检索结果-内蒙古大学图书馆

十足目虹彩病毒(DIV1)环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用

渔业科学进展 2020年第6期41卷 156-164页

作者：邹莹郭晓萌万晓媛邱亮张庆利中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室青岛266071 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

本研究以十足目虹彩病毒(Decapod iridescent virus 1,DIV1)主要衣壳蛋白基因为靶序列设计引物,建立了DIV1的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并以pMD18-DIV1质粒标准品为模板对该方法的检测灵敏度、检测特异性等进行了评估。结果显示,此方法最适反应温度为64.4℃,优化后的25μl反应体系中包含2.5μl 10×Isothermal amplification buffer、4.0 mmol/L Mg^2+、1.2 mmol/L dNTPs、6.4 U Bst 2.0 WarmStart■DNA聚合酶、0.8μmol/L EvaGreen■和4.4μl ddH2O。该方法检测灵敏度下限为3.54×10^2拷贝/反应;与虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、对虾偷死野田村病毒(CMNV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)和黄头病毒(YHV)等主要虾类病原没有交叉反应;具有较好的重复性和稳定性。以GeneFinder■替换EvaGreen■并将其预置于反应管内,结合上述扩增方法可实现对DIV1的现场快速高灵敏检测。本研究建立的DIV1-LAMP实时荧光定量和现场检测方法具有灵敏、特异和快速等特点,为近几年新发虾类病原DIV1的定性、定量以及现场快速检测提供了新的技术选择,有利于对虾养殖业中开展DIV1的监测、预警和防控。

关键词：十足目虹彩病毒(DIV1) 虾血细胞虹彩病毒(SHIV) 环介导等温扩增(LAMP) 检测方法

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一种复合益生菌对凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力的影响

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渔业科学进展 2020年第3期41卷 133-141页

作者：杨运楷宋晓玲王海亮谢国驷黄倢上海海洋大学上海201306 中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室青岛266071

本研究选择1株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BL-9、1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS-12、1株金丽假交替单胞菌(Pseudoalteromonas flavipulchra)CDM8,以1∶1∶1将其组成复合益生菌,各益生菌水体添加浓度为107 CFU/ml,进行为期30 d的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖实验。实验分为暂养期(7d)、益生菌处理期(15d)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)攻毒期(10 d)。结果显示,养殖水体中添加复合益生菌能显著增加水体和对虾肠道可培养细菌总数(P<0.05),攻毒实验结束时,实验组对虾累积存活率为(73.33±6.83)%,显著高于阳性对照组(25.33±15.43)%。对虾抗病基因热激蛋白70(Heat shock proteins 70,Hsp70)、β-1,3-葡聚糖结合蛋白-脂蛋白(Beta-1,3-glucan-binding protein-lipoprotein,βGBP-HDL)、脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharide-β-1,3-glucan binding protein,LGBP)、抗菌肽Crustin在益生菌处理阶段均出现不同程度的上调,在攻毒阶段虽呈现各自不同的表达情况,但所有基因都经历了更大幅度上调。研究表明,水体中添加芽孢杆菌和假交替单胞菌组成的复合益生菌可提高凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力,对虾抗病力的提高可能与益生菌增加对虾肠道可培养细菌数量、抗病相关基因表达水平及过氧化氢酶(CAT)活性有关。

关键词：凡纳滨对虾复合益生菌副溶血弧菌免疫基因过氧化氢酶

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2017年中国部分地区白斑综合征病毒3个基因的变异分析

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水产科学 2020年第4期39卷 560-566页

作者：刘晓娉蔡苗刘庆慧万晓媛黄倢中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室山东青岛266071 上海海洋大学上海201306

白斑综合征病毒广泛分布于中国、东南亚、南亚、南美洲、北美洲的许多国家,并且具有较高的致病性。为探明中国不同地区白斑综合征病毒毒株的变异情况,本研究选取2017年2—6月在河北、浙江、山东、上海、福建和广东共6个省市的白斑综合... 详细信息

白斑综合征病毒广泛分布于中国、东南亚、南亚、南美洲、北美洲的许多国家,并且具有较高的致病性。为探明中国不同地区白斑综合征病毒毒株的变异情况,本研究选取2017年2—6月在河北、浙江、山东、上海、福建和广东共6个省市的白斑综合征病毒病害暴发区的44份患病样本,提取其DNA,进行wsv-pol、wsv313、wsv150的PCR扩增,筛选阳性克隆并进行测序分析。分析结果显示,在2017年wsv-pol的12个阳性样本中,均在第164位出现单个甘氨酸缺失,在个别样品中也存在氨基酸的替换现象;在wsv313的PCR扩增中有9个阳性样本在第280位插入1个脯氨酸,2个样本在第64位天冬氨酸突变为甘氨酸;wsv150的阳性样本均在第587位插入碱基T。氨基酸比对结果显示,8个样本在第200位之后出现106个大片段氨基酸的缺失,同时在第196、197、198、199位发生氨基酸的替换。氨基酸比对结果表明,wsv-pol、wsv313均未出现较大程度的变异,而wsv150的氨基酸序列出现了较大程度的变异,但未表现出地区差异性。本研究将为白斑综合征病毒病原学的研究提供依据。

关键词：白斑综合征病毒 wsv-pol wsv313 wsv150 序列分析

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饲料添加益生菌对多病原阳性的凡纳滨对虾生长与存活的影响

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渔业科学进展 2020年第2期41卷 121-130页

作者：练小军朱开玲张庆起万晓媛谢国驷郭程程黄倢中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室青岛266071 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 连云港市启明水产有限公司连云港222100

采用假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)KL-32010和微小杆菌(Exiguobacterium sp.)KL-C22014作为益生菌,进行凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)投喂实验,研究上述菌株对带毒对虾的生长与存活的影响。假交替单胞菌KL-32010对致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)(VPAHPND 20130629002S01)有拮抗作用和胞外蛋白酶活性,微小杆菌KL-C22014有胞外蛋白酶活性。待试对虾经检测为白斑综合征病毒(WSSV)、致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VPAHPND)和虾肝肠胞虫(EHP)弱阳性。经过为期60 d的养殖实验,结果显示,与投喂普通颗粒饲料的对照组相比,投喂假交替单胞菌KL-32010的对虾存活率提高了213%±43%(P<0.01);投喂微小杆菌KL-C22014的对虾平均生长率提高了105.5%±28.1%(P<0.05);交替投喂2株菌的对虾存活率提高了184%±52%(P<0.05),平均生长率提高了70.6%±32.8%。肠道可培养优势菌研究表明,2株益生菌的投喂显著影响了对虾肠道优势菌群的种类。本研究为带毒虾苗的养殖提供一种有效的病害防控和促生长的手段。

关键词：凡纳滨对虾益生菌生长存活多病原带毒

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环境条件对1株假交替单胞菌脱氮效果的影响

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渔业科学进展 2020年第4期41卷 144-150页

作者：于党辉王秀华张宇哲武和英张琴上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室青岛266071 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛266071 广西壮族自治区海洋研究所广西海洋生物技术重点实验室北海536000

从对虾养殖池中分离得到1株具有高效脱氨氮能力的菌株(2906),根据菌株2906的16S r RNA序列分析,该菌与假交替单胞菌属Pseudoalteromonas tetraodonis的亲缘关系最近,命名为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)2906。利用不同C/N、pH、... 详细信息

从对虾养殖池中分离得到1株具有高效脱氨氮能力的菌株(2906),根据菌株2906的16S r RNA序列分析,该菌与假交替单胞菌属Pseudoalteromonas tetraodonis的亲缘关系最近,命名为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)2906。利用不同C/N、pH、盐度的脱氮培养基,分析了环境条件对该菌株脱氮效率的影响,研究了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、丁二酸钠、柠檬酸钠、乳糖和可溶性淀粉等不同碳源对菌株2906脱氮效果的影响。结果显示,菌株2906在C/N为15~20、p H为7~8、盐度为5~15时,具有良好的脱氨氮效果。应用柠檬酸钠为碳源,氨氮去除率达100%。在脱氮培养过程中,细菌生长与脱氮效率呈强相关性(相关系数R=0.94)。采用浸泡攻毒方法测试了该菌对幼虾的生物安全性,结果显示,该菌对幼虾的LC50为2.8×10^7 CFU/ml,表明该菌对对虾不具致病力。研究结果可为该菌的开发利用提供技术支持。

关键词：假交替单胞菌 C/N 盐度 pH 碳源氨氮脱氮效率

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罗非鱼循环水养殖系统中一株肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及其脱氮性能研究

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淡水渔业 2020年第3期50卷 72-78页

作者：王秀华武和英杨冰张琴于党辉黄倢中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室山东青岛266071 广西壮族自治区海洋研究所广西海洋生物技术重点实验室广西北海536000

实验从山东德州市一罗非鱼(Oreochromis niloticus)养殖场循环水养殖系统的脱氮池中分离到一株具有高效脱氮特性的菌株(编号DZYC02),分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、丁二酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠为碳源,研究了碳源种类对菌株DZYC02脱... 详细信息

实验从山东德州市一罗非鱼(Oreochromis niloticus)养殖场循环水养殖系统的脱氮池中分离到一株具有高效脱氮特性的菌株(编号DZYC02),分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、丁二酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠为碳源,研究了碳源种类对菌株DZYC02脱氨氮效果的影响;同时以蔗糖为碳源、NH4Cl为氮源,研究了不同碳氮比、初始pH及盐度对该菌株脱氮效果的影响。结果显示:菌株DZYC02在以柠檬酸钠为碳源、C∶N≥15、pH 5~7、盐度0~15的条件下具有良好的脱氮效果,24 h内对浓度为20 mg/L的NH+4的去除率达100%,48 h内对浓度为20 mg/L的NO-2去除率高达100%;将该菌采用浸泡方式感染斑马鱼(Danio rerio)进行生物安全试验,结果显示菌株DZYC02对斑马鱼表现出较好的安全特性。分别用Biolog细菌鉴定方法和16S rDNA序列分析比对法对该菌进行鉴定,结果显示菌株DZYC02为一株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)。

关键词：罗非鱼(Oreochromis niloticus) 循环水养殖系统克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) 脱氮菌脱氮效果

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牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)间接原位杂交PCR检测方法的建立与初步应用

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水产学报 2019年第3期43卷 679-687页

作者：李亚楠白昌明刘金兰辛鲁生李晨刘莉黄博闻魏智薪王崇明天津农学院水产学院天津市水产生态及养殖重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室

为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适... 详细信息

为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物,在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交,最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果,对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示,最适PCR扩增循环数为20,蛋白酶K浓度为20μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法,对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点,通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号,能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型;适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。

关键词：魁蚶牡蛎疱疹病毒间接原位杂交PCR 检测方法

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病例研究：未知病因的凡纳滨对虾溞状幼体的病原和微生物组分析

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渔业科学进展 2019年第5期40卷 134-144页

作者：孙静万晓媛杨倩谢国驷董宣黄倢中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室

从某对虾育苗场2个育苗池中分别采集了发生摄食下降、活力降低及死亡率增高等症状的未知疾病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溞状幼体3期(Z3)和1期(Z1)的样品。用PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHH... 详细信息

从某对虾育苗场2个育苗池中分别采集了发生摄食下降、活力降低及死亡率增高等症状的未知疾病的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)溞状幼体3期(Z3)和1期(Z1)的样品。用PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病病毒(IHHNV)、急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)、桃拉综合征病毒(TSV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)、黄头病毒(YHV)、虾肝肠胞虫(EHP)、偷死野田村病毒(CMNV)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)等9种已知病原为阴性。组织病理学诊断观察到肝胰腺小管上皮细胞内存在不明褐色团块。使用2216E培养基对致病菌分离鉴定,得到2株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),浸浴感染悉生卤虫(Artemia franciscana)幼体后的平均存活率分别为58%和83%。采用Illumina HiSeq高通量测序方法对这2个溞状幼体样品中细菌16S rRNA基因的2个高变区(V3~V4)进行总细菌菌群的测序,分析揭示了未知病因病虾中细菌菌群的多样性和相对丰度,门水平上2个样品的优势菌群均包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes),但相对丰度有显著差异;在属水平上相对丰度最高的均为弧菌属(Vibrio),在2个样品中的丰度分别为74.3%和60.5%,此外,Z1样品相对高丰度(21.9%)的属为黏着杆菌属(Tenacibaculum)。育苗管理信息及上述病例分析结果提示,该疾病可能是由于在过期存放的幼体饲料质量下降所致的营养障碍情况下,有一定致病性的溶藻弧菌条件性感染所引起的疾病。

关键词：病例研究凡纳滨对虾溞状幼体未知病因菌群多样性

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真鲷虹彩病毒自然感染杂交石斑鱼“褐龙斑”的组织病理分析

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渔业科学进展 2019年第3期40卷 103-112页

作者：刘冉阳史成银谢国驷李晨王海波中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室青岛266071 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

褐龙斑是雌性褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和雄性鞍带石斑鱼(***)杂交产生的子代。作为杂交石斑鱼的新品种,国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年7月,某养殖场褐龙斑出现急性死亡,10d内累积死亡率高达80%。现场调查发现,病鱼外观无... 详细信息

褐龙斑是雌性褐石斑鱼(Epinephelus bruneus)和雄性鞍带石斑鱼(***)杂交产生的子代。作为杂交石斑鱼的新品种,国内外尚没有褐龙斑疾病的报道。2017年7月,某养殖场褐龙斑出现急性死亡,10d内累积死亡率高达80%。现场调查发现,病鱼外观无明显异常,但反应迟钝,伏底死亡。临床检查和剖检可见脾和肾严重肿大、易碎。组织病理切片观察发现,各组织中存在数量不等的嗜碱性、细胞质均一、直径为10~15 m的肿大细胞。超薄组织切片中发现,肿大细胞胞质内存在大量直径为130~150nm的虹彩病毒样颗粒。使用特异性的PCR引物,从病鱼脾、头肾等组织中均检测到真鲷虹彩病毒(Red seabream iridovirus,RSIV)的高强度感染。测定了该病毒主要衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因1362bp的全长编码区,构建了19种(株)虹彩病毒系统发育树,结果显示,该病毒属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属RSIV类群。本研究首次描述了褐龙斑虹彩病毒病的组织病理特征,揭示了褐龙斑是RSIV新的敏感宿主,为杂交石斑鱼病毒病的诊断与防治提供了重要的参考依据。

关键词：褐龙斑褐石斑鱼鞍带石斑鱼真鲷虹彩病毒组织病理

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用于水生病原菌的3种高通量活菌计数方法的比较

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渔业科学进展 2019年第3期40卷 133-140页

作者：邹培卓杨倩董宣谢国驷黄倢上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室青岛266071

以一株副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)作为研究对象,比较了MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法在活细菌高通量计数上的应用效果。用96孔培养板进行不同浓度细菌活菌计数,确... 详细信息

以一株副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)作为研究对象,比较了MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐]比色法、ATP生物发光法和高通量生长曲线法在活细菌高通量计数上的应用效果。用96孔培养板进行不同浓度细菌活菌计数,确定了上述3种方法在副溶血弧菌活菌计数的标准曲线和线性范围。结果显示,副溶血弧菌的MTT比色法以DMSO溶解的MTT产物甲瓒在555 nm的吸光度(OD555 nm)为计数依据,活菌数的对数(Lg C)与Lg OD555 nm线性关系的标准曲线为Lg C=(1.0439±0.0200)LgOD555 nm+(8.0565±0.0125),相关系数R2=0.9965,线性检测范围为7.8×106~2.5×108CFU/ml;ATP生物发光法以ATP产生的相对发光度值(RLU)为计数依据,Lg C与LgRUL线性关系的标准曲线为Lg C=(0.9590±0.0065)LgRLU+(0.9949±0.0366),相关系数R2=0.9994,线性检测范围为1.0×104~3.0×108 CFU/ml;高通量生长曲线法以生长曲线达到拐点的时间(Ts)为计数依据,Lg C与Ts线性关系的标准曲线为Lg C=-(0.8727±0.0230)Ts+(9.0128±0.1572),相关系数R2=0.9924,线性检测范围为1.0×100~1.0×107 CFU/ml。用3种方法对实际菌液测量并与平板计数法比较表明,ATP生物发光法与高通量生长曲线法有很好的准确性,MTT比色法准确度稍差,而高通量生长曲线法有最宽的线性范围,也最适合高通量测定。

关键词：活菌计数 MTT比色法 ATP生物发光法高通量生长曲线法

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