检索结果-内蒙古大学图书馆

病毒学报 2015年第5期31卷 548-553页

作者：谢力米锴叶静牛香莲孙晓琴易山李鸿钧孙茂盛昆明学院医学院昆明650214 中国医学科学院医学生物学研究所北京协和医学院云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 昆明医科大学昆明650503

通过对G1P[8]型人野生轮状病毒ZTR-68株的梯度降温传代,筛选适应低温的轮状病毒减毒毒株,为轮状病毒减毒疫苗的制备提供研究基础。自腹泻婴儿粪便样品中分离轮状病毒,在MA104猴肾细胞中自37℃始传代培育,每传代8代后降温3℃,连续传代至2... 详细信息

通过对G1P[8]型人野生轮状病毒ZTR-68株的梯度降温传代,筛选适应低温的轮状病毒减毒毒株,为轮状病毒减毒疫苗的制备提供研究基础。自腹泻婴儿粪便样品中分离轮状病毒,在MA104猴肾细胞中自37℃始传代培育,每传代8代后降温3℃,连续传代至28℃,累计传代32代,低温适应过程中检测病毒生物学性状的变化。梯度降温传代后得到的冷适应株RNA基因组电泳迁移条带仍与原始毒株保持一致,血凝滴度降低,病毒蚀斑形态趋于变小且不规则,37℃回复培养时病毒呈现增殖速度减慢且感染性滴度降低的变化。结果显示:野生轮状病毒经冷适应传代后可以得到具有减毒效应的稳定毒株,该毒株出现了部分生物学特征的改变,冷适应株的选育为轮状病毒减毒活疫苗的研制提供了一种备选策略。

关键词：轮状病毒冷适应株生物学特征鉴定

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基于HPV16E7蛋白CTLs抗原肽的病毒样颗粒治疗性疫苗的构建

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中国生物工程杂志 2015年第2期35卷 45-51页

作者：褚晓杰李杨龙琼姚宇峰孙文佳黄惟巍杨旭刘存宝马雁冰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心昆明650118

目的:构建呈递HPV16 E7 CTLs抗原表位的病毒样颗粒,并初步评价病毒样颗粒作为治疗性疫苗载体的潜能。方法:根据文献选择有效的HPV16 E7 CTLs表位,合成其正负链寡核苷酸序列,并通过退火形成双链DNA片段。将片段克隆于表达乙肝核心抗原的... 详细信息

目的:构建呈递HPV16 E7 CTLs抗原表位的病毒样颗粒,并初步评价病毒样颗粒作为治疗性疫苗载体的潜能。方法:根据文献选择有效的HPV16 E7 CTLs表位,合成其正负链寡核苷酸序列,并通过退火形成双链DNA片段。将片段克隆于表达乙肝核心抗原的重组质粒p Thio His AHBc Ag,使抗原肽得以呈现于病毒样颗粒。重组菌经IPTG诱导后经SDS-PAGE鉴定目的蛋白表达。菌体破碎后经硫酸铵盐析法和蔗糖密度梯度离心进行纯化,并经高效液相凝胶过滤色谱和电镜鉴定病毒样颗粒的存在。制备的病毒样颗粒免疫接种了TC-1细胞的肿瘤模型小鼠,检测小鼠肿瘤大小。此外,在体外以抗原肽刺激脾细胞,以ELISA检测IFN-γ表达水平。结果:构建的三个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建正确。表达的重组蛋白大小与预期相符,并形成了病毒样颗粒。免疫小鼠后显示了抑制肿瘤增长的一定作用趋势。此外,抗原肽体外刺激促进了疫苗免疫小鼠脾细胞IFN-γ的表达,显示疫苗引起机体产生E7特异性的细胞免疫应答。结论:HBc Ag VLPs是有潜能的治疗性疫苗载体。

关键词：病毒样颗粒治疗性疫苗人乳头瘤病毒

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新型抗原递送载体:细胞溶素A融合目的蛋白整合的重组外膜囊泡的构建与鉴定

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中国生物化学与分子生物学报 2016年第11期32卷 1272-1278页

作者：王世杰黄惟巍舒聪妍黎奎夏烨李扬李慧孙鹏艳杨旭白红妹孙文佳刘存宝褚晓杰冯雪军马雁冰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心昆明650118

细菌外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性菌以出芽方式分泌的一种蛋白脂质体,可通过基因工程改造成为外源大分子抗原蛋白的载体。成孔蛋白细胞溶素A(Cly A)可作为引导序列将C-端融合的外源蛋白质定位在菌体及其所分泌的OMVs外膜上。利用Cly A融... 详细信息

细菌外膜囊泡(OMVs)是革兰氏阴性菌以出芽方式分泌的一种蛋白脂质体,可通过基因工程改造成为外源大分子抗原蛋白的载体。成孔蛋白细胞溶素A(Cly A)可作为引导序列将C-端融合的外源蛋白质定位在菌体及其所分泌的OMVs外膜上。利用Cly A融合蛋白重组的OMVs可介导抗原呈递,制备疫苗。为验证这一假说,本研究拟以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为目的蛋白,采用重组技术,构建Cly A-EGFP融合蛋白表达载体,转化*** DH5α,获得Cly A-EGFP融合蛋白整合的重组细菌OMVs,探索Cly A/EGFP融合蛋白整合的OMVs作为一种制备新型疫苗载体的可行性。重组OMVs分别经蛋白酶K和/或EDTA处理后,蛋白质印迹分析显示,Cly A-EGFP融合蛋白有效地整合在重组的OMVs中,且EGFP呈现于表面。重组OMVs与小鼠巨噬细胞Raw264.7共同孵育后,以EGFP作为标记,荧光显微镜观察显示,OMVs可被巨噬细胞吞噬、摄取。进而,荧光显微镜及流式细胞术分析证明,重组的OMVs可被骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)有效摄取,并促进BMDCs表达CD86和CD80,说明重组的OMVs可激活树突状细胞,促进其成熟。本研究结果提示,利用Cly A融合特异目的蛋白整合的重组OMVs,可作为外源蛋白质的载体,介导抗原呈递作用,在设计与制备疫苗中具有潜在的应用价值。

关键词：外膜囊泡疫苗增强绿色荧光蛋白抗原递呈细胞

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人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2018年第5期31卷 543-546,551页

作者：钱兴丽任芳芳宋彩花段男李娅娴陈巍赵勇袁梅李亚东俞建昆杨晓蕾洪超中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所质量检定室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的建立人用疫苗及生产用细胞中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证。方法参照Gen Bank中登录的PCV1(KC447455)和PCV2(AY578327)序列,全基因组合成PCV1和PCV2基因序列,以合成的PCV1和PCV2全基因组序列DNA为模板,进行PCR扩增,对PCR反应中的退火温度进行优化。对优化后的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测疫苗生产用细胞KMB_(17)、Vero工作种子批、脊髓灰质炎减毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine,OPV)收获液、冻干甲型肝炎减毒活疫苗(freeze-dried hepatitis A vaccine,f HAV)成品、肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)灭活疫苗收获液及成品、Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine prepared with Sabin strain,SIPV)收获液及成品的PCV1和PCV2。结果优化后的退火温度为63℃,建立的PCR方法最低可检测出10^(-1)fg/μL的目的基因,仅对PCV基因组DNA能扩增出特异性条带。用该方法检测生产用细胞KMB_(17)及Vero工作种子批、OPV收获液、f HAV成品、EV71灭活疫苗收获液及成品、SIPV收获液及成品,均未检出PCV1和PCV2。结论成功建立了生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,能够用于本所生物制品生产用细胞种子、疫苗收获液及成品中PCV污染的检测,从而提高生物制品的安全性。

关键词：疫苗细胞猪圆环病毒聚合酶链式反应

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云南省3株柯萨奇A组16型病毒全基因组序列分析

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中国病原生物学杂志 2022年第2期17卷 149-153,158页

作者：冯昌增刘昕蓓张名许丹菡徐炽何云龙马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 云南大学医学院

目的分析柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)分离株全基因组特征。方法使用人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)、非洲绿猴肾细胞(Vero)和人胚肺二倍体细胞(human embryonic lung diploid fibroblasts,KMB17)从2019年云南手足口病患者粪便标本中分离CV-A16毒株。采用RT-PCR扩增其全基因组,测序并通过生物信息学方法对其全基因序列、系统进化和基因重组进行分析。结果共分离到3株CV-A16毒株,均为Vero细胞分离株。VP1系统进化分析表明,K106/YN/CHN/2019和K39/YN/CHN/2019属于B1基因亚型的B1b分支,K23/YN/CHN/2019属于B1基因亚型的B1a分支。在全基因组核苷酸序列上,K106/YN/CHN/2019和K39/YN/CHN/2019与中国CV-A16分离株相似性高,K23/YN/CHN/2019与国外CV-A16分离株相似性较高,其中,与澳大利亚分离株C138/CHW/AUS/2016之间的核苷酸相似性为97.6%。基于P1、P2和P3的系统进化、全基因组同源性和重组分析结果显示CV-A16在5'-UTR及P2、P3区可能与肠道病毒A组多个其他血清型病毒发生过型间重组事件。结论2019年从云南省手足口病患者粪便标本中分离到3株CV-A16,均为中国大陆流行基因型,为CV-A16的分子流行病学研究提供了理论基础。

关键词：柯萨奇病毒A组16型全基因组序列型间重组

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两种层析方法纯化轮状病毒效果的比较

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中国生物制品学杂志 2012年第6期25卷 754-758页

作者：杨星吴晋元易山李鸿钧张光明郜岩贾琴妹赵晓南孙茂盛中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 昆明医学院昆明650031

目的比较两种不同的凝胶层析纯化方法对人轮状病毒(Rotavirus,RV)的纯化效果及其对病毒抗原性和免疫原性的影响。方法病毒收获液经超滤浓缩后,分别采用Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析和Sepharose 4 Fast Flow(4FF)凝胶过滤层... 详细信息

目的比较两种不同的凝胶层析纯化方法对人轮状病毒(Rotavirus,RV)的纯化效果及其对病毒抗原性和免疫原性的影响。方法病毒收获液经超滤浓缩后,分别采用Q Sepharose Fast Flow(QFF)离子交换层析和Sepharose 4 Fast Flow(4FF)凝胶过滤层析纯化,采用A群轮状病毒诊断试剂盒(胶体金)检测纯化病毒的抗原性;电镜观察病毒的形态;荧光灶法测定病毒纯化前后的感染性滴度;双抗体夹心ELISA法测定抗原含量;Lowry法测定纯化前后样品的蛋白含量;SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化的病毒蛋白;纯化病毒经灭活后,PAGE分析病毒的核酸带型,免疫小鼠,检测纯化病毒的免疫原性。结果QFF洗脱峰1和4FF洗脱峰1为RV抗原阳性,电镜观察可见完整的、大小约70 nm的RV颗粒;经QFF和4FF层析纯化后,病毒的感染性滴度分别为7.10和4.50 lgCCID50/ml,最终抗原回收率分别为65.3%和11.8%,病毒液总蛋白去除率分别为99.68%和99.52%;SDS-PAGE分析显示,经QFF和4FF纯化的样品未见明显杂蛋白条带,且特异性良好;纯化病毒灭活后,病毒基因组带型未发生改变,且保持了良好的抗原性和免疫原性。结论两种凝胶层析方法均能纯化人轮状病毒,综合比较,QFF离子交换层析纯化效果优于4FF凝胶过滤层析。

关键词：轮状病毒纯化离子交换层析凝胶过滤层析

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云南汉族人群HSPA1A基因多态与宫颈癌发生发展的相关性研究

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中华医学遗传学杂志 2017年第6期34卷 909-914页

作者：张新文严志凌史荔杨宏英洪超俞建昆李传印姚宇峰中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 昆明医科大学第三附属医院妇科 650118

目的探讨云南汉族人群中HSPA1A基因多态性与宫颈癌发生和发展的相关性。方法选取宫颈癌患者以及444例癌前病变（CINⅢ期）患者130例，健康正常对照548例。用TaqMan探针基因分型方法对HSPAIA基因的4个SNP位点[rs12190359（C〉T）、rs562... 详细信息

目的探讨云南汉族人群中HSPA1A基因多态性与宫颈癌发生和发展的相关性。方法选取宫颈癌患者以及444例癌前病变（CINⅢ期）患者130例，健康正常对照548例。用TaqMan探针基因分型方法对HSPAIA基因的4个SNP位点[rs12190359（C〉T）、rs562047（C〉G）、rsl008438（G〉T）和rsl043618（G〉c）]进行基因分型，研究其等位基因、基因型及所构建的单倍型在CINUI期患者、宫颈癌患者和健康对照人群中分布频率的差异。结果rs1008438位点等位基因G和T在CINⅢ期组和对照组、癌症组和对照组（P=0．022和0．030）中的分布频率的差异具有统计学意义，而在CINⅢ期组和癌症组中的分布频率差异无统计学意义（P〉0．05）；rs1008438位点基因型GG、GT和TT仅在CINⅢ期组和对照组中分布频率差异具有统计学意义（P=0．047），而在CINⅢ期组和癌症组之间、癌症组和对照组之间的分布频率差异无统计学意义（P〉0．05）。rs12190359、rs562047和rs1043618位点的等位基因和基因型在病例组和对照组中的分布频率的差异均无统计学意义（P〉0．05）。根据连锁不平衡的分析结果，对rs562047、rs1008438和rs1043618三个位点构建的单倍型进行分析，结果未显示有单倍型在各组间分布频率的差异有统计学意义（P〉0．05）。结论HSPA1A基因rs1008438位点等位基因G可能是云南汉族人群宫颈癌发生的保护性因素（OR=0．797；95％CI：0．674-0．943）。

关键词：宫颈癌 HSPA1A基因单核苷酸多态性相关性

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重组小鼠白细胞介素-33的原核表达制备及其粘膜免疫佐剂活性

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中国生物工程杂志 2017年第4期37卷 26-32页

作者：冯雪军龙琼唐增华黄惟巍刘存宝杨旭孙文佳白红妹马雁冰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心昆明650118

目的:白细胞介素(IL)-33对树突状细胞、巨噬细胞及T细胞等免疫细胞具有重要调控作用。利用大肠杆菌制备重组小鼠的IL-33,并初步考察其作为粘膜免疫佐剂应用的潜能与特点。方法:以IPTG诱导硫氧还蛋白(Trx)/IL-33融合蛋白在大肠杆菌DH5α... 详细信息

目的:白细胞介素(IL)-33对树突状细胞、巨噬细胞及T细胞等免疫细胞具有重要调控作用。利用大肠杆菌制备重组小鼠的IL-33,并初步考察其作为粘膜免疫佐剂应用的潜能与特点。方法:以IPTG诱导硫氧还蛋白(Trx)/IL-33融合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达,并通过QSepharose离子交换和Ni^(++)金属螯合亲和层析纯化Trx/IL-33,进一步经肠激酶切割获得成熟形式的IL-33。重组HBcAg混合纯化的IL-33后经滴鼻免疫小鼠,考察HBcAg特异的IgA及IgG_1、IgG_(2a)的应答。结果:纯化的重组IL-33具有与标准品相当的促巨噬细胞RAW264.7表达TNF-α的体外细胞生物学活性。作为佐剂可显著增强滴鼻粘膜免疫激发的不同粘膜组织中HBcAg特异的IgA应答,以及血清与支气管肺泡灌洗液中特异IgG_1的应答水平,而抑制IgG_(2a)应答。结论:利用大肠杆菌可制备活性IL-33,其具有粘膜免疫佐剂的应用潜能。

关键词：重组白细胞介素-33 表达粘膜免疫佐剂

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不同途径免疫不同动物制备的F基因型腮腺炎病毒抗血清的比较

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中国生物制品学杂志 2020年第11期33卷 1307-1311页

作者：王微邱恒杨振清王雯慧胡云光李琦涵王晶晶中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的利用F基因型腮腺炎病毒浓缩后疫苗原液,经不同途径免疫动物制备抗腮腺炎病毒血清。方法将F基因型腮腺炎病毒浓缩后疫苗原液与弗氏佐剂混合后,经皮下注射、肌肉注射及皮下+肌肉注射的三种途径免疫雌性家兔和雌性豚鼠,均于0、7、14、2... 详细信息

目的利用F基因型腮腺炎病毒浓缩后疫苗原液,经不同途径免疫动物制备抗腮腺炎病毒血清。方法将F基因型腮腺炎病毒浓缩后疫苗原液与弗氏佐剂混合后,经皮下注射、肌肉注射及皮下+肌肉注射的三种途径免疫雌性家兔和雌性豚鼠,均于0、7、14、28和35 d免疫,每次7.5 lgCCID50/mL,于每次免疫后7 d采用微量滴定法检测血清抗体效价。利用抗体效价较高血清对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒进行干扰试验。结果不同免疫途径均可诱导动物产生抗体,皮下+肌肉注射的免疫方式产生的血清抗体效价高于单独皮下及肌肉注射的免疫方式,差异有统计学意义(P<0.05);在同等免疫剂量下,家兔产生的抗血清效价明显高于豚鼠。家兔抗腮腺炎病毒血清对麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的滴度均无干扰。结论经皮下和肌肉注射结合的途径免疫家兔,可获得高效价血清抗体,对制备高效价F基因型腮腺炎病毒血清抗体提供了依据。

关键词：腮腺炎病毒 F基因型中和抗体效价免疫途径

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表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白受体结合域和N蛋白的重组腺病毒的构建及鉴定

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中国生物制品学杂志 2023年第9期36卷 1025-1031页

作者：宋泽鑫周艳林晓晨赵永美施鹏王学付张朝武李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所、云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的构建表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory symptom coronavirus 2,SARS-CoV-2)Delta突变株S蛋白受体结合域(receptor binding domain,RBD)和N蛋白的重组腺病毒,并进行鉴定。方法将SARSCoV-2 RBD和N基因片段分别克隆至pcDNA3.0BA载体上,构建重组质粒pcDNA3.0BA-RBD-N,PCR扩增RBD-CMVN片段,连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,将穿梭质粒pShuttle-RBD-N与pAdeasy-1进行同源重组,获得重组质粒pAdeasy-1-RBD-N,转染HEK293细胞进行重组腺病毒Ad-RBD-N包装,RT-PCR法检测重组腺病毒中RBD和N基因在HEK293细胞中的转录,Western blot和免疫荧光法检测重组腺病毒中RBD和N蛋白的表达。将Ad-RBD-N通过肌肉注射免疫12只雌性BALB/c小鼠,免疫剂量为5×10^(9)copies/只,免疫后14 d经尾静脉采血,ELISA法检测血清抗体效价。结果重组腺病毒RBD和N基因能在HEK293细胞中正常转录,RBD和N蛋白能在MA104细胞中正常表达。免疫重组腺病毒的小鼠可产生针对RBD和N蛋白的特异性IgG抗体。结论成功构建了表达SARS-CoV-2 Delta突变株S蛋白RBD和N蛋白的重组腺病毒,为Delta突变株疫苗的后续研究奠定了基础。

关键词：严重急性呼吸综合征冠状病毒2 S蛋白受体结合域 N蛋白腺病毒

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