毒株相比,适应后毒株共发生15个碱基突变,造成12个氨基酸替换。适应后各代次病毒全基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为99.97%~100%和99.90%~100%,其中,P10代在VP2和3D编码区各发生1个氨基酸的替换,P15代氨基酸突变情况与P10代一致。结论RYN-A1205株与我国近几年的CV-A6内地流行株在进化树中属于同一分支,在KMB17细胞上适应后保持良好的遗传稳定性,这为后续CV-A6疫苗的研发提供参考。

关键词：柯萨奇病毒A组6型分子特征 KMB17细胞遗传稳定性

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细胞工厂中F基因型腮腺炎病毒SP-A株在人二倍体细胞上的增殖研究

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微生物学免疫学进展 2020年第1期48卷 63-68页

作者：王微邱恒杨振清丁开云樊会青李琦涵王晶晶中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的利用细胞工厂,探讨F基因型腮腺炎病毒SP-A株在KMB17细胞上的增殖特性,为腮腺炎疫苗的研制提供基础数据。方法分别以体积分数为10%、8%和5%的血清浓度将细胞培养至单层后,观察病毒接种后细胞病变情况,初步确定最低血清含量后;在不含... 详细信息

目的利用细胞工厂,探讨F基因型腮腺炎病毒SP-A株在KMB17细胞上的增殖特性,为腮腺炎疫苗的研制提供基础数据。方法分别以体积分数为10%、8%和5%的血清浓度将细胞培养至单层后,观察病毒接种后细胞病变情况,初步确定最低血清含量后;在不含血清培养基条件下,按照不同接种感染复数(multiplicity of infection,MOI)接种细胞,确定病毒增殖峰值后,进一步观察不同吸附条件对病毒增殖的影响;同时进行荧光实时定量PCR,验证病毒增殖变化。结果在体积分数为5%的血清条件下,细胞可生长成致密单层;高MOI(0.500)感染细胞后,在4~5 d内进入增殖高峰,中MOI(0.050)、低MOI(0.005)感染细胞后,在5~6 d进入增殖高峰,维持48 h后,呈现缓慢下降趋势;在比较37℃吸附试验中,非吸附组病毒增殖高峰明显迟于吸附组,荧光实时定量PCR检测结果显示在病毒感染细胞6 d时病毒载量达到峰值。结论5%新生牛血清即可获得生长状态良好的细胞,MOI对腮腺炎病毒在KMB17细胞株中的增殖有较大的影响,当使用适宜范围的MOI(0.01~0.02),在非吸附的条件下,腮腺炎病毒SP-A株在KMB17株中能够良好地增殖,在病毒培养至7~9 d可获得高滴度的病毒收获液。

关键词：腮腺炎病毒 F基因型病毒增殖人二倍体细胞细胞工厂

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体外研究脊髓灰质炎病毒Ⅰ型疫苗株结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应系统的作用及其免疫学意义

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病毒学报 2019年第2期35卷 225-232页

作者：吴化叶牟唐维王建斌柳蕾程继帅冯敏王丽春张莹李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

尽管针对脊髓灰质炎病毒已经有长达数百年的研究并成功研制出了预防性疫苗,但是对于该病毒如何启动机体天然免疫反应,进而激活获得性免疫反应这一过程的具体分子机理仍有诸多空白。本研究通过体外分析脊髓灰质炎病毒Sabin减毒株Ⅰ型的... 详细信息

尽管针对脊髓灰质炎病毒已经有长达数百年的研究并成功研制出了预防性疫苗,但是对于该病毒如何启动机体天然免疫反应,进而激活获得性免疫反应这一过程的具体分子机理仍有诸多空白。本研究通过体外分析脊髓灰质炎病毒Sabin减毒株Ⅰ型的结构蛋白对人呼吸道上皮细胞内天然免疫反应信号分子的影响,了解脊髓灰质炎病毒在上皮细胞中启动免疫信号的具体分子机制。采用PCR方法扩增脊髓灰质炎病毒四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4,经酶切纯化后与pcDNA3.1+真核表达载体连接,分别构建含目的基因的四种重组质粒。将重组质粒分别转染至人呼吸道上皮细胞16HBE中,48h后收集培养上清、细胞。提取细胞的总RNA,利用Q-PCR法分别检测四种结构蛋白表达所诱导的天然免疫信号分子的mRNA表达量。同时,上清、细胞裂解物分别与人T细胞共培养,检测其对T细胞增殖的影响。体外在16HBE细胞中分别表达SabinⅠ病毒VP1～VP4四种结构蛋白均可刺激如LTα3、NIK等NF-κB天然免疫信号通路相关分子的表达,并且表达这四种蛋白的细胞裂解物与T细胞共培养后均表现出刺激T细胞非特异性增殖的效应。但是,仅有VP1、VP2表达所诱导分泌相关因子的培养上清才表现出间接刺激T细胞增殖的能力。SabinⅠ毒株的四种结构蛋白可激活NF-κB信号通路,促进T细胞的非特异性增殖,从而激活适应性免疫应答。

关键词：脊髓灰质炎脊髓灰质炎病毒(PV) 结构蛋白信号通路 NF-κB

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东南亚地区寨卡病毒的流行及结构蛋白分子进化特征分析

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中国生物制品学杂志 2019年第9期32卷 958-964页

作者：林垚洪珊蓝青萍孙强明中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室

目的分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)在东南亚地区的感染传播情况,探讨其分子水平上的进化特征。方法用关键词和主题词检索ZIKV在东南亚地区暴发感染流行情况。在GenBank中获取ZIKV东南亚病毒株全基因序列,采用BIOEDIT软件进行比对;利用M... 详细信息

目的分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)在东南亚地区的感染传播情况,探讨其分子水平上的进化特征。方法用关键词和主题词检索ZIKV在东南亚地区暴发感染流行情况。在GenBank中获取ZIKV东南亚病毒株全基因序列,采用BIOEDIT软件进行比对;利用MEGA 7. 0软件绘制系统进化树;将结构蛋白核苷酸翻译获得其相应的氨基酸序列,分析突变情况;统计不同株型间结构蛋白核苷酸突变和氨基酸替代位点;预测包膜蛋白第三结构域(envelop domainⅢ,ED-Ⅲ)的二级结构。结果 ZIKV在东南亚国家均有血清学感染或回顾性检测阳性报道,其中越南、泰国和新加坡ZIKV感染病例较多,疾病负担较为严重。系统进化树表明,东南亚ZIKV株均属于亚洲型,2016年新加坡株(序列号:KY241788)与2015年巴西株亲缘关系最近,1966年分离的马来西亚株与其他东南亚株亲缘关系较远。东南亚ZIKV各株型间衣壳蛋白(capsid protein,C)的碱基突变点为22处,突变率为6. 36%,造成非同义氨基酸突变点为19处,突变率为16. 52%。前膜蛋白(pre-membrane protein,prM)的碱基突变点为51处,突变率为10. 12%,造成非同义氨基酸突变点为37处,突变率为22. 02%。包膜蛋白(envelope protein,E)的碱基突变点为141处,突变率为9. 33%,造成非同义氨基酸突变点为101处,突变率为20. 04%。ED-Ⅲ二级结构预测结果显示,在该区域2株代表株有相同数量的蛋白结合位点,代表株2(1966 Malaysia KX377336)存在1个蛋白结合位点富集区(ED-Ⅲ:55-63),而代表株1(2014 Thailand KU681081)蛋白结合位点分布较均匀,代表株2的ED-Ⅲ存在1个二硫键,而代表株1不存在,代表株1(ED-Ⅲ:79-80)存在1个解螺旋,而代表株2不存在。结论通过病例统计分析、系统发育分析、蛋白质核苷酸及氨基酸序列比较分析、ED-Ⅲ二级结构预测,为研究东南亚地区ZIKV不同株型间的生物学和流行致病性差异提供参考。

关键词：寨卡病毒东南亚流行结构蛋白分子特征

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序列优化的小鼠IL-33基因在哺乳动物细胞中的有效分泌表达

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中国生物工程杂志 2019年第3期39卷 46-55页

作者：高福兰齐家龙舒聪妍谢航航黄惟巍刘存宝杨旭孙文佳白红妹马雁冰昆明医科大学昆明650500 中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心昆明650118

目的:白细胞介素(IL)-33具有重要的免疫调控作用,在疾病中扮演着重要的角色。本文旨在通过基因优化实现IL-33在哺乳动物细胞中的高效表达,为疾病机理研究以及疫苗免疫佐剂应用等提供基础。方法:根据小鼠白细胞介素-33成熟肽(m IL-33)的... 详细信息

目的:白细胞介素(IL)-33具有重要的免疫调控作用,在疾病中扮演着重要的角色。本文旨在通过基因优化实现IL-33在哺乳动物细胞中的高效表达,为疾病机理研究以及疫苗免疫佐剂应用等提供基础。方法:根据小鼠白细胞介素-33成熟肽(m IL-33)的氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成优化的m IL-33基因片段,通过搭桥PCR将编码人CD8α信号肽的核酸序列分别与优化或未优化的m IL-33基因连接,并与绿色荧光蛋白(EGFP)基因分别构建到双表达单元质粒p Bud CE4. 1的不同启动子下;重组质粒经lipofectamine 3000和PEI转染293FT细胞;以Western blot和ELISA检测重组蛋白的表达;收集表达的m IL-33刺激巨噬细胞Raw264. 7,ELISA检测培养上清的TNFα水平,以证明IL-33的生物学活性。结果:重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功; lipofectamine 3000转染效率较PEI转染更高; Western blot和ELISA结果显示密码子优化的m IL-33表达水平较未优化序列更高,在EF-1α启动子和CMV启动子指导下m IL-33在293FT细胞表达水平相当,CD8α信号肽成功引导m IL-33的分泌,产物具生物学活性。结论:密码子优化操作显著改善了m IL-33在哺乳动物细胞中的表达水平,为进一步研究奠定了基础。

关键词：序列优化白细胞介素-33成熟肽(mIL-33) 293FT

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不同细胞对柯萨奇病毒A组10型毒株的敏感性及滴度检测影响因素分析

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中国病毒病杂志 2020年第4期10卷 267-271页

作者：高微捷岳磊杨婷宋霞李华谢天宏何鑫卫星辰谢忠平中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的探讨不同细胞对柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)毒株的敏感性和滴度检测影响因素,为临床样品分离、病毒培养及保存使用提供基础数据。方法10株已在非洲绿猴肾(African green monkey kidney,Vero)细胞分离并培养2代的C... 详细信息

目的探讨不同细胞对柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus A10,CV-A10)毒株的敏感性和滴度检测影响因素,为临床样品分离、病毒培养及保存使用提供基础数据。方法10株已在非洲绿猴肾(African green monkey kidney,Vero)细胞分离并培养2代的CV-A10毒株,检测其在Vero细胞、人胚肺二倍体细胞(human embryonic lung diploid cell,KMB17)、人横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞及人喉癌细胞(human laryngeal carcinoma cell,HeP-2)上的感染性滴度,并对毒株进行蚀斑纯化和冻融处理。结果CV-A10毒株均能适应Vero细胞、KMB17细胞及RD细胞,不能适应HeP-2细胞。RD细胞上第1天即开始病变,第4天达到增值高峰,感染性滴度最高,达到7.75 lgCCID50/ml;KMB17细胞上病变最慢,第3天发生病变,第5天达到增值高峰,滴度为4.85 lgCCID50/ml。毒株在37℃放置3 d感染性滴度明显下降,4℃放置3 d,-30℃和-80℃放置30 d感染性滴度均无影响。结论RD细胞是CV-A10毒株最敏感的细胞,HeP-2细胞不敏感。CV-A10毒株反复冻融次数不宜超过5次,保存温度越低越好并避免4℃和常温下长时间放置。

关键词：柯萨奇病毒A组10型感染性滴度生长特性细胞敏感性 Vero细胞 RD细胞 KMB17细胞

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新工艺制备Hib结合疫苗原液长期稳定性试验

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昆明医科大学学报 2020年第2期41卷 12-15页

作者：朱文勇王明清宋绍辉李双丽胡文廖国阳中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的在前期开发的b型流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae type b,Hib)荚膜多糖提取新工艺及利用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化的疫苗制备新方法的基础上,评价利用新方法生产的Hib结合疫苗原液的稳定性。方法将疫苗原液在2~8℃条件下放置36个月,根据实验设计,不同时间取样并按照《中国药典》中相应的检测指标、检测方法进行评价。结果新工艺制备的Hib结合疫苗原液在2~8℃储存条件下,大部分指标保持相对稳定,只有分子量大小、高分子结合物含量及效力结果下降,但保存30个月仍符合2010年《中国药典》的相关要求。结论新方法与传统方法生产的Hib结合疫苗原液稳定性基本相同,证明了利用新方法制备Hib结合疫苗的新工艺可以用于扩大生产规模。

关键词：新工艺 Hib 原液稳定性

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一株柯萨奇病毒A组9型病毒的全基因组分析

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中国病毒病杂志 2020年第5期10卷 355-358页

作者：丛山日刘红波许丹菡郭伟黄小琴孙浩杨昭庆马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的对2010年云南省昆明市1例手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)并发脑炎患儿的粪便中分离到的1株柯萨奇病毒A组9型(coxsackievirus A9,CV-A9)毒株的全基因组序列和遗传特性进行分析。方法利用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyo... 详细信息

目的对2010年云南省昆明市1例手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)并发脑炎患儿的粪便中分离到的1株柯萨奇病毒A组9型(coxsackievirus A9,CV-A9)毒株的全基因组序列和遗传特性进行分析。方法利用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞对该粪便标本进行病毒分离,提取病毒RNA,采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR)分段扩增病毒的全基因组序列,利用MEGA 6.06、Geneious 9.0.2和SimPlot 3.5.1等软件对该毒株的全基因序列进行分析。结果获得1株CV-A9分离株(A744/YN/CHN/2010,简称A744),其全基因组序列长为7319bp。该毒株与CV-A9重组株(A108/YN/CHN/2009)核苷酸一致性和氨基酸同源性最高,分别为97.4%和99.0%,可能发生重组事件。结论A744分离株为CV-A9,与中国其他CV-A9分离株同属D2基因亚型。

关键词：柯萨奇病毒A组9型全基因组进化分析遗传特性

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