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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第7期23卷 498-501页

作者：魏惠永江丽芳方丹云郭辉玉中山大学中山医学院微生物学教研室

目的　用噬菌体展示肽库筛选登革 2型病毒 (DEN2 )E蛋白的抗原表位 ,并确定该抗原表位性质。方法　以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的... 详细信息

目的　用噬菌体展示肽库筛选登革 2型病毒 (DEN2 )E蛋白的抗原表位 ,并确定该抗原表位性质。方法　以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过噬菌体展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,初步确定E蛋白的抗原表位 ;用模拟该表位线性序列的合成十肽进行抗体结合试验、噬菌体竞争抑制试验及与DEN感染患者的血清学试验 ,确定其为免疫优势线性表位。结果　肽库淘洗获得的 11个ELISA阳性的噬菌体克隆有相似的结构基序WFKKGSS ,其展示肽与DEN2E蛋白 390～ 398AA序列有 3～ 5个氨基酸相同。对应于DEN2E蛋白390～ 399AA的合成十肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。该合成肽与DEN2感染患者血清有较高的免疫反应性。结论　本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定的DEN2E蛋白 (E390～ 398AA)线性序列为免疫优势表位 ,其对应的合成肽E10可望用于DEN2感染的快速诊断。

关键词：登革2型病毒包膜糖蛋白抗原表位噬菌体肽库

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23S rRNA基因序列分析及其在细菌鉴别诊断中的应用

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第3期24卷 241-244页

作者：洪帮兴江丽芳胡玉山方丹云郭辉玉中山大学中山医学院微生物学教研室

目的　研究细菌 2 3SrRNA基因序列的差异 ,为细菌鉴别诊断和相关研究提供科学依据。方法　设计合适的通用引物、寻找恰当的扩增条件扩增常见细菌的 2 3SrRNA基因片段。通过序列测定和运用生物信息学分析不同种属细菌 2 3SrRNA基因的保... 详细信息

目的　研究细菌 2 3SrRNA基因序列的差异 ,为细菌鉴别诊断和相关研究提供科学依据。方法　设计合适的通用引物、寻找恰当的扩增条件扩增常见细菌的 2 3SrRNA基因片段。通过序列测定和运用生物信息学分析不同种属细菌 2 3SrRNA基因的保守序列、变异规律及菌株间种系进化关系。结果　扩增出常见引起食源性感染的 16属 (种 )细菌 2 3SrRNA基因片段。部分扩增产物进行了限制性酶切鉴定和序列测定。序列比较研究获得 2 1个 2 3SrRNA的通用保守序列 ,2 3SrRNA基因保守序列与变异区在种系间呈间隔分布 ,大量变异区呈“马赛克”式分布。种系间进化关系与 16SrRNA分析结果一致。结论　 2

关键词： 23S rRNA 基因序列分析细菌感染鉴别诊断生物信息学基因芯片

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广州4株登革1型病毒E基因的全序列测定和分子进化分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第1期28卷 10-15页

作者：刘晓丽周俊梅梁瑜陶剑平方丹云周经姣江丽芳中山大学中山医学院微生物学教研室广州510080

目的通过对广州市不同年份分离的4株登革1型病毒（DEN-1）蛋白E基因进行全序列测定及分子进化分析，了解各流行株之间的遗传差异及进化关系，追踪其可能的传染来源。方法应用RT-PCR技术分别扩增各株病毒的蛋白E基因，克隆到pGEM-TEasy... 详细信息

目的通过对广州市不同年份分离的4株登革1型病毒（DEN-1）蛋白E基因进行全序列测定及分子进化分析，了解各流行株之间的遗传差异及进化关系，追踪其可能的传染来源。方法应用RT-PCR技术分别扩增各株病毒的蛋白E基因，克隆到pGEM-TEasy载体，转化DH5α宿主菌，经PCR和酶切鉴定后进行序列测定。测序结果与国内外流行株进行同源性比较和毒力位点分析，并绘制基因系统发生树。结果4株DEN-1病毒E基因序列长度均为1485bp，编码495个氨基酸，核苷酸序列同源性为91％～98％，推导的氨基酸序列同源性为96．0％～99．2％。广州1995年流行的DEN-1和2002、2004、2006年流行株的毒力位点氨基酸存在差异。结论通过对登革1型病毒E基因的进化分析，GZ01／95、GZ01／02和GZ01／04这3株同属于基因型Ⅳ，而GZ17／06属于基因型Ⅰ。1995年广州地区流行的DEN-1可能来源于印度尼西亚，而2002和2004年的流行可能与澳大利亚流行株有关。2006年广州又出现的DEN-1可能与泰国2002年的流行株输入有关。

关键词：登革病毒 E基因序列分析分子进化

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登革2型病毒海南分离株全长E基因的测定与分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2003年第4期23卷 304-306页

作者：周俊梅江丽芳高阳薛耀华方丹云中山大学中山医学院微生物学教研室广州510089

目的　测定我国登革 2型病毒海南分离株E基因的全序列 ,并分析其病毒学特性和分子进化特征。方法　运用RT PCR法扩增我国登革 2型病毒海南分离株 (D2V HN89)E基因 ,测序并用计算机分析序列 ,作毒株感染细胞及乳小白鼠试验。结果　D2V H... 详细信息

目的　测定我国登革 2型病毒海南分离株E基因的全序列 ,并分析其病毒学特性和分子进化特征。方法　运用RT PCR法扩增我国登革 2型病毒海南分离株 (D2V HN89)E基因 ,测序并用计算机分析序列 ,作毒株感染细胞及乳小白鼠试验。结果　D2V HN89株E基因核苷酸全长 146 4bp ,核苷酸和氨基酸序列与D2V NGC株的同源性分别为 95 %和 98%,系统树分析显示其与登革 2型牙买加株及登革 2型巴西 90株的亲缘关系最近。D2V HN89株的细胞病变效应与D2V NGC株相同 ,但对乳小白鼠神经毒力较弱。结论　D2V HN89株的E基因区有缺失 ,该流行毒株可能来源于牙买加或巴西登革热流行区。

关键词：登革2型病毒海南分离株全长E基因测定分析

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登革2型病毒重组E蛋白的生物学特性分析

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中山大学学报（医学科学版） 2003年第3期24卷 214-216,220页

作者：魏惠永江丽芳曾祥凤方丹云郭辉玉中山大学中山医学院微生物学教研室

[目的]检测重组 D2V全长 E蛋白纯化后的免疫反应性与抗原性,为其亚单位疫苗研制奠定基础.[方法]酵母表达上清超滤浓缩后用金属螯合亲和层析(MCAC)法过柱,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术观察蛋白条带.将纯化蛋白与... 详细信息

[目的]检测重组 D2V全长 E蛋白纯化后的免疫反应性与抗原性,为其亚单位疫苗研制奠定基础.[方法]酵母表达上清超滤浓缩后用金属螯合亲和层析(MCAC)法过柱,用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术观察蛋白条带.将纯化蛋白与组氨酸抗体、 D2V E单抗进行斑点印迹和蛋白印迹,以确定纯化物是否为含组氨酸尾的 D2V E融合蛋白,并用 ELISA检测纯化 E蛋白与不同 DV抗体的结合反应.用纯化的重组 D2V E蛋白免疫小鼠后测定其产生的抗体类型与滴度,以分析其抗原性.[结果]表达产物经 MCAC柱纯化获得单一的相对分子质量为 69× 103的蛋白,组氨酸抗体与 D2V E单抗的印迹试验证实该条带就是含多聚组氨酸尾型特异的重组 E蛋白(rEgp) , ELISA显示纯化的 rEgp保留有免疫反应性及型特异性,内糖苷酶 H消化证实其含有 N联高甘露糖残基.接种 rEgp可诱生针对 D2V抗原与重组 E蛋白的高效抗体.[结论]纯化的 D2V全长 E蛋白保留其免疫原性和免疫反应性,并具有型特异性.

关键词：登革热病毒膜糖蛋白类重组蛋白质分离纯化抗体层析法

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广东省首例人禽流感H5N1 NS、M和NP基因序列测定及分子进化分析

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中国人兽共患病学报 2008年第7期24卷 597-602页

作者：周俊梅方丹云付捷周经姣晏辉钧梁瑜江丽芳中山大学中山医学院微生物学教研室广州510080

目的对广东省首例人禽流感H5N1的3个内部基因NP、NS和M进行克隆、测序及遗传进化分析,旨在进一步了解该病毒的来源、遗传变异及其分子进化特征。方法采集该例死亡患者尸检肺组织标本提取病毒RNA,用RT-PCR二步法进行反转录和基因扩增。... 详细信息

目的对广东省首例人禽流感H5N1的3个内部基因NP、NS和M进行克隆、测序及遗传进化分析,旨在进一步了解该病毒的来源、遗传变异及其分子进化特征。方法采集该例死亡患者尸检肺组织标本提取病毒RNA,用RT-PCR二步法进行反转录和基因扩增。产物经TA克隆到载体中进行测序并对结果进行排列、拼接,参照已发表的病毒序列,对基因进行系统进化分析。结果应用随机引物和自行设计的3对特异性引物扩增出NP、NS和M基因全长cDNA序列。该3个基因同其HA、NA一样均属于A型禽流感病毒,与国内2004-2006年浙江人源病毒及湖南禽源病毒处于同一进化分支,而与香港1997年分离株相距较远。在这3个基因中,NS的变异性最大。宿主特异性相关基因及PDZ结构域配体(PL)基序分析显示其均为禽源基因。结论感染该病例的H5N1与近年在中国不同省份分离的人禽流感H5N1的系统进化分析显示它们很可能存在共同的祖先,需进一步研究不同来源病毒的亲缘关系以及病毒基因的变化是如何影响病毒的生物学特性、毒力和跨宿主传播的。

关键词： H5N1亚型基因遗传进化

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登革1型病毒广州分离株全长E基因序列测定与分析

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中国人兽共患病学报 2007年第1期23卷 48-52页

作者：周经姣方丹云晏辉钧黄骥斌江丽芳中山大学中山医学院微生物学教研室广州510080

目的对两株登革1型病毒广州分离株(DV1-GZ01/03、DV1-GZ02/03)E基因进行序列测定及分析,了解此次分离的登革病毒流行株的可能来源及其生物学特性。方法应用RT-PCR扩增两分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,应用计算机软件与国内... 详细信息

目的对两株登革1型病毒广州分离株(DV1-GZ01/03、DV1-GZ02/03)E基因进行序列测定及分析,了解此次分离的登革病毒流行株的可能来源及其生物学特性。方法应用RT-PCR扩增两分离株E基因,克隆到pGEM-T载体进行序列测定,应用计算机软件与国内外参考株及流行株进行同源性分析,绘制系统进化树。并作毒株感染细胞及乳鼠毒力试验。结果两分离株全长E基因为1 485 bp,与登革1型Austria/83株的同源性最高,核苷酸同源性均达96.6%,氨基酸同源性分别达97.4%、97.8%;与登革1型GD23/95株次之。构建的系统进化树将19株登革1型病毒分为3个基因群。两分离株与Austria/83、GD23/95同属于基因型Ⅳ型,在同一进化分支内。两分离株颅内接种乳鼠均发病,但发病时间较晚。结论DV1-GZ01/03、DV1GZ02/03属于基因型Ⅳ型,与广东1995年流行株关系密切。乳鼠的神经毒性较弱可能与其基因变异有关。

关键词：登革病毒 E基因系统进化树毒力

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应用寡核苷酸芯片技术检测食源性感染常见致病菌

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中华检验医学杂志 2005年第2期28卷 169-172页

作者：洪帮兴江丽芳胡玉山方丹云陶剑平郭辉玉中山大学中山医学院微生物学教研室广州510089

目的建立食源性感染常见致病菌的快速检测方法。方法利用带正电荷尼龙膜为芯片载体,合成寡核苷酸探针,点样于载体制成寡核苷酸芯片,对食源性感染常见致病菌23SrDNA基因片段扩增产物进行杂交检测。结果在同一条件下运用设计的通用引物扩... 详细信息

目的建立食源性感染常见致病菌的快速检测方法。方法利用带正电荷尼龙膜为芯片载体,合成寡核苷酸探针,点样于载体制成寡核苷酸芯片,对食源性感染常见致病菌23SrDNA基因片段扩增产物进行杂交检测。结果在同一条件下运用设计的通用引物扩增出16种(属)细菌23SrDNA基因片段。大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、变形杆菌、单核细胞增生李斯特菌、蜡样芽孢杆菌、肉毒梭菌和空肠弯曲菌等10种(属)菌杂交结果显示,高灵敏度和特异性;金黄色葡萄球菌、链球菌、小肠结肠炎耶尔森菌和产气荚膜梭菌等4种(属)菌,未能显示预期的种(属)杂交结果;而应用食源性感染模拟标本,检测肺炎链球菌和绿脓假单胞菌两种与食源性感染无关的致病菌未与芯片上探针出现杂交反应,检出水平可达10CFU/ml。结论建立的寡核苷酸芯片技术在食源性感染常见致病菌的检测上快速准确等优点,为食源性感染的诊治与预防提供了有效的技术手段和方法依据。

关键词：食源性感染常见致病菌寡核苷酸芯片小肠结肠炎模拟标本志贺菌检出 DNA基因尼龙膜片段

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SV40转化的人胃黏膜上皮细胞与胃癌细胞间的比较蛋白质组学研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2004年第3期24卷 226-229页

作者：贾继辉陈春燕于修平郭辉玉张茂修周亚滨栾怡齐眉赵蔚明山东大学医学院微生物学教研室山东大学第二医院中山大学中山医学院微生物学教研室

目的　研究猴病毒 4 0 (SV4 0 )转化的人胃黏膜上皮细胞GES 1与人胃癌细胞MGC 80 3的差异蛋白质组。方法　运用固相pH梯度双向凝胶电泳技术比较两者差异蛋白 ,差异蛋白用胰酶进行胶内酶切 ,肽混合物使用基质辅助激光解吸 /电离飞行时间... 详细信息

目的　研究猴病毒 4 0 (SV4 0 )转化的人胃黏膜上皮细胞GES 1与人胃癌细胞MGC 80 3的差异蛋白质组。方法　运用固相pH梯度双向凝胶电泳技术比较两者差异蛋白 ,差异蛋白用胰酶进行胶内酶切 ,肽混合物使用基质辅助激光解吸 /电离飞行时间质谱仪 (MALDI TOF MS)进行质谱分析 ,将肽质量指纹谱数据输入互联网上的蛋白质数据库进行检索。结果　获得 17个GES 1和MGC 80 3细胞间表达差异蛋白质的明确信息 ,涉及细胞骨架、细胞调控、细胞凋亡和生物氧化等种类蛋白质。结论　SV4 0转化的人胃黏膜上皮细胞GES 1与人胃癌细胞MGC 80 3间的表达蛋白具有差异 ,这些差异蛋白分析有助于深入研究胃癌发生发展机制。

关键词：胃黏膜上皮细胞癌比较蛋白质组学猴病毒40 早期诊断病原微生物

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应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

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中山医科大学学报 2002年第B09期23卷 10-13页

作者：魏惠永江丽芳郭辉玉中山大学中山医学院微生物学教研室广东广州510089

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及... 详细信息

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。

关键词：登革病毒 E蛋白噬菌体随机肽库抗原表位

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