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全国人畜共患病学术研讨会

作者：秦莉吴少庭王西明袁仕善林绮萍雷明军潘晖榕黄达娜温见翔高世同张仁利屈伸华中科技大学同济医学院深圳市疾病预防控制中心华南农业大学兽医学院广东医学院微生物学教研室

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的... 详细信息

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆人真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒。并把它们通过Lipofectamine 2000转染到HEK293细胞,RT-PCR和western-blot鉴定重组质粒在细胞中的转录和表达。构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞仪检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建了重组表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中表达。免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1:3200。pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3。脾脏T淋巴细胞亚群分析CD3+和CD8+T细胞明显升高。结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。

关键词： SARS冠状病毒 DNA疫苗棘突蛋白

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弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

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全国人畜共患病学术研讨会

作者：雷明军吴少庭戴五星潘晖榕林绮萍温见翔黄达娜高世同张仁利华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系深圳市疾病预防控制中心分子生物室华南农业大学动物医学系广东医学院微生物学教研室

目的构建原核重组表达质粒p ET23a2SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性。方法 PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD182T载体,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体p ET... 详细信息

目的构建原核重组表达质粒p ET23a2SAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性。方法 PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD182T载体,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体p ET23a,构建重组表达质粒p ET23a2SAG2,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基2β2D2硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE)与免疫印迹分析表达产物。结果 PCR扩增出约500 bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23a2SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有p ET23a2SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS2PAGE显示表达产物约Mr 19 000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。结论成功构建了p ET23a2SAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性。

关键词：弓形虫属表面抗原基因表达蛋白质印迹法

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膜表达的HLA-G1对同种反应性PBMC分泌Th1/Th2型细胞因子的影响

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免疫学杂志 2005年第4期21卷 300-302页

作者：杨惠军吴雄文张彩娥梁智辉韩军艳黄亚非龚非力湖南师范大学医学院微生物与免疫学教研室长沙410006 华中科技大学同济医学院免疫学教研室武汉430030

目的研究人脐静脉内皮细胞系(ECV304)表达的HLA-G1对同种异体外周血单个核细胞(PBMC)Th1/Th2型细胞因子分泌的影响。方法采用脂质体介导的基因转染技术将pcDNA3-HLA-G1转入ECV304,以间接免疫荧光技术在蛋白质水平上检测HLA-G1分子在ECV... 详细信息

目的研究人脐静脉内皮细胞系(ECV304)表达的HLA-G1对同种异体外周血单个核细胞(PBMC)Th1/Th2型细胞因子分泌的影响。方法采用脂质体介导的基因转染技术将pcDNA3-HLA-G1转入ECV304,以间接免疫荧光技术在蛋白质水平上检测HLA-G1分子在ECV304上的表达;以表达HLA-G1的ECV304作为刺激细胞,灭活后,与健康人PBMC共同培养,用ELISA检测上清液中Th1/Th2型细胞因子的浓度,观察HLA-G1对同种异体抗原激活的PBMC分泌Th1/Th2型细胞因子的影响。结果与转染pcDNA3空质粒的对照组相比,HLA-G1能使PBMC的IL-10分泌增加(P<0.05),而IL-2,IFN-γI、L-4分泌无明显影响。结论HLA-G1能引起由同种异体抗原激活的PBMC分泌IL-10增加,提示HLA-G1有可能使Th1/Th2型细胞因子向Th2型偏移。

关键词： HLA-G1 ECV304 Th1/Th2型细胞因子同种移植免疫耐受

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重组核酸疫苗诱导小鼠抗血吸虫感染的免疫学研究

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中华医学杂志 2005年第3期85卷 193-197页

作者：甘燕石佑恩卜玲毅宁长修朱红刚华中科技大学同济医学院寄生虫学教研室武汉430030 中国协和医科大学基础医学院病原生物学系

目的为日本血吸虫病的防治寻求新的高效联合基因免疫策略。方法构建共表达日本血吸虫相对分子质量23000表膜蛋白(Sj23)基因与鼠IL12基因的核酸疫苗质粒pVIVO2IL12Sj23,转染HEK293细胞,通过RTPCR,Westernblot及ELISA法检测Sj23和IL12蛋... 详细信息

目的为日本血吸虫病的防治寻求新的高效联合基因免疫策略。方法构建共表达日本血吸虫相对分子质量23000表膜蛋白(Sj23)基因与鼠IL12基因的核酸疫苗质粒pVIVO2IL12Sj23,转染HEK293细胞,通过RTPCR,Westernblot及ELISA法检测Sj23和IL12蛋白的表达。接种并攻击感染BALB/c小鼠,以减虫率和减卵率评价其免疫保护力,同时设攻击感染对照组、空白质粒pVIVO2组、pVIVO2IL12组和pVIVO2Sj23组。用ELISA法和WesternBlot分析免疫小鼠血清中抗体。以脾细胞培养法检测经SEA刺激后,小鼠脾细胞分泌IFNγ和IL4的水平。并以FCM分析脾细胞亚群。结果经瞬时转染HEK293细胞证明质粒pVIVO2IL12Sj23能在体外进行表达。免疫小鼠后获得了4553%的减虫率和5835%的减卵率,较单价DNA疫苗pVIVO2Sj23免疫效果好(P<005)。ELISA法和WesternBlot检测抗体结果表明免疫小鼠产生了抗Sj23特异性IgG抗体。pVIVO2IL12Sj23免疫组IFNγ的水平较对照组显著升高而IL4水平较对照组低。攻击感染后各实验组小鼠脾细胞的CD4+,CD8+亚群比率无显著差别(P>005)。结论pVIVO2IL12Sj23DNA疫苗具有诱导BALB/c小鼠产生较好的抗血吸虫感染免疫保护效果。细胞因子IL12作为基因佐剂,具有诱导Th1型免疫反应从而增强DNA疫苗免疫保护性的作用。

关键词：感染脾细胞抗血吸虫免疫小鼠 ELISA法诱导 DNA疫苗免疫保护力核酸疫苗免疫保护效果

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游离脂肪酸引起肝细胞胰岛素抵抗及其机制的研究

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上海医学 2005年第11期28卷 965-967页

作者：万学东王西明夏炎枝段秋红秦莉关中宏河南科技大学医学院生物化学教研室洛阳471003 华中科技大学同济医学院基础医学院生物化学与分子生物学系武汉430030

目的研究游离脂肪酸(FFA)诱导人肝癌细胞(HepG2)引起胰岛素抵抗及其分子机制。方法应用含0.25mmol/L的软脂酸(PA组)或100nmol/L胰岛素(Ins组)与不含软脂酸和胰岛素(正常组)的DMEM培养基培养HepG2细胞24h,正常组和PA组中又分加与不加磷... 详细信息

目的研究游离脂肪酸(FFA)诱导人肝癌细胞(HepG2)引起胰岛素抵抗及其分子机制。方法应用含0.25mmol/L的软脂酸(PA组)或100nmol/L胰岛素(Ins组)与不含软脂酸和胰岛素(正常组)的DMEM培养基培养HepG2细胞24h,正常组和PA组中又分加与不加磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂Wort-mannin两个亚组,100nmol/L胰岛素刺激后分别测定培养液中的葡萄糖浓度、细胞内的糖原含量、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)活性及胰岛素受体底物2(IRS-2)的蛋白水平。结果PA组和Ins组培养液中葡萄糖含量显著高于正常组(P<0.01),而细胞内糖原含量显著减少(P<0.01);PA组胰岛素刺激的PEPCK活性显著高于正常组(P<0.01),IRS-2蛋白水平显著低于正常组(P<0.01)。无论应用Wort mannin处理与否,PA组中的PEPCK活性及IRS-2蛋白水平差异无显著性(P>0.05),而正常组中PEPCK活性及IRS-2蛋白水平的差异有显著性(P<0.01)。结论加0.25mmol/L的软脂酸培养24h后,肝细胞可能由于胰岛素信号转导障碍产生胰岛素抵抗;胰岛素抵抗的形成可能与IRS-2及PI3K相关分子缺陷有关。

关键词：胰岛素抵抗游离脂肪酸磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶胰岛素受体底物-2 HepG2细胞

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日本血吸虫Mr23000抗原与白细胞介素-12多价DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫的研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2005年第2期23卷 82-85页

作者：卜玲毅石佑恩甘燕朱晓华宁长修朱红刚华中科技大学同济医学院寄生虫学教研室中国协和医科大学基础医学研究所病原生物学系北京100005

目的研究能共同表达日本血吸虫Mr23000膜抗原(Sj23)与白细胞介素-12(IL-12)的多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23诱导BALB/c小鼠免疫保护作用。方法在多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23和PV-IL12的基础上,构建空白质粒PV和仅表达Sj23的质粒PV-Sj23。50只BALB/c小鼠分为5组,每组10只,分别注射多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23、表达Sj23的质粒PV-Sj23、表达IL-12质粒PV-IL12、空白质粒PV和生理盐水,100μg/只,免疫1次。4周后每只鼠攻击感染40±2条尾蚴,42d后剖杀,计数成虫及肝内虫卵数。结果成功地构建了空白质粒PV和只表达Sj23的质粒PV-Sj23及多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23。PV-IL12-Sj23组和PV-Sj23组分别获得了45.5%和27.2%的减虫率,两组比较差异有显著性(P<0.05),减卵率分别为58.4%和33.9%。结论多价DNA疫苗PV-IL12-Sj23可诱导BALB/c小鼠产生较显著的抗血吸虫免疫保护作用,且保护性效果比单价DNA疫苗PV-Sj23好。

关键词：日本血吸虫 DNA疫苗诱导保护性免疫白细胞介素-12(IL-12) BALB/c小鼠多价DNA疫苗免疫保护作用 Sj23 IL12 保护性效果生理盐水攻击感染抗血吸虫 PV 质粒膜抗原虫卵数减虫率显著性

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弓形虫致密颗粒蛋白4的原核细胞表达与纯化

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2005年第6期23卷 419-423页

作者：林绮萍吴少庭翁亚彪雷明军潘晖榕袁仕善温见翔秦莉黄达娜张仁利高世同深圳市疾病预防控制中心深圳518020 华南农业大学兽医学院广州510642 华中科技大学同济医学院武汉430030 广东医学院微生物学教研室湛江524023

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)的pET原核细胞表达系统,并对其表达产物进行纯化及其免疫学活性测定。方法利用PCR扩增弓形虫GRA4基因片段,定向亚克隆入原核细胞表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌(***21 DE3),以组氨酸结合柱亲和层... 详细信息

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)的pET原核细胞表达系统,并对其表达产物进行纯化及其免疫学活性测定。方法利用PCR扩增弓形虫GRA4基因片段,定向亚克隆入原核细胞表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌(***21 DE3),以组氨酸结合柱亲和层析法纯化表达产物,并对其进行抗原活性分析。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其特异性抗体滴度。结果成功构建了弓形虫pET-GRA4原核细胞表达系统,其表达产物相对分子质量(Mr)约为40 000,主要以包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白能被人工感染弓形虫RH株速殖子的兔血清识别。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性IgG抗体。结论利用pET原核细胞表达系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白,该蛋白具有一定的免疫学活性。

关键词：弓形虫致密颗粒蛋白4 原核细胞基因表达蛋白纯化

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弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达

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中国人兽共患病杂志 2005年第9期21卷 788-792,747页

作者：林绮萍吴少庭翁亚彪秦莉张仁利高世同黄达娜袁仕善雷明军潘晖榕温见翔华南农业大学兽医学院广州510642 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 华中科技大学同济医学院广东医学院微生物学教研室

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒,并研究其在体外与体内细胞中的表达情况。方法采用PCR方法及克隆技术,构建pVACGRA4重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK293细胞,用RTPCR法及Westernblot法检测其表达情况... 详细信息

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒,并研究其在体外与体内细胞中的表达情况。方法采用PCR方法及克隆技术,构建pVACGRA4重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK293细胞,用RTPCR法及Westernblot法检测其表达情况;利用基因枪导入法将该重组质粒导入BALB/c小鼠体内细胞,测定免疫鼠T淋巴细胞亚群及IFNγ、IL4含量,并观察攻毒试验后小鼠存活情况,以评价其免疫保护力。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段,成功构建重组表达质粒pVACGRA4;转染GRA4的HEK293细胞,RTPCR检测可见一条约987bp的目的条带,表达产物经Westernblot鉴定,其分子量约为41kD,能被特异性免疫血清所识别;经pVACGRA4免疫后的小鼠,其CD+4T细胞百分率无明显变化(P>0.05),CD+8T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P<0.05,与空白对照组比较P<0.01),CD+4/CD+8比值也较空白对照组明显降低(P<0.01);pVACGRA4免疫鼠IFNγ的A值比对照组略高,但差异无显著性(P>0.05),IL4A值各组间无明显变化(P>0.05);pVACGRA4免疫鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P<0.05)。结论构建的真核表达质粒pVACGRA4能在HEK293细胞中和小鼠体内细胞中表达,为弓形虫疫苗的进一步研究打下基础。

关键词：弓形虫致密颗粒蛋白4 真核系统克隆表达

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SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究

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中国人兽共患病杂志 2005年第12期21卷 1042-1046页

作者：秦莉吴少庭王西明袁仕善林绮萍雷明军潘晖榕黄达娜温见翔高世同张仁利屈伸华中科技大学同济医学院武汉430030 深圳市疾病预防控制中心深圳518020 华南农业大学兽医学院广东医学院微生物学教研室

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1... 详细信息

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒。并通过Lipofectamine 2000将它们转染到HEK293细胞,RT-PCR和Western-blot鉴定重组质粒在真核细胞中的转录和表达。以构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建了重组真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中获得表达。免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1∶3 200。pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3。脾脏T淋巴细胞亚群分析示pVAC-S1和pVAC-S2两免疫组小鼠CD3+和CD8+T细胞明显升高。结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。

关键词： SARS冠状病毒棘突蛋白 DNA疫苗棘突蛋白

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汉坦病毒H8205株IL-2/G1融合基因在Vero细胞中的稳定表达

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热带医学杂志 2005年第2期5卷 120-123页

作者：胡洪波张泽华黄汉菊贾珉刘广华中科技大学同济医学院基础医学院病原生物学系微生物学教研室武汉430030

目的探讨外源性IL-2/G1融合基因在非洲绿猴肾细胞(Vero)获得稳定表达的可行性,为汉坦病毒基因工程疫苗的研制提供一定的实验基础。方法将汉坦病毒H8205株G1的cDNA重组人源IL-2基因后克隆到真核表达载体pcDNA3.1/His,形成重组真核表达质... 详细信息

目的探讨外源性IL-2/G1融合基因在非洲绿猴肾细胞(Vero)获得稳定表达的可行性,为汉坦病毒基因工程疫苗的研制提供一定的实验基础。方法将汉坦病毒H8205株G1的cDNA重组人源IL-2基因后克隆到真核表达载体pcDNA3.1/His,形成重组真核表达质粒pcDNA3.1/His-IL-2-G1,在脂质体介导下,将其导入Vero细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养6周,然后通过间接免疫荧光、ELSIA、SDS-PAGE电泳等方法检测IL-2-G1基因在Vero细胞中的稳定表达情况。结果成功构建重组质粒pcDNA3.1/His-IL-2-G1,其片段插入方向正确。经间接免疫荧光和SDS-PAGE电泳证实,转染了真核表达质粒pcDNA3.1/His-IL-2-G1后在Vero细胞培养上清和胞浆中有融合蛋白的表达,其相对分子量为78000u,与预期的相符合。经人IL-2ELISA检测试剂盒检测证实在培养上清和细胞裂解物所表达的融合蛋白有IL-2特性。结论在脂质体介导下,外源性IL-2/G1融合基因能够成功导入Vero细胞并获得稳定表达。

关键词：汉坦病毒 Vero细胞融合蛋白稳定表达

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