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用于转化生长因子β/Smad信号转导通路抑制剂筛选的慢病毒报告载体的构建

中国药理学与毒理学杂志 2022年第4期36卷 274-281页

作者：杨翠平何园刘慧莹张硌周晨辰米志强查玉华柏长青解放军医学院北京100039 中国人民解放军总医院第五医学中心南院区呼吸与危重症医学科北京100071 中国人民解放军总医院第五医学中心南院区医学工程科北京100071 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建由转化生长因子β(TGF-β)诱导的含有Smad响应元件(SmadRE)和红色荧光蛋白mCherry或荧光素酶报告基因序列的慢病毒报告载体,为筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂提供有效工具。方法合成UAS-SmadRE-Pmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-... 详细信息

目的构建由转化生长因子β(TGF-β)诱导的含有Smad响应元件(SmadRE)和红色荧光蛋白mCherry或荧光素酶报告基因序列的慢病毒报告载体,为筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂提供有效工具。方法合成UAS-SmadRE-Pmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-SmadRE-Pmin-Gal4VP64-lucifer⁃ase报告基因序列,分别将其插入经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后的pCDH-GFP-Puro-noCMV慢病毒质粒载体,获得响应TGF-β的含有SmadRE和mCherry或荧光素酶报告基因序列的慢病毒报告载体,分别命名为pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase。利用慢病毒三质粒包装系统在293FT细胞中分别包装出慢病毒并感染A549细胞(分别命名为USPG-mCherryA549和USPG-luciferaseA549细胞),在倒置荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,鉴定A549细胞是否被感染成功。用TGF-β(10μg·L^(-1))及其受体拮抗剂LY2109761(5μmol·L^(-1))和SB431542(10μmol·L^(-1))分别处理USPG-mCherry A549和USPG-luciferaseA549细胞24 h,倒置荧光显微镜下观察USPG-mCherryA549细胞mCherry的表达,用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测USPG-luciferaseA549细胞荧光素酶的表达,验证所构建慢病毒报告载体用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂的可行性。用TGF-β及其受体拮抗剂LY2109761和SB431542处理A549细胞24 h,Western印迹法检测A549细胞磷酸化Smad2/3蛋白表达,验证LY2109761和SB431542对TGF-β/Smad信号转导通路的抑制作用。结果经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析,成功构建pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase慢病毒重组质粒;分别转染293FT细胞包装出慢病毒并感染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察到被感染的A549细胞表达GFP,表明USPGmCherryA549和USPG-luciferaseA549细胞构建成功。加入TGF-β处理24 h后,USPG-mCherryA549细胞表达mCherry,USPG-luciferaseA549细胞表达荧光素酶;而加入LY2109761和SB431542后,USPG-mCherryA549细胞几乎检测不到mCherry的表达,USPG-luciferaseA549细胞检测不到荧光素酶的表达。Western印迹法结果表明,TGF-β刺激后A549细胞中有磷酸化Smad2/3蛋白表达,加入LY2109761和SB431542后未检测到磷酸化Smad2/3蛋白表达。结论成功构建由TGF-β诱导的受Smad调控表达mCherry和荧光素酶的2个慢病毒报告载体,可有效感染目的细胞。该慢病毒报告载体可用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂。

关键词：转化生长因子β Smad 慢病毒报告基因受体拮抗剂

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次氯酸钠消毒剂灭活新冠病毒的实验研究

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军事医学 2022年第3期46卷 192-196页

作者：刘永健李天一邓永强李韩平帖金凤王晓林贾磊韩婧婉李林李敬云军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 解放军疾病预防控制中心北京100071

目的评估新冠病毒(SARS-CoV-2)对次氯酸钠消毒剂的敏感性,为新冠病毒疫情防控中合理使用次氯酸钠消毒剂提供依据。方法购买3个品牌84消毒液,用碘量法测定有效氯含量,稀释成不同的浓度,分别取200μl与等量滴度为(5.82±0.14)lgTCID_(... 详细信息

目的评估新冠病毒(SARS-CoV-2)对次氯酸钠消毒剂的敏感性,为新冠病毒疫情防控中合理使用次氯酸钠消毒剂提供依据。方法购买3个品牌84消毒液,用碘量法测定有效氯含量,稀释成不同的浓度,分别取200μl与等量滴度为(5.82±0.14)lgTCID_(50)/ml的新冠病毒(BetaCoV/Beijing/AMMS01/2020株)上清液混匀,作用特定时间后,取样100μl,加900μl中和剂终止消毒剂作用。用Vero细胞滴定病毒,每个稀释度做4复孔,用ReedMuench法计算病毒的感染性滴度(TCID_(50)),重复3次。结果由于中和产物的细胞毒作用,病毒滴度的检测限为2.8 lgTCID_(50)/ml。有效氯浓度为50、100、200 mg/L的消毒剂作用10 min均不能灭活新冠病毒;有效氯浓度为300 mg/L的3种消毒剂作用30 min均可检出感染性病毒;有效氯浓度为400和500 mg/L的3种消毒剂完全灭活病毒的时间有较大差异,最长灭活时间分别为30 min以上和15 min;有效氯浓度为600 mg/L的3种消毒剂作用5 min以上均可完全灭活新冠病毒。结论新冠病毒对次氯酸钠具有一定的抵抗力,为确保消毒效果,有效氯浓度为500 mg/L需作用15 min以上、有效氯浓度为600 mg/L需作用5 min以上。建议按照世界卫生组织的指南,使用有效氯浓度为1000mg/L的次氯酸钠消毒剂。

关键词：新冠病毒次氯酸钠消毒

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创伤弧菌毒力相关因子的全基因组关联分析研究

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微生物学报 2020年第7期60卷 1488-1495页

作者：张嘉鑫武雅蓉杨超康琳王景林崔玉军安徽医科大学安徽合肥230032 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

【目的】创伤弧菌是致死率最高的弧菌物种,但目前尚无在全基因组层面挖掘毒力相关因子的研究。本研究以创伤弧菌分离来源(临床和环境)作为不同表型,通过与260株基因组序列进行关联分析,挖掘毒力相关因子,从而进一步了解创伤弧菌致病因... 详细信息

【目的】创伤弧菌是致死率最高的弧菌物种,但目前尚无在全基因组层面挖掘毒力相关因子的研究。本研究以创伤弧菌分离来源(临床和环境)作为不同表型,通过与260株基因组序列进行关联分析,挖掘毒力相关因子,从而进一步了解创伤弧菌致病因素。【方法】对139株创伤弧菌分离株进行高通量测序,获取其全基因组序列;与公共数据库已公开发表的121株基因组整合,使用pyseer软件进行全基因组关联分析,对与不同分离来源显著相关的基因进行注释和解读。【结果】共发现11个基因与临床分离株显著相关,其中9个是本研究新发现的创伤弧菌潜在毒力相关因子。【结论】本研究使用群体基因组学和统计遗传学方法,在全基因组范围扫描挖掘了创伤弧菌毒力相关因子,为深入揭示该物种致病机制、设计新的疫苗和治疗靶点提供了重要依据。

关键词：创伤弧菌全基因组测序全基因组关联研究毒力因子

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鼠疫耶尔森菌基因分型国家参考品研制

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中国医药生物技术 2023年第3期18卷 271-273页

作者：张园园靳娟彭文轩周亚洲赵爱华崔玉军杨瑞馥郭彦魏东中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术检定方法及其标准化重点实验室北京102629 青海省地方病预防控制所西宁811602 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性疾病,以发病急、传播快、病死率高为特征,对人类社会影响巨大。鼠疫主要在啮齿类动物中引起原发性感染,病原菌经鼠蚤传播给人,其引起的疾病主要包括腺鼠疫、肺... 详细信息

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性疾病,以发病急、传播快、病死率高为特征,对人类社会影响巨大。鼠疫主要在啮齿类动物中引起原发性感染,病原菌经鼠蚤传播给人,其引起的疾病主要包括腺鼠疫、肺鼠疫和败血型鼠疫3种类型。其中肺鼠疫发病迅猛,可通过空气在人间传播,病死率极高[1]。人类历史上曾发生过三次鼠疫大流行,造成上亿人死亡。时至今日,很多地区,如非洲、亚洲、美洲,仍将鼠疫视为可能会死灰复燃的烈性传染性疾病之一[2-4]。

关键词：肺鼠疫腺鼠疫鼠疫菌原发性感染自然疫源性疾病鼠疫耶尔森菌国家参考品性传染性疾病

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基于CRISPR-Cas系统的核酸检测方法研究进展

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军事医学 2021年第12期45卷 955-960页

作者：游旸杜宗敏军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

核酸检测在病原体筛查、基因分型、癌症相关基因突变检测、单核苷酸多态性识别等方面有着重要作用。基于CRISPR-Cas系统的核酸检测方法具有灵敏度高、特异性强、快速廉价以及多重检测等优势,在核酸检测特别是现场快速检测领域具有良好... 详细信息

核酸检测在病原体筛查、基因分型、癌症相关基因突变检测、单核苷酸多态性识别等方面有着重要作用。基于CRISPR-Cas系统的核酸检测方法具有灵敏度高、特异性强、快速廉价以及多重检测等优势,在核酸检测特别是现场快速检测领域具有良好的应用前景。目前,基于不同的CRISPR-Cas系统已开发出多种核酸检测方法,如DETECTR、HOLMES以及SHERLOCK等。该文综述了CRISPR核酸检测方法的原理、特性以及研究进展,可为该技术的应用推广提供参考。

关键词：核酸检测 Cas12 Cas13 Cas14 等温扩增

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携带Kpn1酶切位点的日本脑炎病毒全长感染性克隆的构建与鉴定

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军事医学 2021年第12期45卷 908-912,918页

作者：韦傢郑黄星耀孙梦许王洪江李晓峰秦成峰军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建携带特定酶切位点的日本脑炎病毒全长感染性克隆,并对拯救病毒的生物学特征进行鉴定。方法利用分子克隆和反向遗传学技术,在日本脑炎病毒全长感染性克隆pJE70质粒的基础上引入Kpn1单酶切位点,获得pJE70_Kpn1重组质粒。将质粒线... 详细信息

目的构建携带特定酶切位点的日本脑炎病毒全长感染性克隆,并对拯救病毒的生物学特征进行鉴定。方法利用分子克隆和反向遗传学技术,在日本脑炎病毒全长感染性克隆pJE70质粒的基础上引入Kpn1单酶切位点,获得pJE70_Kpn1重组质粒。将质粒线性化后进行体外转录,将转录体RNA转染BHK-21细胞,拯救获得恢复病毒E70-Kpn1。通过间接免疫荧光、蚀斑形成实验、生长曲线测定、小鼠神经毒力评价等方法鉴定恢复病毒E70-Kpn1的生物学特性。结果成功构建了携带Kpn1的日本脑炎病毒全长感染性克隆,该克隆能拯救出重组的日本脑炎病毒E70-Kpn1,其生物学特征与亲本株E70无显著差异。结论研究获得携带Kpn1酶切位点的日本脑炎病毒全长感染性cDNA克隆,并成功拯救获得一株重组日本脑炎病毒,为下一步进行反向遗传学操作提供了可靠的工具。

关键词：脑炎病毒,日本克隆,分子 pJE70质粒 Kpn1酶切位点恢复病毒E70-Kpn1

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肠道菌群与结直肠癌关系及其研究技术进展

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肿瘤代谢与营养电子杂志 2021年第2期8卷 211-216页

作者：常宇骁杨瑞馥毕玉晶病原微生物生物安全国家重点实验室军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所北京100071

结直肠癌是常见的肿瘤之一,在中国肿瘤发病率中排名第三。肠道菌群对肿瘤增殖、存活、转移与肿瘤发生都产生重要影响,特别是肿瘤微环境中的代谢物可以刺激炎症细胞诱导慢性炎症反应。肠道菌群会影响机体和调节结直肠甚至整个消化系统的... 详细信息

结直肠癌是常见的肿瘤之一,在中国肿瘤发病率中排名第三。肠道菌群对肿瘤增殖、存活、转移与肿瘤发生都产生重要影响,特别是肿瘤微环境中的代谢物可以刺激炎症细胞诱导慢性炎症反应。肠道菌群会影响机体和调节结直肠甚至整个消化系统的生理功能,这与结直肠癌有着密切的关系。目前测序技术和细菌-宿主机制相互作用是研究肠道菌群和结直肠癌的主要方法,测序技术可以快速大量的对粪便样本进行菌群的种类、基因和功能上的分析,细菌-宿主相互作用技术可以从实验角度研究细菌对疾病发生发展的机制,更精准地确定肠道菌群和结直肠癌的关系。但DNA提取差异、引物偏差、测序深度,以及细菌菌株差异、未知细菌的影响等都制约着研究的进展。随着研究技术的发展,培养组学以及肠道类器官技术为肠道菌群和结直肠癌关系研究带来了新的技术和方法,一定程度上弥补了测序技术和实验技术的不足。本文就针对肠道菌群和结直肠癌关系的研究技术展开综述,讨论了其研究进展及发展方向。

关键词：肠道菌群结直肠癌宏基因组培养组学类器官

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流感病毒免疫逃逸机制研究进展

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中华实验和临床病毒学杂志 2020年第6期34卷 671-676页

作者：黄梦婷张森李靖姜涛安徽医科大学合肥230032 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室

流感病毒是重要的呼吸道传染病病原体,可引起季节性流感流行和全球性流感大暴发,对公共卫生造成严重威胁。流感病毒对宿主的致病性取决于病毒毒力及其对宿主的免疫逃逸,本文概述了流感病毒逃避宿主先天免疫反应和适应性免疫反应的各种策... 详细信息

流感病毒是重要的呼吸道传染病病原体,可引起季节性流感流行和全球性流感大暴发,对公共卫生造成严重威胁。流感病毒对宿主的致病性取决于病毒毒力及其对宿主的免疫逃逸,本文概述了流感病毒逃避宿主先天免疫反应和适应性免疫反应的各种策略,以及相关机制的最新研究进展。对流感病毒免疫逃逸的深入研究,将有助于了解病毒与宿主之间的相互作用,阐明流感病毒致病机制,为抗流感病毒药物的研发提供新策略。

关键词：流感病毒免疫逃逸先天性免疫适应性免疫

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KL2型鲍曼不动杆菌噬菌体解聚酶克隆及抗菌活性分析

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微生物学通报 2021年第9期48卷 3141-3153页

作者：王灿高明明俞鑫婷刘艳楠米志强安徽医科大学附属阜阳医院呼吸内科安徽阜阳236000 解放军总医院第五医学中心呼吸与危重症医学科北京100071 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

【背景】噬菌体解聚酶是噬菌体在裂解细菌过程中产生的一种抗菌蛋白,关于鲍曼不动杆菌荚膜分型及常见型别噬菌体解聚酶的研究报道较少。【目的】以KL2型鲍曼不动杆菌为研究对象,从噬菌体IME-AB2中克隆解聚酶,在大肠杆菌中进行可溶性表... 详细信息

【背景】噬菌体解聚酶是噬菌体在裂解细菌过程中产生的一种抗菌蛋白,关于鲍曼不动杆菌荚膜分型及常见型别噬菌体解聚酶的研究报道较少。【目的】以KL2型鲍曼不动杆菌为研究对象,从噬菌体IME-AB2中克隆解聚酶,在大肠杆菌中进行可溶性表达并研究其体外抗菌活性。【方法】应用二代测序及生物信息学方法鉴定鲍曼不动杆菌荚膜型,分析IME-AB2全基因组。应用分子克隆技术克隆ORF76假定的尾丝蛋白(Putative Tail Fiber)基因,构建重组表达载体pEASY-Blunt-E1-gp76,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,通过Ni-NTA亲和层析纯化解聚酶,研究解聚酶体外抗菌活性。【结果】构建了pEASY-Blunt-E1-gp76解聚酶重组表达质粒,该重组质粒在大肠杆菌中得到可溶性表达;体外活性分析显示,该重组蛋白在体外能够对所有的KL2型鲍曼不动杆菌具有较好的抗菌活性,解聚酶联合人和狗的血清具有很好的杀菌活性。【结论】鉴定解聚酶并提高其抗菌谱具有重要意义,也是噬菌体及解聚酶用于治疗耐药菌研究领域急需解决的重要问题之一。

关键词：鲍曼不动杆菌分型解聚酶血清

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制霉菌素引起的肠道菌群失衡及代谢物水平的变化

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军事医学 2021年第5期45卷 363-366页

作者：宫赛赛孙娅坤李佳佳高洁南楠罗德炎王慧军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的研究广谱抗真菌药对肠道菌群平衡改变及代谢产物的影响。方法选用C57BL/6雌性小鼠,用含广谱抗真菌药制霉菌素饮用水喂养7 d,分离小鼠血清进行代谢组学分析。分离口服制霉菌素7 d后小鼠结肠内容物,提取肠道菌群基因组进行16S rDNA扩... 详细信息

目的研究广谱抗真菌药对肠道菌群平衡改变及代谢产物的影响。方法选用C57BL/6雌性小鼠,用含广谱抗真菌药制霉菌素饮用水喂养7 d,分离小鼠血清进行代谢组学分析。分离口服制霉菌素7 d后小鼠结肠内容物,提取肠道菌群基因组进行16S rDNA扩增子测序、构建SMRT Bell文库,利用PacBio公司SMRT分析软件进行操作分类单元(OTU)物种注释。通过PCoA和PCA、NMDS等降维图和样品聚类树分析群落结构差异,选用t检验、MetaStat、LEfSe、Anosim和MRPP等方法对物种组成和群落结构进行差异显著性检验。结果结肠内容物菌群基因组测序结果表明,微生物多样性分析显示制霉菌素降低肠道菌群多样性;与对照组比较,服药组硬壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)细菌增加;拟杆菌门(Bacteroidetes)、糖杆菌门(Saccharobacteria)细菌丰度降低;血清代谢组检测结果显示,服药组增加的物质包括葡萄糖、甘氨酸、丙氨酸、4-羟基丁酸、亮氨酸、谷氨酰胺,降低的物质为谷氨酸、乳酸。结论小鼠肠道菌群稳态的改变可能与连续服用制霉菌素有关,厚壁菌门和拟杆菌门等优势菌种的变化明显,而且瘤胃菌群、毛螺菌科及拟杆菌群在两组之间结构差异显著,导致谷氨酸、亮氨酸等氨基酸代谢增加,而糖类代谢减慢。

关键词：肠道微生物组肠道菌群制霉菌素代谢组

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