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TRPC1/ORAI1复合体调节HUVECs SOC和ROC介导的Ca^(2+)内流和NO生成

基础医学与临床 2017年第5期37卷 696-704页

作者：王腊梅胡清华钟华唐娜孙志萍何芳新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室新疆石河子832002 石河子大学医学院医学机能实验中心新疆石河子832002 华中科技大学同济医学院病理生理学系卫生部呼吸系疾病重点实验室湖北武汉430030 石河子大学医学院病理生理教研室新疆石河子832002

目的研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)/钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)介导Ca^(2+)内流和NO生成中的作用。方法取2~3代HUVECs,将构建的TRPC1和ORAI1干扰... 详细信息

目的研究瞬时受体电位通道1(TRPC1)/钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)介导Ca^(2+)内流和NO生成中的作用。方法取2~3代HUVECs,将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒分别转染入HUVECs。用激光共聚焦显微镜观察细胞转染效果,real-time PCR和Western blot检测TRPC1、ORAI1 mRNA和蛋白的表达及抑制效率。细胞随机分组:特异性质粒转染组即实验组,未转染组即空白对照组及空质粒组(vehicle组),将上述3组细胞分别与CaR激动剂、ROC模拟剂TPA+CaR负性变构调节剂Calhex231、蛋白激酶C(PKC)抑制剂Ro31-8220、经典型PKCs和PKCμ抑制剂Go6967孵育,用荧光探针Fura-2/AM及DAF-FM负载方法同步检测[Ca^(2+)]i和NO。随后将构建的TRPC1和ORAI1干扰质粒同时转染入HUVEC,与CaR激动剂孵育后检测[Ca^(2+)]i和NO,用免疫共沉淀法检测TRPC1和ORAI1的相互作用。结果 1)与对照组相比,TRPC1及ORAI1组,mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05);2)在4种不同处理作用下,TRPC1及ORAI1转染组中细胞内Ca^(2+)浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);3)与对照组及单转染TRPC1及ORAI1组比,共转染组细胞内Ca^(2+)浓度变化值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);4)TRPC1与ORAI1相互作用形成复合体,且在CaR激动剂的剌激下相互作用增强。结论 TRPC1与ORAI1复合体共同调节CaR经SOC和ROC激活介导的Ca^(2+)内流和NO生成。

关键词： TRPC1 ORAI1 一氧化氮钙离子人脐静脉内皮细胞

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STIM1/ORAI1复合体参与调节人脐静脉内皮细胞SOC和ROC介导的钙内流和NO生成

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石河子大学学报（自然科学版） 2017年第3期35卷 354-362页

作者：王腊梅胡清华钟华唐娜孙志萍何芳新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室/石河子大学医学院病理生理教研室新疆石河子832002 石河子大学医学院医学教学实验中心新疆石河子832002 华中科技大学同济医学院病理生理学系/卫生部呼吸系疾病重点实验室湖北武汉430030

为研究基质交联分子1(STIM1)/钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)介导Ca^(2+)内流和NO生成中的作用。采取2-3代HUVECs随机分组,将构建的STIM1和ORAI1干扰... 详细信息

为研究基质交联分子1(STIM1)/钙释放激活钙通道调节分子1(ORAI1)复合体在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)钙池操纵性钙通道(SOC)和受体操纵性钙通道(ROC)介导Ca^(2+)内流和NO生成中的作用。采取2-3代HUVECs随机分组,将构建的STIM1和ORAI1干扰质粒分别转染入HUVECs。用激光共聚焦显微镜观察细胞转染效果,Real-time PCR和Western blotting检测STIM1、ORAI1 mRNA和蛋白的表达。细胞随机分组:特异性质粒转染组即实验组,未转染组即空白对照组(Control组)及空质粒组(Scrambled组),将上述3组细胞分别与四种不同处理因素刺激后用荧光探针Fura-2/AM检测[Ca^(2+)]i变化,NO荧光探针DAF-FM负载方法同步检测NO生成的变化。随后将构建的STIM1和ORAI1干扰质粒同时转染入HUVECs,与Ca R激动剂精胺孵育后检测[Ca^(2+)]i和NO,用免疫共沉淀法检测STIM1和ORAI1的相互作用。结果显示,(1)与对照组相比,STIM1及ORAI1组,m RNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05);(2)在4种不同处理因素作用下,STIM1及ORAI1转染组中[Ca^(2+)]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);(3)与对照组及单转染STIM1及ORAI1组比,共转染组[Ca^(2+)]i△ratio值和NO净荧光强度值均明显降低(P<0.05);(4)STIM1与ORAI1相互作用形成复合体,且在Ca R激动剂的剌激下相互作用增强。由此可知,STIM1与ORAI1复合体共同调节Ca R经SOC和ROC激活介导的Ca^(2+)内流和NO生成。

关键词： STIM1 ORAI1 一氧化氮钙离子人脐静脉内皮细胞

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小鼠胸膜纤维化模型中CX43蛋白的动态表达

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中国组织化学与细胞化学杂志 2013年第5期22卷 372-375页

作者：向叶宸杨洁穆庆陈利军蔡鹏程叶红马万里华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院临床检验科武汉430022 华中科技大学同济医学院基础医学院病理生理学系卫生部呼吸系疾病重点实验室武汉430030

目的研究博莱霉素诱导的小鼠胸膜纤维化模型中间隙连接蛋白CX43的动态表达变化,以阐明胸膜损伤而导致纤维化的机制。方法采用胸膜腔内注射博莱霉素和碳粉复制小鼠胸膜纤维化模型,分别于注射后第2,7,21d取肺及胸膜组织,免疫组化法测定CX4... 详细信息

目的研究博莱霉素诱导的小鼠胸膜纤维化模型中间隙连接蛋白CX43的动态表达变化,以阐明胸膜损伤而导致纤维化的机制。方法采用胸膜腔内注射博莱霉素和碳粉复制小鼠胸膜纤维化模型,分别于注射后第2,7,21d取肺及胸膜组织,免疫组化法测定CX43蛋白表达和Masson染色检测胸膜胶原表达情况。结果第2d胸膜开始增厚,以炎症细胞浸润为主,第7d胸膜增厚达到高峰,第21d胸膜变薄;胶原表达则从第7d开始增多,21d达高峰;CX43表达第2d增多,第7d达高峰,第21d较低,但均高于对照组(P<0.05)。结论小鼠胸膜纤维化模型中,胸膜组织CX43的表达上调,并且与胸膜炎症反应有关。

关键词：胸膜纤维化炎症 CX43 胶原

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缝隙连接在TGF-β1诱导的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用

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中国病理生理杂志 2012年第1期28卷 16-21页

作者：钟华胡清华王恩帮赵丹孙志萍司军强何芳新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室石河子大学医学院新疆石河子832002 石河子大学医学院病理生理教研室新疆石河子832002 石河子大学医学院医学机能实验中心新疆石河子832002 华中科技大学同济医学院病理生理学系卫生部呼吸系疾病重点实验室湖北武汉430030 郧阳医学院生理学教研室湖北十堰442000

目的:探讨缝隙连接是否参与转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法:原代培养SHR胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组:对照组、TGF-β1组、缝隙连接阻断剂18α-甘草次酸(18α-GA)组和T... 详细信息

目的:探讨缝隙连接是否参与转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞增殖及可能的分子机制。方法:原代培养SHR胸主动脉平滑肌细胞,细胞分4组:对照组、TGF-β1组、缝隙连接阻断剂18α-甘草次酸(18α-GA)组和TGF-β1+18α-GA组。MTT法及流式细胞术检测细胞的增殖活性,免疫荧光技术观察细胞中缝隙连接蛋白(Cx)43和Cx40蛋白表达及定位,Western blotting法检测细胞中Cx43和Cx40蛋白表达,染料示踪分子传递法(划痕标记染料传输法)检测细胞的缝隙连接功能。结果:(1)与对照组相比,TGF-β1组MTT法测得A值及细胞周期S期比例增高(P<0.05),细胞增殖活性增强。18α-GA组降低(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+18α-GA组A值及S值比例均降低(P<0.05),细胞增殖活性减弱。(2)免疫荧光技术检测细胞中Cx43与Cx40蛋白表达呈阳性,两者共定位于胞浆。(3)与对照组相比,TGF-β1组Cx43蛋白表达增强(P<0.05),Cx40表达无显著差异(P>0.05),18α-GA组Cx43和Cx40表达均减弱(P<0.05),与TGF-β1组比,TGF-β1+18α-GA组Cx43表达减弱(P<0.05),Cx40表达无显著差异(P>0.05)。(4)与对照组相比,TGF-β1组缝隙连接功能明显增强(P<0.05);18α-GA组缝隙连接功能明显减弱(P<0.05);与TGF-β1组比,TGF-β1+18α-GA组缝隙连接功能显著降低(P<0.05)。结论:TGF-β1主要通过上调SHR血管平滑肌细胞Cx43蛋白表达,引起缝隙连接通讯功能增强,从而促进了SHR血管平滑肌细胞的增殖,而Cx40蛋白表达可能不起主要作用。

关键词：缝隙连接血管平滑肌细胞转化生长因子β

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同型半胱氨酸抑制人脐静脉内皮细胞eNOS活性

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基础医学与临床 2011年第8期31卷 864-868页

作者：钟华胡清华张会敏赵丹孙志萍李增春何芳新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室石河子大学医学院病理生理教研室华中科技大学同济医学院病理生理学系卫生部呼吸系疾病重点实验室湖北武汉430030 新乡医学院河南新乡453003 郧阳医学院生理学教研室湖北十堰442000 医学机能实验中心新疆石河子832002

目的研究不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)作用不同的时间对人脐静脉内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响机制。方法取2～3代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与不同浓度Hcy孵育以及孵育不同时间。用Western blot和实时荧光定量RT-PCR法检... 详细信息

目的研究不同浓度同型半胱氨酸(Hcy)作用不同的时间对人脐静脉内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响机制。方法取2～3代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与不同浓度Hcy孵育以及孵育不同时间。用Western blot和实时荧光定量RT-PCR法检测热休克蛋白90(HSP90)、蛋白激酶B(Akt)蛋白表达,小凹蛋白(Caveolin-1)、eNOS、P-eNOS蛋白及mRNA的表达,二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)mRNA表达。结果与静息和激活状态下的对照组相比,在Hcy作用下,Caveolin-1蛋白的表达上调(P<0.05),而Akt蛋白的表达下调(P<0.05),且均呈浓度、时间依赖性。eNOS蛋白的表达无明显改变。Hcy对其他检测指标无影响。结论 Hcy引起的eNOS活性降低与增强Caveolin-1蛋白表达使其与eNOS藕联增加,减少HSP90、Akt和eNOS复合物的形成,进而抑制了eNOS的活性有关。

关键词：同型半胱氨酸 eNOS 人脐静脉内皮细胞 A23187

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血管平滑肌细胞中ERK通路与TGF-β1/Smad通路的相互作用

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中国应用生理学杂志 2010年第1期26卷 15-18页

作者：钟华何芳胡清华王振焕邓峰美孙志萍李增春新疆地方病与民族高发病教育部重点实验室石河子大学医学院病理生理教研室石河子大学医学院医学机能实验中心石河子832002 华中科技大学同济医学院病理生理学系卫生部呼吸系疾病重点实验室武汉430030

目的:探讨血管平滑肌细胞(VSMC)中TGF-β/Smad与ERK信号转导通路是否存在相互调节关系。方法:原代培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞,分四组:①对照组,②TGF-β1组,③ERK阻断剂(PD98059)组和④TGF-β1+ERK阻断剂(PD98059)组。分别用Western ... 详细信息

目的:探讨血管平滑肌细胞(VSMC)中TGF-β/Smad与ERK信号转导通路是否存在相互调节关系。方法:原代培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞,分四组:①对照组,②TGF-β1组,③ERK阻断剂(PD98059)组和④TGF-β1+ERK阻断剂(PD98059)组。分别用Western blot法检测VSMC内Smad2/3、ERK1/2蛋白表达及磷酸化Smad2/3、磷酸化ERK1/2蛋白含量,RT-PCR方法测VSMC中Smad2、Smad3mRNA的表达。结果:①与对照组相比,TGF-β1组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量增多(P<0.05),ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量减少(P<0.05),TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量无差异;与TGF-β1组相比,TGF-β1+ERK阻断剂组P-Smad2/3、P-ERK1/2蛋白含量减少(P<0.05)。各组间Smad2/3、ERK1/2蛋白表达无差异。②各组的Smad2、Smad3mRNA表达无差异。结论:TGF-β1诱导的Smad2/3蛋白磷酸化依赖ERK通路激活,但ERK通路对Smad2/3蛋白和mRNA表达水平无影响。

关键词： ERK 血管平滑肌细胞 TGF-β_1

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钙受体及线粒体源性过氧化氢在缺氧诱导胞浆钙增加中的作用

钙受体及线粒体源性过氧化氢在缺氧诱导胞浆钙增加中的作用

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中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：张继伟周娟汪涛朱莉萍胡清华华中科技大学同济医学院病理生理学系华中科技大学同济医学院卫生部呼吸系疾病重点实验室

缺氧通过肺血管平滑肌细胞胞浆钙离子([Ca])增加而引起肺血管收缩,但其机制却一直未能充分阐明。本项目研究发现钙受体（CaR）特异性阻滞剂Celhex23 1可浓度依赖性抑制缺氧所引起的[Ca]升高以及缺氧所诱导的肺血管收缩反应。RNAi技术进... 详细信息

缺氧通过肺血管平滑肌细胞胞浆钙离子([Ca])增加而引起肺血管收缩,但其机制却一直未能充分阐明。本项目研究发现钙受体（CaR）特异性阻滞剂Celhex23 1可浓度依赖性抑制缺氧所引起的[Ca]升高以及缺氧所诱导的肺血管收缩反应。RNAi技术进一步研究发现:特异性干扰CaR后抑制缺氧所引起的[Ca]升高,且抑制外源性HO诱导的[Ca]升高。鉴于缺氧可诱导细胞内活性氧产生,采用线粒体DNA"剔除"技术特异性抑制线粒体功能,阻断线粒体源性HO生成后,缺氧不再引起[Ca]升高,而加入外源性HO可使该反应逆转。此外,当用过氧化物清除剂catalase预处理细胞后,可抑制缺氧所引起的[Ca]升高;而SOD无此作用。以上研究表明:缺氧所致线粒体源性活性氧的产生可增强细胞膜上CaR的敏感性,使其在细胞外钙离子不发生改变时被激活,引起肺血管平滑肌细胞浆钙离子增加,进而导致平滑肌收缩。

关键词：线粒体胞浆钙肺血管收缩

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不同性别干细胞在组胺和过氧化氢刺激时钙动力学特征及细胞增殖的差异

不同性别干细胞在组胺和过氧化氢刺激时钙动力学特征及细胞增殖的...

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中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：谭如彬朱莉萍胡清华华中科技大学同济医学院病理生理学系华中科技大学同济医学院卫生部呼吸系疾病重点实验室

干细胞已用于诸多疾病包括肺动脉高压治疗的研究。干细胞引入体内后,为特异性示踪其定位及变化,现多采用将雄性干细胞引入雌性动物体内,籍Y染色体来特异性示踪,因此不可避免地忽略了干细胞性别差异对治疗疗效的影响。本项目研究发现小... 详细信息

干细胞已用于诸多疾病包括肺动脉高压治疗的研究。干细胞引入体内后,为特异性示踪其定位及变化,现多采用将雄性干细胞引入雌性动物体内,籍Y染色体来特异性示踪,因此不可避免地忽略了干细胞性别差异对治疗疗效的影响。本项目研究发现小鼠骨髓间充质干细胞在炎症刺激如组胺和过氧化氢刺激时雌雄细胞间钙动力学变化存在明显差异:1μmol/L组胺刺激时,78%雌性细胞表现为钙振荡,而74%雄性细胞表现为一过性钙浓度升高。100μmol/L过氧化氢刺激时,雌性细胞主要表现为钙振荡,且振幅和频率较规则,而雄性细胞主要表现为一过性升高且最后钙浓度持续在一个高于基线的水平。进一步研究发现,1μmol/L组胺和100μmol/L过氧化氢刺激雌性细胞24 h后细胞增殖明显高于雄性细胞。由于钙变化动力学特征决定下游生物学效应,在此基础之上,本研究将进一步深入探讨在组胺、过氧化氢等刺激条件下,雌雄干细胞下游转录因子激活及蛋白表达的差异,以明确不同性别干细胞对肺动脉高压治疗效果是否亦存在差异。

关键词：细胞增殖不同性别动力学特征

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钙贮池排空后STIM1分布的变化及其在核钙信号中的作用

钙贮池排空后STIM1分布的变化及其在核钙信号中的作用

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中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：陈凤容胡亚莉阎岩朱莉萍胡清华华中科技大学同济医学院病理生理学系华中科技大学同济医学院卫生部呼吸系疾病重点实验室

本研究主要探讨脐静脉内皮细胞STIM1的核膜移位现象及其在核钙信号中的作用与机制。通过免疫荧光和Western Blot检测均表明STIM1主要分布于胞浆,核内几乎无表达。TG分别作用1、3、10、30、60 min,发现STIM1于作用3 min和10 min时聚集于... 详细信息

本研究主要探讨脐静脉内皮细胞STIM1的核膜移位现象及其在核钙信号中的作用与机制。通过免疫荧光和Western Blot检测均表明STIM1主要分布于胞浆,核内几乎无表达。TG分别作用1、3、10、30、60 min,发现STIM1于作用3 min和10 min时聚集于细胞核膜上,其余时间点则主要分布于胞浆,即随着作用时间呈振荡性分布于胞浆及核膜之间,并且随着作用时间的延长该蛋白有核内转位现象。细胞转入野生型和突变型的STIM1后观察发现,野生型STIM1并无转位现象,突变型STIM1发生向细胞核膜移位并沿核膜滑行后向细胞胞膜转位。转入STIM1特异性干扰质粒的细胞,经TG作用后给予正常含钙液刺激细胞胞浆钙信号并无明显变化,而核钙信号受到明显抑制;而给予10μmol/L组胺刺激后,胞浆以及核内的平台期消失。以上实验表明:人脐静脉内皮细胞内STIM1主要分布于胞浆,TG刺激后,STIM1发生核膜或者核内转位,并随TG作用时间的延长STIM1在胞浆与细胞核被膜之间来回转位。脐静脉内皮细胞表达突变型的STIM1并参与脐静脉内皮细胞细胞核钙信号调节。

关键词：静脉内皮细胞突变型 STIM1 钙信号

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组胺间断刺激所致钙振荡调节转录因子激活的机制研究

组胺间断刺激所致钙振荡调节转录因子激活的机制研究

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中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会

作者：宋珊珊朱莉萍于洋佘惟槟胡清华华中科技大学同济医学院病理生理学系华中科技大学同济医学院卫生部呼吸系疾病重点实验室

钙振荡通过其频率调节下游生物学效应的现象广泛为人们所接受,但是,钙振荡频率为何调节下游生物学效应岂今仍未能完全阐明。本研究小组通过人工钙振荡以及人工钙振荡与受体刺激相结合两种研究策略揭示钙振荡频率通过其波宽来调节下游转... 详细信息

钙振荡通过其频率调节下游生物学效应的现象广泛为人们所接受,但是,钙振荡频率为何调节下游生物学效应岂今仍未能完全阐明。本研究小组通过人工钙振荡以及人工钙振荡与受体刺激相结合两种研究策略揭示钙振荡频率通过其波宽来调节下游转录因子NF-κB、NFAT、Oct活性。然而,以上两种研究方法均是在排空细胞内钙储池为前提下进行的,不能完全模拟生理、病理生理条件下细胞内的钙振荡。本研究采用组胺间断刺激完全模拟生理、病理生理条件下细胞内钙振荡,在人气道上皮细胞中建立一系列频率相同、累积波宽不同以及累积波宽相同、频率不同的钙振荡模型。研究发现:钙振荡频率分别为0.6 min、0.3 min、0.2 min,灌流时间45min时累积波宽均约为466 s,此时三种不同频率钙振荡所致转录因子NF-κB活性及IL-8 mRNA表达均无显著差异。而当钙振荡频率均为0.6 min,灌流45min,累积波宽分别为（412.14±12.32）s、（549.92±22.82）s、（799.70±24.12）s（P<0.05）时,NF-κB活性及IL-8 mRNA表达均具有显著性差异。以上研究表明组胺间断刺激诱发钙振荡调节转录因子活性以及IL-8的表达均表现为累积波宽依赖性,揭示了钙振荡频率调节转录活性的潜在机制。

关键词：钙振荡频率调节

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