检索结果-内蒙古大学图书馆

中国医科大学学报 2012年第1期41卷 24-27页

作者：刘彩红王利利冯艳玲朱亚勤中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室沈阳110001

目的构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过S... 详细信息

目的构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将hβ-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X-1-β-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST/β-arrestin1A、B,SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力。结果酶切及测序结果证明,成功构建了β-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实:经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/β-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组β-arrestin1A、B蛋白亚型的结合能力。结论成功构建pGEX-5X-1-β-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示β-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究β-arrestin1的生物学功能奠定了基础。

关键词： hβ—arrestin1 克隆重组亚型表达蛋白互作

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高GC hTwist融合蛋白载体构建及其表达条件优化

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中国医科大学学报 2012年第3期41卷 204-207页

作者：王利利刘彩红朱亚勤教育部医学细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室沈阳110001

目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计... 详细信息

目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化*** DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础。

关键词：高GC hTwist 克隆融合蛋白原核表达

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抗人大肠癌双价单链抗体基因的构建及表达

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世界华人消化杂志 2006年第24期14卷 2395-2400页

作者：严丹丹杨福辉方瑾中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁省沈阳市110001

目的:构建抗人大肠癌重组双价单链抗体ND- 1sc(Fv)2的融合基因,并在大肠杆菌中表达．方法:采用基因重组技术借助GGGGS Linker序列,将2个相同的ND-1scFv基因共价连接,构建pET-28a(+)ND-1sc(Fv)2表达载体,并在大肠杆菌中表达双价单链抗体... 详细信息

目的:构建抗人大肠癌重组双价单链抗体ND- 1sc(Fv)2的融合基因,并在大肠杆菌中表达．方法:采用基因重组技术借助GGGGS Linker序列,将2个相同的ND-1scFv基因共价连接,构建pET-28a(+)ND-1sc(Fv)2表达载体,并在大肠杆菌中表达双价单链抗体的融合蛋白．表达产物用Ni-NTA resin亲和层析方法纯化,SDS- PAGE和Western blotting检测表达的目的蛋白．间接免疫荧光和ELISA检测抗体的免疫活性．结果:序列测定表明:ND-1sc(Fv)2基因全长1473 bp,包含了2个729 bp的scFv序列和15 bp的GGGGS序列．SDS-PAGE和Western blotting检测显示,融合蛋白的Mr55 000,与预期值一致．ND-1sc(Fv)2表达产物以不溶性包涵体形式存在,经亲和层析纯化后蛋白纯度达90％,间接免疫荧光及ELISA检测表明,ND-1sc(Fv)2保留了亲本抗体的免疫活性,对表达有相应抗原的靶细胞具有特异结合活性,其免疫活性明显高于ND-1scFv．结论:成功地构建了抗人大肠癌双价单链抗体ND-1sc(Fv)2,并在大肠杆菌中高效表达．融合蛋白具有良好的免疫活性．

关键词：双价单链抗体 ND-1 大肠癌免疫活性

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野生型和失活型PAK1基因自我抑制域的GST标签真核表达载体的构建及表达

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吉林大学学报（医学版） 2014年第1期40卷 27-30页

作者：刘彤李丹妮李洋李丰中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001 中国医科大学

目的:构建不同活性的人p21活化激酶1(hPAK1)自我抑制域(AID)谷胱甘肽(GST)标签真核表达载体并鉴定其融合蛋白表达,以探讨PAK1AID的功能及肿瘤治疗的靶向意义。方法:以pcDNA3.1HisC-PAK1全长质粒为模板,利用PCR扩增野生型(WT)PAK1AID片段... 详细信息

目的:构建不同活性的人p21活化激酶1(hPAK1)自我抑制域(AID)谷胱甘肽(GST)标签真核表达载体并鉴定其融合蛋白表达,以探讨PAK1AID的功能及肿瘤治疗的靶向意义。方法:以pcDNA3.1HisC-PAK1全长质粒为模板,利用PCR扩增野生型(WT)PAK1AID片段,再以此片段为模板采用大引物法扩增其突变体L107F片段,双酶切克隆至GST融合的真核表达载体pEBG。将质粒转染至工具细胞HEK293中,并经免疫印迹鉴定GST融合蛋白的表达。结果:PCR扩增出约200bp大小的野生型和失活型PAK1AID片段,双酶切得到与预期大小相符的载体与PAK1AID片段,野生型与失活型pEBG-PAK1在工具细胞HEK293中表达,蛋白的相对分子质量均为33 000。结论:成功构建野生型和失活型PAK1基因AID的GST标签真核表达载体,并表达出不同活性的GST-PAK1AID的融合蛋白。

关键词： p21活化激酶1 自我抑制域失活型(L107F) 真核表达 GST标签

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GST／RIPX融合蛋白表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

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中国医科大学学报 2010年第12期39卷 987-988,994页

作者：王孝会王桂玲中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳110001

目的构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化*** DH5α,筛选阳性重组子,限制性... 详细信息

目的构建GST/RIPX融合蛋白基因表达载体,并在大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-RIPX为模板,通过BamH1和Xho1酶切位点将RIPX定向插入pGEX-4T-2中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并转化*** DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入化*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,鉴定。结果酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-4T-2-RIPX,并用SDS-PAGE方法证实了GST/RIPX融合蛋白的表达。结论成功构建了RIPX原核表达载体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化RIPX蛋白和研究RIPX的生物学功能奠定了基础。

关键词：质粒原核表达融合蛋白 RIPX

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C／EBPα不同截短功能域GST融合蛋白表达载体的构建及表达的研究

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中国医科大学学报 2011年第6期40卷 484-486页

作者：王桂玲陈薇姜佩佳王孝会中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳110001

目的构建GST-C/EBPα融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-C/EBPα为模板,用PCR法扩增C/EBPα全长及各个截短片段,通过EcoRI和XhoI酶切位点将C/EBPα全长及各个截短突变体定向插入pGEX-5X-1中,构建原... 详细信息

目的构建GST-C/EBPα融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法以质粒pcDNA3.1-C/EBPα为模板,用PCR法扩增C/EBPα全长及各个截短片段,通过EcoRI和XhoI酶切位点将C/EBPα全长及各个截短突变体定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并转化*** DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和SDS-PAGE鉴定。结果酶切及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-1-C/EBPα及其截短突变体,并用SDS-PAGE方法证实了GST-C/EBPα全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了C/EBPα原核表达载体及其截短突变体,并证实了融合蛋白的表达,为进一步纯化C/EBPα蛋白和研究C/EBPα的生物学功能奠定了基础。

关键词： CCAAT增强子结合蛋白α 截短突变体质粒原核表达

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针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体的构建及功能鉴定

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中国医科大学学报 2016年第11期45卷 968-972,976页

作者：蔡莹刘柳连博文陈澄中国医科大学基础医学院发育细胞生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室沈阳110122

目的设计构建针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体,以用于制备相关转基因小鼠,并在体外验证其有效性。方法剔除pc DNA3.1载体的CMV启动子以及多克隆位点,然后接入带有LacZ-fLoxP插入失活的小鼠U6启动子并引入适当的酶切位点... 详细信息

目的设计构建针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体,以用于制备相关转基因小鼠,并在体外验证其有效性。方法剔除pc DNA3.1载体的CMV启动子以及多克隆位点,然后接入带有LacZ-fLoxP插入失活的小鼠U6启动子并引入适当的酶切位点,装入设计好的shRNA片段,测试shRNA抑制Chmp1b表达的效率与专一性,检查Cre重组酶介导位点特异性重组去除LoxP位点之间的lac基因后U6启动子活性恢复情况。结果设计的shRNA片段可明显降低Chmp1b的表达,抑制效率达90%以上;成功构建针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体,插入U6启动子中的LacZ-fLoxP片段既可以控制U6启动子活性又可以起到报告基因的作用。结论针对小鼠Chmp1b基因的可诱导shRNA表达转基因载体可以用于制备相关转基因小鼠。

关键词： shRNA Chmp1b Cre/LoxP 转基因载体构建

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不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体的构建及重组蛋白的表达

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中国医科大学学报 2011年第12期40卷 1057-1059,1071页

作者：刘彤李洋朱戈李丰中国医科大学基础医学院细胞生物教研室教育部医学细胞生物学重点实验室沈阳110001

目的构建不同激酶活性的hPAK6原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达。方法野生型、激酶活型和激酶死型pcDNA3.1-PAK6经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,在*** BL21中诱导不同型GST-hPAK6融合蛋白表达,并经免... 详细信息

目的构建不同激酶活性的hPAK6原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达。方法野生型、激酶活型和激酶死型pcDNA3.1-PAK6经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,在*** BL21中诱导不同型GST-hPAK6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果。结果野生型、激酶活型和激酶死型hPAK6编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,双酶切及测序鉴定正确,并在*** BL21中获得了诱导表达,蛋白的分子量均为101 kDa,免疫印迹检测到了融合蛋白表达。结论成功构建不同激酶活性的hPAK6基因原核表达载体,并分别诱导表达出GST-PAK6融合蛋白。

关键词： PAK6基因激酶活型激酶死型原核表达融合蛋白

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人源MAP3K7克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

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中国医科大学学报 2011年第8期40卷 688-690页

作者：冯艳玲刘彩红朱亚勤中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室沈阳110001

目的构建MAP3K7蛋白GST的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7融合蛋白,为GST Pulldown实验做准备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序... 详细信息

目的构建MAP3K7蛋白GST的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7融合蛋白,为GST Pulldown实验做准备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序鉴定后,导入*** BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,诱导后的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论成功构建了MAP3K7全长的GST重组表达载体,确定了GST-MAP3K7融合蛋白表达的最佳条件,诱导成功并得到了高纯度的融合蛋白,为进一步研究MAP3K7蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：人MAP3K7基因基因克隆融合蛋白原核表达

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人pEGFP-PKARIIβ重组质粒的构建及其在BGC-823胃癌细胞中的表达

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世界华人消化杂志 2011年第14期19卷 1446-1450页

作者：王桂玲姜佩佳王孝会陈薇中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁省沈阳市110001

目的:研究人的蛋白激酶A调节亚基RIIβ(PKARIIβ)基因的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体融合蛋白在胃癌细胞BGC-823内的表达和定位,初步探讨其在肿瘤细胞中的分子作用机制.方法:以pRSETB-PKARIIβ质粒为模板,PCR扩增出全长PKARIIβ编码序... 详细信息

目的:研究人的蛋白激酶A调节亚基RIIβ(PKARIIβ)基因的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体融合蛋白在胃癌细胞BGC-823内的表达和定位,初步探讨其在肿瘤细胞中的分子作用机制.方法:以pRSETB-PKARIIβ质粒为模板,PCR扩增出全长PKARIIβ编码序列,用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后,亚克隆至含有GFP标签的融合表达载体pEGFP-C1中.测序正确后,将重组质粒转染到胃癌细胞BGC-823中,提取细胞蛋白进行Westernbolt检测.利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-PKARIIβ在人胃癌细胞BGC-823内的定位.结果:将人全长PKARIIβ编码序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1.2kb,在预期的位置产生条带.Western blot检测到了融合蛋白正确表达,分子量约为72000Da.并观察到GFP-PKARIIβ在HEK293和BGC-823细胞内都有表达,且定位以细胞质为主,在细胞核内少量表达.结论:成功构建了人全长PKARIIβ编码序列的pEGFP-PKARIIβ真核表达载体,证实GFP-PKARIIβ蛋白在BGC-823细胞质内特异表达,为进一步研究PKARIIβ的在胃癌中的功能提供了重要的实验材料.

关键词： PKARIIβ 真核表达绿色荧光蛋白基因转染胃癌细胞

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