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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第2期29卷 137-141页

作者：尹注增王璐胡枫向莹谢林徐婧李俊华陈刚陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究院教育部器官移植重点实验室卫生部器官移植重点实验室武汉430030

目的探讨新生猪睾丸Sertoli细胞抵御人血清中天然抗体介导的补体杀伤作用及其主要机制。方法分离培养10～15日龄的湖北白猪睾丸Sertoli细胞；以猪血管内皮细胞（PED）为对照，采用流式细胞仪（FACS）及免疫荧光检测并比较两种细胞天然... 详细信息

目的探讨新生猪睾丸Sertoli细胞抵御人血清中天然抗体介导的补体杀伤作用及其主要机制。方法分离培养10～15日龄的湖北白猪睾丸Sertoli细胞；以猪血管内皮细胞（PED）为对照，采用流式细胞仪（FACS）及免疫荧光检测并比较两种细胞天然抗原α-Gal的表达；FACS检测并比较两种细胞分别与正常人血清（NHS）中天然抗体IgM、IgG的结合情况；乳酸脱氢酶（LDH）检测20％NHS对Sertoli细胞及PED细胞的杀伤；MTT法检测两种细胞在20％NHS中培养的活性；细胞免疫荧光检测补体C3c、C4d在Sertoli细胞、PED细胞的沉积；细胞免疫组化及免疫荧光检测补体C5b-9在两种细胞上的沉积。结果猪睾丸Sertoli细胞表达仪-Gal，但明显弱于PED细胞，猪睾丸Sertoli细胞能与天然抗体（主要是IgM）结合；20％NHS对Sertoli细胞、PED细胞的杀伤率分别为24．38％±0．50％、53．13％±14．53％，P〈0．01；两种细胞在20％NHS中的活性分别为98．73％±18．84％、52．43％±8．08％，P〈0．01；免疫荧光及组化可见PED细胞上有补体C3c、CAd、C5b-9的沉积；但Sertoli细胞仅有C3c、CAd沉积，而未见C5b-9沉积。结论猪睾丸Sertoli细胞可以显著抵御人血清中天然抗体介导的杀伤作用，其机制可能与Sertoli细胞低表达仅．Gal并抑制补体攻膜复合物形成有关。

关键词： Sertoli细胞 α-Gal 补体

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构建永生化人源肝细胞的研究

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中华肝脏病杂志 2009年第5期17卷 395-397页

作者：孟凡迎周平华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所、教育部器官移植重点实验室、卫生部器官移植重点实验室武汉430030

近年来，人源肝细胞的需求日益增多。新药的开发与应用、病毒性肝炎的实验研究、肝细胞移植及生物人工肝的研究应用等等均需要大量的人源肝细胞。但人肝细胞来源困难，细胞分离、培养及储存的技术尚不完善，体外培养存活时间短，其供给... 详细信息

近年来，人源肝细胞的需求日益增多。新药的开发与应用、病毒性肝炎的实验研究、肝细胞移植及生物人工肝的研究应用等等均需要大量的人源肝细胞。但人肝细胞来源困难，细胞分离、培养及储存的技术尚不完善，体外培养存活时间短，其供给无法满足日益增多的需求。近几年永生化的人肝细胞技术进展较快，尤其是构建成功的可逆性永生化人肝细胞，有望从根本上解决人肝细胞来源困难的难题。

关键词：肝细胞细胞培养技术永生化

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体外诱导和检测人类B细胞产生抗HLA抗体的研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第6期29卷 559-563页

作者：廖爱华刘丽平黄伟陈栋王燕张玲华中科技大学同济医学院计划生育研究所/生殖医学中心武汉430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所/教育部器官移植重点实验室/卫生部器官移植重点实验室

目的体外诱导和采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测人类B细胞产生的抗HLA抗体。方法对7名健康志愿者采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）并体外培养5d，以B细胞多克隆刺激原美洲商陆丝裂原（PWM）、葡萄球菌A蛋白菌体（SAC... 详细信息

目的体外诱导和采用酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测人类B细胞产生的抗HLA抗体。方法对7名健康志愿者采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC）并体外培养5d，以B细胞多克隆刺激原美洲商陆丝裂原（PWM）、葡萄球菌A蛋白菌体（SAC）体外刺激PBMC，采用ELISA和ELISPOT方法分别测定培养上清中Ig浓度和抗体分泌B细胞数，探索体外诱导PBMC产生Ig的适宜方法。采用该刺激方法和HLA特异的ELISPOT法，诱导和检测9例拟行肾移植预致敏对象PBMC产生的抗HLA抗体。结果与PWM单刺激相比，PBMC在PWM和SAC联合刺激后，有更多细胞存活的趋势（P=0．052），且培养上清中IgM的水平明显增加（P=0．03），而IgG的水平无明显变化（P〉0．05）。6例预致敏对象诱导和检测到抗HLA抗体。其特异性与各自培养上清中检测到的抗HIA抗体一致。结论PWM和SAC体外刺激PBMC，结合HLA特异的ELISPOT方法，能诱导和检测到人类B细胞产生的HLA抗体。

关键词：酶联免疫斑点法 B淋巴细胞 HLA抗体美洲商陆丝裂原

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Galeetin-9（Tim-3L）显著减弱小鼠移植排斥

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中华微生物学和免疫学杂志 2009年第1期29卷 5-10页

作者：何文涛袁劲方泽民汪峰徐逸周鸿敏高英张维娜王璐陈忠华华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部重点实验室武汉430030

目的探究Galectin-9（即Tcell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3 lig-and，Tim-3L）的真核定位与功能，及其对同种异基因排斥反应的影响。方法PCR扩增Galectin-9片段，插入到pEGFP—N1质粒，转染中国仓鼠卵巢癌细胞系（CHO）行G418筛选，分选增强型绿色荧光蛋白（EGFP）阳性细胞。免疫组化检测Galectin-9的表达，Alamar Blue法检测稳定转染Galectin-9的CHO细胞及其新鲜培养上清对脾细胞增殖的影响，ELISA检测IL-2水平。给予BALB／c→C57BL／6心脏移植受鼠Galectin-9蛋白100μg×7d。结果Galectin-9表达于细胞浆，稳定转染Galectin-9-EGFP的CHO细胞上清抑制淋巴细胞增殖和IL-2的产生。上述效应可被Tim-3-Fc融合蛋白逆转。Galectin-9干预的心脏移植物中位生存时间明显延长[（22．7±1．2）d，（7．2±0．4）d）]。结论真核细胞中Galectin．9可通过分泌形式负调节同种异基因免疫；Galectin-9有望成为新型的抗排斥药物。

关键词： Tim-3 Galectin-9 免疫抑制小鼠

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IL-17参与小鼠心脏移植排斥反应的实验研究

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华中科技大学学报（医学版） 2009年第5期38卷 581-584,589页

作者：雷钧何凡吴敏郑翔李舒媛陈知水华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所器官移植教育部重点实验室器官移植卫生部重点实验室武汉430030

目的研究Th17细胞相关因子白细胞介素17(IL-17)在小鼠心脏移植排斥反应中的表达及意义。方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型,实验动物随机分为同系移植组和急性排斥反应组。观察2组供心存活时间,应用RT-PCR检测移植心脏IL-17、核孤独受体... 详细信息

目的研究Th17细胞相关因子白细胞介素17(IL-17)在小鼠心脏移植排斥反应中的表达及意义。方法建立小鼠颈部异位心脏移植模型,实验动物随机分为同系移植组和急性排斥反应组。观察2组供心存活时间,应用RT-PCR检测移植心脏IL-17、核孤独受体γt(RORγt)、干扰素-γ(IFN-γ)mRNA在移植术后1、2、3、4、5、6、7、8 d的动态表达水平。免疫荧光法观察移植术后第4天移植心脏内CD4+、CD8+T细胞中IL-17的表达情况。结果RT-PCR检测显示,在急性排斥反应组中,IL-17和RORγt mRNA的表达都早于IFN-γ,在移植术后第2天即可于移植心脏中检测到,其表达量在术后第4天均达到高峰,随后逐渐下降,并分别在术后第6天和第7天无表达。免疫荧光结果显示,急性排斥组移植心脏内有大量CD4+、CD8+T细胞浸润,细胞因子IL-17主要由CD4+T细胞分泌。结论Th17细胞在移植排斥反应的发生发展中可能起着非常重要的作用,对移植脏器中细胞因子IL-17的检测可作为急性排斥反应早期诊断的预见性和特异性指标。

关键词：移植排斥反应 Th17细胞白细胞介素17 核孤独受体γt 干扰素-γ

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老龄亲属活体供肾移植疗效观察

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肾脏病与透析肾移植杂志 2009年第4期18卷 338-342页

作者：孟凡迎陈知水陈孝平吴敏杜敦峰魏来蒋继贫曾凡军张伟杰林正斌周平明长生宫念樵刘敦贵华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部器官移植重点实验室武汉430030

目的：探讨老龄亲属活体供肾移植的疗效。方法：我院自2006年1月至2006年12月共施行亲属活体肾移植74例,收集该74例活体供肾移植的临床资料,按供者年龄大小分为2组：老龄组（≥55岁）11例,低龄组（〈55岁）63例。分别对两组受体术后不... 详细信息

目的：探讨老龄亲属活体供肾移植的疗效。方法：我院自2006年1月至2006年12月共施行亲属活体肾移植74例,收集该74例活体供肾移植的临床资料,按供者年龄大小分为2组：老龄组（≥55岁）11例,低龄组（〈55岁）63例。分别对两组受体术后不同时间点临床资料和两组供体术前术后的临床资料进行分析比较,探讨老龄活体供肾移植的疗效。结果：（1）受者情况：老龄组有1例术后发生移植肾功能延迟恢复,低龄组有7例,组间比较无差别（P〉0.05）,两组受者移植术后肾功能恢复情况比较无差异,1年人/肾存活率均为100%。供者情况：两组供者术后一周血肌酐均明显升高,老龄组术前血肌酐（85.6±13.7）μmol/L,术后1周升高至（106.4±15.6）μmol/L,而低龄供者术前血肌酐（73.7±6.8）μmol/L,术后1周升高至（101.8±13.1）μmol/L。但术后1年随访,两组供者血肌酐恢复术前水平。结论：在严格供体筛查的前提下,老龄供肾（5565岁）对供者是安全的;而对受者,接受老龄供肾术后近期肾功能恢复情况良好,远期效果有待进一步观察。

关键词：肾移植老龄供肾疗效

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ICOS—ICOSL和CD28-B7共刺激信号对大鼠角膜移植排斥反应调控效应的比较

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中华器官移植杂志 2009年第8期30卷 456-459页

作者：宫念樵王海灏丁召明长生张伟杰陈知水陈孝平华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉430030

目的观察阻断可诱导性共刺激分子及其配体（ICOS-ICOSL）或CD28B7共刺激信号对大鼠角膜移植排斥反应的影响，并比较其差异。方法制备腺病毒载体介导的诱导性共刺激分子融合蛋白（AdICOSIg）和腺病毒介导的细胞毒T淋巴细胞抗原4融合蛋白... 详细信息

目的观察阻断可诱导性共刺激分子及其配体（ICOS-ICOSL）或CD28B7共刺激信号对大鼠角膜移植排斥反应的影响，并比较其差异。方法制备腺病毒载体介导的诱导性共刺激分子融合蛋白（AdICOSIg）和腺病毒介导的细胞毒T淋巴细胞抗原4融合蛋白（AdCTLA4Ig）。以DA大鼠为供者，Lewis大鼠为受者，进行角膜移植：受者分别接受经Adβ-Gal、AdICOSIg和AdCTLA4Ig转染的角膜移植，分别为局部Adβ-Gal组、局部AdICOSIg组和局部AdCTLA4Ig组；受者分别接受未经处理的角膜移植，并于移植前24h腹腔注射Adβ-Gal、移植后48h腹腔注射AdICOSIg或移植前24h腹腔注射AdCTLA4Ig，分别为全身Adβ-Gal组、全身AdICOSIg组和全身AdCTLA4Ig组；以接受未经处理的角膜移植者为空白对照。术后每日于手术显微镜下观察移植角膜的透明度，以判断排斥反应的发生情况。基因转染后7d，检测受者血清ICOSIg和CTLA41g的浓度以及抗腺病毒抗体水平。结果空白对照组移植角膜存活时间为（13．1±0．3）d，局部AdICOSIg组、局部AdCTLA4Ig组和全身AdCTLA4Ig组移植角膜的存活时间长于空白对照组，分别为（14．2±0．8）d（P〈0．05）、（15．8±0．6）d（P〈0．01）和（22．7±4．3）d（P〈0．01），局部AdCTLA4Ig组和全身AdCTLA4Ig组各有1例未发生排斥反应。全身AdCTLA4Ig组受者的血清CTLA4Ig浓度较高，其抗腺病毒载体抗体水平则较低。结论CD28137与ICOS-ICOSL共刺激信号在免疫调节效应上存在差异，阻断CD28B7信号所获得的延长移植角膜存活时间的效果优于阻断ICOS-ICOSL者。

关键词：基因疗法角膜移植腺病毒科抗原,CD28 抗原,CD80

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抑制Caspase-8基因表达对减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用

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中华器官移植杂志 2009年第11期30卷 678-681页

作者：陈栋朱珉郭晖刘斌陈刚张伟杰陈知水陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉430030

目的观察抑制半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8（Caspase-8）基因的表达对减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用。方法构建针对大鼠Caspase-8基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体。将Lewis大鼠随机分为3组，每组8只。（1）假手术组：麻... 详细信息

目的观察抑制半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶8（Caspase-8）基因的表达对减轻大鼠肝脏缺血再灌注损伤的作用。方法构建针对大鼠Caspase-8基因的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体。将Lewis大鼠随机分为3组，每组8只。（1）假手术组：麻醉后，取腹部正中切口，缝合关腹；（2）磷酸盐缓冲液（PBS液）组：阻断肝门血流前48h经门静脉注射PBS液1ml，然后行肝脏缺血再灌注；（3）shRNA组：阻断肝门血流前48h经门静脉注射Caspase-8 shRNA 50μg（总体积为1m1），然后行肝脏缺血再灌注。肝脏缺血再灌注的方法为阻断大鼠70％入肝血流40min。于再灌注6h、12h、24h、3d、5d、7d时检测血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平；检测肝组织中Caspase-8 mRNA的表达、细胞凋亡情况、丙二醛（MDA）以及超氧化物岐化酶（SOD）的含量。结果与PBS液组比较，shRNA组再灌注6、12、24h，血清中A11、和AST水平显著降低（P〈0．05）；肝组织中Caspase-8mRNA水平、肝细胞凋亡指数（shRNA组和PBS液组分别为22．33％±4．28％和35．24％±2．33％）以及肝组织中MDA含量[shRNA组和PBS液组分别为（94．5±11．2）nmol／mg和（133．5±12．4）nmol／mg]均显著降低（P〈0．05），而肝组织中SOD活性显著升高[shRNA组和PBS液组分别为（21．6±3．7）U／mg和（12．2±3．1）U／mg，P〈0．05]。结论通过RNA干扰Caspase-8基因的表达可以抑制肝细胞凋亡的发生，减轻肝脏缺血再灌注损伤。

关键词：肝脏再灌注损伤半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8 RNA干扰

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门静脉输注供者脾细胞诱导的供者特异性免疫低反应性

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中华器官移植杂志 2009年第8期30卷 465-468页

作者：徐胜元何凡吴敏蔡明丁召郑翔陈知水华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉430030

目的探讨经门静脉输注供者脾细胞能否诱导皮肤移植小鼠产生供者特异性的免疫低反应性及其可能机制。方法取Balb／c小鼠，随机分为空白对照组（经小鼠门静脉输注RPMI1640培养液）、受者脾细胞组（经小鼠门静脉输注Balb／c小鼠脾细胞）、... 详细信息

目的探讨经门静脉输注供者脾细胞能否诱导皮肤移植小鼠产生供者特异性的免疫低反应性及其可能机制。方法取Balb／c小鼠，随机分为空白对照组（经小鼠门静脉输注RPMI1640培养液）、受者脾细胞组（经小鼠门静脉输注Balb／c小鼠脾细胞）、供者脾细胞组（经小鼠门静脉输注C57BL／6小鼠脾细胞）、空白移植对照组（经小鼠门静脉输注RPMI1640培养液，7d后移植C57BL／6小鼠的皮肤）、实验对照组（经小鼠门静脉输注Balb／c小鼠脾细胞，7d后移植C57BL／6小鼠的皮肤）、实验组（经小鼠门静脉输注C57BL／6小鼠脾细胞，7d后移植C57BL／6小鼠的皮肤）以及第三方移植组（经小鼠门静脉输注C57BL／6小鼠脾细胞，7d后移植C3H小鼠的皮肤）。记录空白移植对照组、实验对照组、实验组和第三方移植组移植皮肤的存活时间，并观察移植皮肤的病理学变化；脾细胞输注后7d，分别获取空白对照组、受者脾细胞组和供者脾细胞组小鼠的外周血、脾脏和肝脏，用流式细胞仪测定样本中CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋调节性T淋巴细胞（CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋Treg细胞）的比例。结果实验组移植皮肤的存活时间为（19．8±4．6）d，明显长于空白移植对照组、实验对照组和第三方移植组，但仍未达到长期存活。皮肤移植后7d，空白移植对照组和实验对照组的移植皮肤呈现重度急性排斥反应的病理学改变，而实验组移植皮肤呈现中度急性排斥反应的病理学改变。供者脾细胞组外周血、肝脏和脾脏中CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋Treg细胞比例明显高于空白对照组和受者脾细胞组。结论门静脉输注供者脾细胞可特异性地延长供者皮肤移植物的存活时间，减轻移植物的排斥反应，该效应可能与受者体内的CD4^＋CD25^＋Foxp3^＋Treg细胞增加有关。

关键词： T淋巴细胞,调节门静脉免疫耐受抗原,CD4 抗原,CD25

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猕猴预致敏后肾移植加速性排斥反应的免疫学及病理学特点

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中华器官移植杂志 2009年第9期30卷 515-518页

作者：陈松李俊华向莹钟山郭晖王虹吴瑛朱建国陈实陈刚华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所卫生部/教育部器官移植重点实验室武汉430030

目的观察猕猴预致敏后肾移植加速性排斥反应的免疫学及病理学变化特点。方法建立猕猴皮肤预致敏后肾移植加速性排斥反应模型（供、受者各3只）。检测3只受者皮肤移植预致敏前、后及肾移植后血清内供者特异性抗体的变化，并在发生排斥反... 详细信息

目的观察猕猴预致敏后肾移植加速性排斥反应的免疫学及病理学变化特点。方法建立猕猴皮肤预致敏后肾移植加速性排斥反应模型（供、受者各3只）。检测3只受者皮肤移植预致敏前、后及肾移植后血清内供者特异性抗体的变化，并在发生排斥反应时对移植肾进行免疫组织化学（测定补体、抗体的沉积及各类型淋巴细胞浸润情况）及病理学分析。结果3只受者均发生了加速性排斥反应。其中2只受者在预致敏后血清中供者特异性抗体明显增加，对供者的淋巴毒反应明显升高；肾移植后受者血清中供者特异性抗体及针对供者的淋巴毒进一步升高。苏木精－伊红染色显示排斥反应的移植肾内有明显的动脉坏死、血栓形成、间质出血、中性粒细胞浸润；免疫组织化学及荧光染色显示移植肾内有大量的补体、抗体沉积（主要为IgG），而各种类型的淋巴细胞浸润少见。另1只受者体内的供者特异性抗体及对供者淋巴毒反应的升高程度不如前2只明显，病理学变化以肾小管损伤为主。结论皮肤移植预致敏可以诱导受者产生程度不等的预存抗体，导致大多数移植肾在术后早期发生主要由抗体和补体介导的严重的急性体液性排斥反应。

关键词：猴肾移植皮肤移植抗体

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