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生物工程学报 2011年第7期27卷 1109-1114页

作者：李书芬武临专陈菲菲王红远孙桂芝王以光中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 中国医药集团四川抗菌素工业研究所成都610052

对格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997的发酵液乙酸乙酯提取物进行了硅胶板TLC初步分离和NaOH溶液喷涂显色,对显红色、具有抗革兰阳性菌活性的条带进行了HPLC分析,提示抗革兰阳性菌活性化合物可能为大环二内酯类抗生素洋橄榄叶素;以dTDP-... 详细信息

对格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997的发酵液乙酸乙酯提取物进行了硅胶板TLC初步分离和NaOH溶液喷涂显色,对显红色、具有抗革兰阳性菌活性的条带进行了HPLC分析,提示抗革兰阳性菌活性化合物可能为大环二内酯类抗生素洋橄榄叶素;以dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶(Tgd)基因保守区设计PCR引物,扩增了吸水链霉菌17997基因组DNA中的tgd并进行了序列分析,表明吸水链霉菌17997含有洋橄榄叶素生物合成基因簇中的tgd基因;对NaOH溶液喷涂显红色的化合物进行LC-(+)-ESI-MS分析,证实其为洋橄榄叶素。因此,吸水链霉菌17997产生洋橄榄叶素;同时,建立了一种快速鉴定洋橄榄叶素及其产生菌的方法,主要包括TLC硅胶板分离、NaOH溶液显色、HPLC和LC-MS分析,以及tgd的PCR检测与序列分析。

关键词：吸水链霉菌17997 洋橄榄叶素液相色谱-质谱联用(LC-MS) dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶格尔德霉素

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吸水链霉菌17997产生氢醌型格尔德霉素及其生物合成中间产物

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中国抗生素杂志 2011年第11期36卷 833-838页

作者：贾长虹刘昕赫卫清林灵张侃王红远孙桂芝王以光武临专卫生部抗生素生物工程重点实验室中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050 东北农业大学哈尔滨150030 沈阳药科大学沈阳110016

目的了解格尔德霉素生物合成PKS后修饰过程中的一些细节。方法对格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997及其格尔德霉素生物合成聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）后修饰基因阻断变株（gdmP和gdmN）在ISPII平板不同时间的培养物进行乙酸... 详细信息

目的了解格尔德霉素生物合成PKS后修饰过程中的一些细节。方法对格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997及其格尔德霉素生物合成聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）后修饰基因阻断变株（gdmP和gdmN）在ISPII平板不同时间的培养物进行乙酸乙酯提取，硅胶板TLC和NaOH显色分析，检测GDM及其生物合成中间产物，并利用LC-MS对中间产物进行鉴定。结果吸水链霉菌17997原株、gdmN和gdmP-变株在培养时间72～96h，发现氢醌型格尔德霉素（GQH2）、氢醌型4，5-双氢-7-去氨甲酰基-7-羟基格尔德霉素（H，GQH2-dC）和氢醌型4，5-双氢格尔德霉素（H2GQH2）分别为主要组分，相应的醌型化合物为次要组分；之后，这些氢醌型化合物随培养时间延长逐渐消失，相应的醌型化合物成为主要组分。双向硅胶板TLC分析证实GQH2、H2GQH2-dC和IH2GQH2均可在空气中自发氧化为相应的醌型化合物。结论在吸水链霉菌17997的GDM生物合成PKS后修饰过程中，首次提出GQH2自发氧化为GDM可能是氢醌型向醌型转变的位点，同时它也是GDM生物合成最后一步。

关键词：格尔德霉素氢醌型格尔德霉素生物合成吸水链霉菌17997

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海洋微生物来源的天然产物开发研究进展

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应用与环境生物学报 2011年第2期17卷 287-294页

作者：陈菲菲王勇王以光赫卫清中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 中国医药集团四川抗菌素工业研究所成都610052 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所合成生物学重点实验室上海200032

综述了近年来海洋微生物来源天然产物研究的新进展,总结了该类天然产物的开发策略.通过对样品采用不同的预处理方式、不同的分离培养基以及新的培养方法,讨论如何获得海洋来源的特有微生物和增加海洋来源微生物类群的多样性.阐述了在海... 详细信息

综述了近年来海洋微生物来源天然产物研究的新进展,总结了该类天然产物的开发策略.通过对样品采用不同的预处理方式、不同的分离培养基以及新的培养方法,讨论如何获得海洋来源的特有微生物和增加海洋来源微生物类群的多样性.阐述了在海洋微生物天然产物的开发过程中,采用宏基因组技术及基因组测序等手段,来发现难培养或不可培养微生物中的天然产物以及处于"沉默"状态的天然产物.最后介绍了异源生物合成、组合生物合成以及核糖体工程等技术在海洋微生物天然产物开发和改造中的应用,并举例论述了海洋微生物天然产物的开发.

关键词：海洋微生物宏基因组筛选基因组测序异源生物合成组合生物合成

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土壤宏基因组文库的构建及格尔德霉素类PKS基因的初步筛选

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中国抗生素杂志 2011年第6期36卷 426-430页

作者：林灵陈菲菲王以光赫卫清王相晶东北农业大学哈尔滨150030 中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 中国医药集团总公司四川抗菌素工业研究所成都610052

目的构建土壤宏基因组文库并对格尔德霉素类I型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因进行初步筛选研究。方法直接提取土壤样品中宏基因组DNA,以Fosmid为载体,构建宏基因组文库。根据格尔德霉素的I型PKS基因的保守序列设计引物,使用菌... 详细信息

目的构建土壤宏基因组文库并对格尔德霉素类I型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)基因进行初步筛选研究。方法直接提取土壤样品中宏基因组DNA,以Fosmid为载体,构建宏基因组文库。根据格尔德霉素的I型PKS基因的保守序列设计引物,使用菌落PCR方法直接筛选所获得的宏基因组文库。结果成功构建了土壤宏基因组文库,获得约6800个克隆子,其平均插入片段在25kb以上,覆盖至少170Mb的基因组信息。通过PKS基因筛选,获得了新的PKS基因片段。结论本文报道了土壤宏基因组文库的成功构建,并为利用宏基因组技术寻找新的聚酮类次级代谢产物的生物合成基因,以便于其异源表达或组合生物合成新的聚酮类次级代谢产物奠定基础。

关键词：宏基因组文库 PKS 土壤

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大连渤海老虎滩海域沉积物可培养放线菌的多样性

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微生物学报 2011年第2期51卷 262-269页

作者：林灵谭亿陈菲菲周红霞王以光赫卫清王勇中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 东北农业大学生命科学学院哈尔滨150030 中国医药集团四川抗菌素工业研究所生物部成都610052 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所合成生物学重点实验室上海200032

【目的】研究大连渤海老虎滩海域可培养放线菌的多样性。【方法】利用5种不同的培养基分离、培养海洋沉积物中的放线菌,并用16S rRNA基因序列对部分放线菌株进行系统发育分析。【结果】根据菌落表型共分离到1215株放线菌。选择271株具... 详细信息

【目的】研究大连渤海老虎滩海域可培养放线菌的多样性。【方法】利用5种不同的培养基分离、培养海洋沉积物中的放线菌,并用16S rRNA基因序列对部分放线菌株进行系统发育分析。【结果】根据菌落表型共分离到1215株放线菌。选择271株具有代表性的菌株进行16S rRNA分析,结果表明,251株(92.26%)属于放线菌门,覆盖11个科,15个属;其余20株属于厚壁门和变形菌门;有7株为潜在的新种。【结论】大连渤海老虎滩海域的沉积物中存在较为丰富的放线菌和新种资源,这些菌株为将来开发新的微生物代谢产物奠定了基础。

关键词：大连渤海可培养放线菌系统发育多样性

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雷帕霉素聚乳酸-聚乙醇酸共聚物纳米粒子对人脐动脉平滑肌细胞细胞周期时相、p27蛋白表达及细胞增殖的影响

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中国医学科学院学报 2010年第1期32卷 32-38,139页

作者：苗立夫黄超联陈连凤朱文玲杨菁王以光张华刘佩毛佘铭鹏宋存先清华大学第一附属医院心脏中心北京100016 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院心脏内科北京100730 中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所天津市生物材料重点实验室天津300192 中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所病理室北京100005

目的评估本实验室自制包载雷帕霉素(RPM)的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒子(NPs)对离体培养的人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)细胞周期时相、p27蛋白表达和细胞增殖的影响。方法按不同浓度RPM-PLGA NPs设定药物作用组,并设立RPM组、PLG... 详细信息

目的评估本实验室自制包载雷帕霉素(RPM)的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)纳米粒子(NPs)对离体培养的人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)细胞周期时相、p27蛋白表达和细胞增殖的影响。方法按不同浓度RPM-PLGA NPs设定药物作用组,并设立RPM组、PLGA组和M231培养基及平滑肌细胞生长添加剂(M231-SMGs)组作为对照。采用细胞免疫组织化学染色比较不同处理组HUASMC p27蛋白表达阳性率和表达水平的差异,流式细胞技术评价各处理组对HUASMC细胞周期时相的影响,噻唑蓝(MTT)比色法观察不同浓度RPM和RPM-PLGA NPs对HUASMC存活率的影响。结果10μg/L及以上浓度的RPM和50μg/L及以上浓度的RPM-PLGA NPs可明显抑制HUA-smc生长,并呈浓度依赖性。细胞计数绘制生长-时间曲线显示,100μg/L RPM和500μg/L RPM-PLGA NPs作用于HUASMC 24 h后细胞计数值明显低于M231-SMGs对照组;单纯PLGA NPs对细胞生长无明显影响;与PLGA组和M231-SMGs培养基对照组相比,RPM组和RPM-PLGA NPs组G_0/G_1期细胞比例明显增多,S期及G_2/M期细胞比例明显减少(P均<0.01),但两组间细胞周期时相比例差异无统计学意义(P>0.05)。细胞免疫组织化学染色结果显示,100μg/LRPM和500μg/L RPM-PLGA NPs组的HUASMC p27蛋白表达阳性率和表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),但均较PLGA组和M231-SMGs培养基组明显增加(P<0.01)。结论RPM-PLGA NPs抑制体外培养的HUASMC生长效果与RPM相似,并可显著抑制体外培养HUASMC p27蛋白表达,阻抑其细胞周期进程于G_1/S期而抑制其细胞增殖。

关键词：雷帕霉素聚乳酸-聚乙醇酸共聚物纳米粒子人脐动脉平滑肌细胞细胞周期细胞增殖 p27蛋白

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利用强启动子PermE^＊提高4＂-异戊酰基转移酶基因在变铅青链霉菌TK24中对螺旋霉素的4＂-异戊酰化水平

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中国抗生素杂志 2010年第11期35卷 826-830页

作者：杨永红赫卫清李瑞芬戴剑漉杨劭王以光武临专华中师范大学生命科学学院武汉430079 中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 同联药业沈阳抗生素厂沈阳110112

目的提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导。方法构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红... 详细信息

目的提高螺旋霉素生物转化为4"-异戊酰螺旋霉素的水平,为构建以4"-异戊酰螺旋霉素为主要组分的必特螺旋霉素新一代基因工程菌提供指导。方法构建重组质粒pKC1139-e-ist-ist和pKC1139-ist-ist,它们分别含有5'-上游插入红霉素抗性基因强启动子PermE*的4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝,和4"-异戊酰基转移酶基因串连双拷贝;将它们分别导入到变铅青链霉菌TK24中,比较它们对螺旋霉素的4"-异戊酰化能力。结果在加入终浓度为50μg/mL螺旋霉素时,变铅青链霉菌TK24[pKC1139-e-ist-ist]比变铅青链霉菌TK24[pKC1139-ist-ist]对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平提高近4倍。结论在变铅青链霉菌TK24中,PermE*可以增强4"-异戊酰基转移酶基因表达,明显提高对螺旋霉素的4"-异戊酰化水平。

关键词：螺旋霉素 4"-异戊酰基转移酶基因变铅青链霉菌TK24 PermE＊生物转化必特螺旋霉素

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响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基

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沈阳药科大学学报 2010年第6期27卷 482-488页

作者：戴剑漉李瑞芬王以光武临专赫卫清中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 沈阳同联制药集团辽宁沈阳110122

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组... 详细信息

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。

关键词：必特螺旋霉素响应面法培养基优化

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新一代必特螺旋霉素基因工程菌的微波诱变

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中国抗生素杂志 2009年第7期34卷 406-410,428页

作者：戴剑漉李瑞芬武临专王以光中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 沈阳同联制药集团沈阳110122

本文探讨微波诱变对新一代必特螺旋霉素基因工程菌的育种效果。以经紫外诱变筛选的新一代必特螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticusNBT-U149为出发菌株进行微波诱变筛选。辐射分四种方式:培养皿加盖冷却;加盖不冷却;不加盖冷却;... 详细信息

本文探讨微波诱变对新一代必特螺旋霉素基因工程菌的育种效果。以经紫外诱变筛选的新一代必特螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticusNBT-U149为出发菌株进行微波诱变筛选。辐射分四种方式:培养皿加盖冷却;加盖不冷却;不加盖冷却;不加盖不冷却,辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、80、100和120 s。每次辐射5 s后,冰上快速冷却20 s再照射,并将照射时间累计。以不同的辐射时间设定为不同的微波处理剂量,计算致死率。结果表明,必特菌株对微波敏感,微波辐射60 s时致死率达到92.55%。微波诱变在以脉冲频率为2450MHz的800W家用微波炉条件下,其最佳作用方式为培养皿不加盖、冰上快速冷却,最佳辐射时间为50 s。初筛摇瓶正突变率达到57.14%,复筛摇瓶发酵效价是出发菌株1.6倍以上的有10株,占初筛菌株的2%。最终筛选得到突变株Streptomyces spiramyceticusNBT-UM22,其必特螺旋霉素发酵产量是出发菌株的1.87倍,且组分比例无明显变化。

关键词：必特螺旋霉素微波诱变育种

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高效液相色谱-串联质谱分析微量格尔德霉素类似物

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生物工程学报 2009年第6期25卷 847-853页

作者：倪四阳张侃王玉成赫卫清王以光贺玖明武临专中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050 沈阳药科大学制药工程学院沈阳110016 中国医学科学院/北京协和医学院药物研究所北京100050

安莎类抗生素例如利福霉素和安丝菌素,通常由一组化学结构相似的组分组成。格尔德霉素为苯安莎类抗生素,已经发现4个组分。本研究采用高效液相色谱-串联质谱方法对格尔德霉素(GDM)制品中的微量组分进行了分析,发现5个新的和1个已知的GD... 详细信息

安莎类抗生素例如利福霉素和安丝菌素,通常由一组化学结构相似的组分组成。格尔德霉素为苯安莎类抗生素,已经发现4个组分。本研究采用高效液相色谱-串联质谱方法对格尔德霉素(GDM)制品中的微量组分进行了分析,发现5个新的和1个已知的GDM类似物。依据质谱数据、结合GDM生物合成机制,对6个GDM类似物的化学结构进行了推测:分子式为C29H42N2O10的新化合物3个,分别为GDM安莎链上C2-C3、C4-C5和C8-C9之间的C-C双键变为单键并同时单羟基化的GDM衍生物;分子式为C28H38N2O8的新化合物2个,其中1个为17(或12,或4)-去甲氧基格尔德霉素,另1个为4,5-双氢-10,11-脱水-17-去甲基-17-羟基格尔德霉素;分子式为C29H42N2O9的已知化合物1个,为4,5-双氢格尔德霉素。这些GDM类似物的发现有助于加深对GDM生物合成的认识,并对通过基因阻断、组合生物合成技术获得GDM衍生物的研究有启示作用。

关键词：高效液相色谱-串联质谱格尔德霉素格尔德霉素类似物生物合成

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