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中国生物制品学杂志 2018年第3期31卷 257-261页

作者：朱文兵严丽蔚巩蔚张雪梅吴忠香徐婧雯宋杰董少忠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的制备肠道病毒71型(enterovirus A 71,EV71)鼠源性中和单克隆抗体。方法以灭活EV71病毒液为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得抗EV71单克隆抗体;ELISA法检测抗体的特征,获得具有高效结合性的单克隆抗体;SDS-PAGE和Western blo... 详细信息

目的制备肠道病毒71型(enterovirus A 71,EV71)鼠源性中和单克隆抗体。方法以灭活EV71病毒液为免疫原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得抗EV71单克隆抗体;ELISA法检测抗体的特征,获得具有高效结合性的单克隆抗体;SDS-PAGE和Western blot法鉴定Protein A纯化的抗体;通过体外和体内中和试验鉴定抗体的中和特性。结果得到3株针对EV71 VP1的高效结合性单克隆抗体15H7、15G7和6G2,且15H7经中和试验证明具有较强的中和活性。结论成功制备了EV71鼠源性中和单克隆抗体,其在小鼠体内能成功地抑制病毒增殖。

关键词：肠道病毒71型单克隆抗体中和作用

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Ⅱ型登革病毒前膜抗体对该病毒在THP-1细胞中复制能力的影响

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中国生物制品学杂志 2018年第2期31卷 125-128页

作者：姜黎明杨佳佳罗佳叶超文送娇孙强明中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的探讨Ⅱ型登革病毒(dengue virusⅡ,DENVⅡ)前膜(presynaptic membrane,prM)抗体对DENVⅡ在THP-1细胞中复制能力的影响。方法采用不同稀释度(1/4~1/16 384)的DENVⅡanti-pr M单克隆抗体分别与不同MOI的DENVⅡ(MOI分别为3、0.75及0.19)复合感染THP-1细胞。建立DENVⅡ荧光定量PCR检测标准曲线,检测THP-1细胞培养上清液的病毒拷贝数。结果 DENVⅡ按MOI=3感染THP-1细胞,当prM稀释度为1/16和1/16 384时诱发THP-1细胞产生病毒的载量较高,prM稀释度为1/64和1/256时抑制病毒生长;DENVⅡ按MOI=0.75感染THP-1细胞,当prM稀释度1/16时可诱发更高浓度病毒载量;DENVⅡ按MOI=0.19感染THP-1细胞时,不会诱导产生高浓度的病毒载量。结论中浓度pr M抗体可抑制DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力,而高及低浓度prM抗体可促进DENVⅡ在THP-1细胞中的复制能力。

关键词： Ⅱ型登革病毒前膜抗体 THP-1细胞复制能力

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云南汉族人群CCR5基因启动子多态性与HCV慢性感染的关系

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贵州医科大学学报 2019年第1期44卷 18-25页

作者：陈珺刘舒媛聂磊朱永玉李传印刘楠楠周紫云史荔张淑琼中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明市第三人民医院云南昆明650041

目的:研究云南汉族人群CCR5基因启动子单核苷酸多态性位点(SNPs)与丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染的关系。方法:选取356例云南汉族HCV慢性感染者作为病例组,353例健康体检者作为对照组,采用PCR法扩增受检者CCR5基因启动子区基因序列;然后采... 详细信息

目的:研究云南汉族人群CCR5基因启动子单核苷酸多态性位点(SNPs)与丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染的关系。方法:选取356例云南汉族HCV慢性感染者作为病例组,353例健康体检者作为对照组,采用PCR法扩增受检者CCR5基因启动子区基因序列;然后采用Sanger法对扩增序列进行测序并与Gen Bank(NC_000003.12)序列比较获得与云南省汉族人群具有多态性的SNPs位点,对获得的SNPs位点进行基因分型,计算这些SNPs位点的等位基因频率和基因型频率;构建单倍型并分析遗传模式进行,比较两组间的分布差异。结果:在CCR5基因启动子区域有9个SNPs位点,其中rs2227010(A>G)、rs2734648(T>G)、rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023 (G>A)及1800024 (C>T) 6个位点在云南省汉族人群中具有多态性;这6个SNPs位点的基因型频率、等位基因频率及单倍型频率在病例组与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:CCR5基因启动子中的rs2227010(A>G)、rs2734648(T>G)、rs1799987 (G>A)、rs1799988 (T>C)、rs1800023 (G>A)及1800024 (C>T) SNPs位点与云南汉族人群HCV慢性感染无关。

关键词：基因多态性,单核苷酸肝炎,丙型 CCR5 肝炎病毒慢性感染云南汉族

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云南汉族人群HLA-DM基因多态性与HCV慢性感染的相关性分析

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贵州医科大学学报 2019年第5期44卷 524-529页

作者：陈珺杨瑾刘楠楠刘舒媛李传印张新文史荔张淑琼中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 昆明市第三人民医院云南昆明650041

目的:研究云南汉族人群中HLA-DM基因多态性与丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染的关系。方法:选取云南汉族人群HCV慢性感染者185人(病例组),健康对照180人(对照组),采用Sanger测序法和TA克隆测序法对HLA-DMA,HLA-DMB基因进行基因分型,计算这两... 详细信息

目的:研究云南汉族人群中HLA-DM基因多态性与丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染的关系。方法:选取云南汉族人群HCV慢性感染者185人(病例组),健康对照180人(对照组),采用Sanger测序法和TA克隆测序法对HLA-DMA,HLA-DMB基因进行基因分型,计算这两个基因在病例组和对照组中的等位基因频率和基因型频率;构建单倍型,比较两组间的分布差异。结果:在病例组和对照组中,共检出4种HLA-DMA等位基因和5种HLA-DMB等位基因,DMA*01∶01-DMB*01∶03单倍型在病例组中的频率显著高于对照组(0.287vs0.197,OR=0.134,95%CI为1.529~2.305,P=0.005),DMA*01∶02-DMB*01∶03单倍型在病例组中的频率显著低于对照组(0.024vs0.056,OR=0.424,95%CI为0.194~0.944,P=0.031)。结论:单倍型DMA*01∶01-DMB*01∶03和DMA*01∶02-DMB*01∶03可能与云南汉族人群HCV慢性感染相关。

关键词： HLA-DM 肝炎,丙型慢性感染云南汉族基因多态性等位基因

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抗树鼩CD3ε单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

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中国生物工程杂志 2018年第4期38卷 54-62页

作者：徐婧雯张雪梅吴忠香朱文兵蒋曦巩蔚严丽蔚宋杰李慧董少忠中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室实验树鼩标准化与应用研究省创新团队

目的：制备鼠抗树鼩CD3ε单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法：以GST-CD3ε蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术融合免疫后的BALB/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞,通过间接酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosor... 详细信息

目的：制备鼠抗树鼩CD3ε单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。方法：以GST-CD3ε蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术融合免疫后的BALB/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞,通过间接酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测,筛选出多株能分泌抗树鼩CD3ε的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆筛选后,制备小鼠腹水单克隆抗体,并纯化得到鼠抗树鼩CD3ε单克隆抗体,通过腹水单克隆抗体效价测定、单克隆抗体亲和力测定、单克隆抗体抗原表位分析、Western blot和流式细胞荧光分选技术（fluorescence activated cell sorting,FACS）分析其生物学特性。结果：筛选到5株能稳定分泌抗树鼩CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为78I、87I、92D1、75II和35C8,腹水单克隆抗体效价分别为1∶10～6、1∶10～6、1∶10～4、1∶10～6、1∶10～3,亲和力解离常数（Kd）分别为1.8×10^-5、2.9×10^-5、4.9×10^-5、7.3×10^-5、3.6×10^-5。5株单克隆抗体抗原表位分析显示78I、87I和75II识别同一抗原表位,而92D1和35C8识别另一抗原表位。经Western blot检测,HRP标记后的92D1能识别GST-CD3ε蛋白和树鼩外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,并对大鼠、小鼠和猴的PBMC有抗体交叉反应。经FACS检测,PE-Cy5.5标记后的92D1能特异性识别树鼩PBMC。结论：成功制备出鼠抗树鼩CD3ε的单克隆抗体,为进一步应用于树鼩免疫检测奠定基础。

关键词：树鼩 CD3ε 单克隆抗体

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寨卡病毒亚洲型与非洲型基因同源性及重组分析

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中国生物制品学杂志 2018年第12期31卷 1317-1321页

作者：林垚文送娇洪珊王晓丹席珏敏陈俊英潘玥叶超孙强明中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 云南省虫媒传染病防控研究重点实验室云南普洱665000

目的分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)亚洲型与非洲型基因组核苷酸序列同源性及结构蛋白C、前膜蛋白(pre-membrane,pr M)核苷酸和氨基酸序列差异,并探讨了ZIKV亚洲型和非洲型位点突变可能产生的后果。方法在GenBank中登录的ZIKV亚洲型和... 详细信息

目的分析寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)亚洲型与非洲型基因组核苷酸序列同源性及结构蛋白C、前膜蛋白(pre-membrane,pr M)核苷酸和氨基酸序列差异,并探讨了ZIKV亚洲型和非洲型位点突变可能产生的后果。方法在GenBank中登录的ZIKV亚洲型和非洲型序列中,分别选择5个不同的全长基因组序列,并获得其相应的氨基酸序列,采用BIOEDIT软件进行比对,分析相似度,统计不同型别间结构蛋白C、prM的核苷酸突变和氨基酸替代位点,并采用SimPlot软件分析两个型别间的同源重组。结果 ZIKV亚洲型与非洲型的核苷酸相似性在88. 00%~89. 00%之间;不同型别的结构蛋白C和prM碱基的突变比较显示,C基因共有19个碱基突变,prM基因共有48个碱基突变;氨基酸翻译比对显示,这67个碱基突变均为有效突变。两个型别结构蛋白C和prM编码的289个氨基酸中,占组成比例最多的均为亮氨酸(L),同源重组分析亚洲型与非洲型一致性较高,无重组信号。结论通过对ZIKV亚洲型与非洲型的结构蛋白C、pr M核苷酸序列、氨基酸的比较分析及同源重组分析,为研究ZIKV不同基因型间的生物学和致病性差异提供参考。

关键词：寨卡病毒亚洲型非洲型 C蛋白前膜蛋白氨基酸序列

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树鼩肺成纤维细胞的分离、鉴定和传代培养

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实验动物与比较医学 2019年第2期39卷 105-110页

作者：王文广匡德宣陆彩霞罕园园李娜仝品芬孙晓梅代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省眼科疾病防治研究重点实验室中国医学科学院医学生物学研究所实验树鼩标准化与应用研究省创新团队昆明650118

目的建立适用于树鼩肺成纤维细胞的分离、鉴定和传代培养方法。方法分别采用组织块贴壁培养法和胰酶消化法,分离培养新生树鼩肺成纤维细胞,通过倒置显微镜观察细胞生长情况,用波形蛋白(Vimentin)对分离的成纤维细胞进行免疫荧光鉴定;传... 详细信息

目的建立适用于树鼩肺成纤维细胞的分离、鉴定和传代培养方法。方法分别采用组织块贴壁培养法和胰酶消化法,分离培养新生树鼩肺成纤维细胞,通过倒置显微镜观察细胞生长情况,用波形蛋白(Vimentin)对分离的成纤维细胞进行免疫荧光鉴定;传代培养并开展冻存复苏实验,采用MTS法绘制细胞生长曲线,以人胚肺二倍体成纤维细胞(KMB-17)作对照。结果通过组织块贴壁培养法和胰酶消化法均可获取树鼩肺成纤维细胞,细胞主要呈现梭形,波形蛋白免疫荧光鉴定普遍呈阳性,与KMB-17一致。树鼩肺成纤维细胞可连续传代4～5次,经冻存复苏后细胞仍能保持活力,以5×10~4细胞/mL的密度传代,细胞可在3 d左右进入对数生长期。结论组织块贴壁培养法和胰酶消化法均可有效获取树鼩的肺成纤维细胞,可为肺部相关疾病的体外研究提供实验材料。

关键词：树鼩肺成纤维细胞鉴定传代培养

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氯仿抽提纯化CA 16病毒最优条件的筛选

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中国生物制品学杂志 2018年第3期31卷 282-286页

作者：张也李华杨婷岳磊谢天宏龙润乡罗芳宇杨蓉何鑫谢忠平中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的筛选氯仿抽提纯化柯萨奇病毒A组16型(Coxsakievirus A 16,CA16)的最优条件。方法根据《中国药典》三部(2015版)的相关要求,选择病毒感染性滴度、残余蛋白、残余牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、残余卡那霉素及残余氯仿含... 详细信息

目的筛选氯仿抽提纯化柯萨奇病毒A组16型(Coxsakievirus A 16,CA16)的最优条件。方法根据《中国药典》三部(2015版)的相关要求,选择病毒感染性滴度、残余蛋白、残余牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、残余卡那霉素及残余氯仿含量等指标,分析氯仿抽提的不同条件及超滤浓缩对纯化产物质量指标的影响。将CA16浓缩病毒液与氯仿按不同体积比进行一抽多洗纯化,分析不同比例氯仿对纯化效果的影响;将CA16超滤浓缩病毒液分别用不同浓度的PBS洗涤,以评价不同离子浓度的PBS洗涤对纯化病毒纯化液质量指标的影响。结果不同浓度的PBS洗涤液、病毒液与氯仿体积比对纯化液病毒感染性滴度均无明显影响,病毒回收率平均为81.7%;随着PBS洗涤次数的增多,洗液中的杂蛋白逐渐减少,氯仿比例及PBS离子浓度对蛋白去除率影响不明显,蛋白去除率均大于82%(82.69%~93.6%),平均去除率88.37%;不同氯仿比例、不同PBS浓度及不同洗涤次数对残余卡那霉素含量无明显影响,结果均低于30 ng/mL,经超滤浓缩后,其含量低于3.0 ng/mL;氯仿抽提纯化残余BSA的去除率可达68.87%,若结合超滤浓缩工艺,残余BSA的去除率可达94.74%;超滤浓缩后纯化病毒液残余氯仿去除率可达98%以上,最终纯化液残余氯仿含量小于6μg/mL。结论氯仿抽提方法结合超滤浓缩可得到符合要求的CA16病毒实验性疫苗。

关键词：柯萨奇病毒A组16型氯仿抽提疫苗质量控制

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甲型肝炎病毒疫苗株H2株的连续传代及其基因稳定性

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中华实验和临床病毒学杂志 2018年第1期32卷 80-84页

作者：王东宝曹晗郑勇史小军马忠飞段颖融邓燕孙明波北京协和医学院中国医学科学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的分析甲型肝炎减毒活疫苗H2株（hepatitis A virus H2 live attenuated vaccine strain）毒种H2M20K7（K7）经连续传代后病毒基因的遗传稳定性.方法将H2株毒种K7用细胞工厂在人二倍体细胞KMB17中进行连续传代后,收获不同代次的病毒... 详细信息

目的分析甲型肝炎减毒活疫苗H2株（hepatitis A virus H2 live attenuated vaccine strain）毒种H2M20K7（K7）经连续传代后病毒基因的遗传稳定性.方法将H2株毒种K7用细胞工厂在人二倍体细胞KMB17中进行连续传代后,收获不同代次的病毒,提取病毒RNA,用二代高通量深度测序方法,测定不同代次病毒（K7,K10,Kll,K13,K15,K18）的全基因序列,对比分析病毒的基因变异率,同时对病毒的感染性滴度进行检测和对比.结果 H2M20K7主代毒种经连续传代后,不同代次病毒的全基因序列总体变异率较低,非同义突变率小于0.58％,基因结构稳定;在5＇NCR非编码区域的基因突变率＜0.1％;在VP1/2 A、2C毒力位点区域突变率小于0.01％;不同代次病毒的感染性滴度维持在7.76～ 8.50 lgCCID50/ml之间,P值为0.981差异无统计学意义.结论 H2M20K7主代毒种、工作毒种、疫苗批病毒及经过连续传代后的各代次病毒基因结构稳定;在5＇NCR非编码区未发生明显突变,毒力相关位点VP1/2 A、2B、2C等关键位点的基因均为减毒特征,变异率极低,未引起病毒毒力特征改变.病毒感染性稳定且符合要求,具有较好的遗传稳定性.

关键词：甲肝病毒H2株基因稳定性二代高通量全基因测序核苷酸序列

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2017年两株肠道病毒71型襄阳分离株的全基因组分析

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中国生物制品学杂志 2018年第8期31卷 824-829页

作者：于亮赵义林张海浩张捷李倩杨昭庆闵国平马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 襄阳市疾病预防控制中心湖北襄阳420607

目的分析2017年两株肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)分离株的全基因组及其遗传特性。方法收集手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)粪便样品,采用RD细胞进行病毒分离;提取病毒RNA,采用RTPCR法分段扩增EV71全长基因组,经测序... 详细信息

目的分析2017年两株肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)分离株的全基因组及其遗传特性。方法收集手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)粪便样品,采用RD细胞进行病毒分离;提取病毒RNA,采用RTPCR法分段扩增EV71全长基因组,经测序和拼接后,利用Mega 6.06和SimPlot 3.5.1等软件进行分析。结果两株EV71分离株4-23/XY/CHN/2017和6-4/XY/CHN/2017基因组全长均为7 406 bp,编码含2 193个氨基酸残基的多聚蛋白。通过Mega 6.06软件分析显示,与EV71/SZ50/CHN/2014株全基因的核苷酸同源性最高(97.6%),其VP1核苷酸同源性与EV71/FJFZ422/CHN/2015株最高(99%)。在全基因组上,与原型株Br Cr的核苷酸同源性分别80.6%和80.7%,氨基酸同源性均为99.3%;在VP1序列上,与C4a基因型其他毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别94.5%~99.3%和97.3%~98.5%。进化分析显示,这两分离株属于C4a基因型。重组分析未发现重组事件发生。结论 2017年襄阳分离株4-23/XY/CHN/2017和6-4/XY/CHN/2017属于C4a基因型,且未发生重组。

关键词：手足口病肠道病毒71型全基因组序列分析

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