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南京农业大学学报 2016年第6期39卷 907-914页

作者：吴蓓李梦瑶王广龙黄蔚熊爱生南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室江苏南京210095

[目的]肉桂酰辅酶A还原酶CCR(cinnamoyl-Co A reductase)在植物木质素代谢中起重要的作用,能够将羟基肉桂酸还原生成肉桂醛。本文目的是研究不同芹菜中肉桂酰辅酶A还原酶基因AgCCR在芹菜中组织表达和非生物胁迫过程中的响应情况。[方法]... 详细信息

[目的]肉桂酰辅酶A还原酶CCR(cinnamoyl-Co A reductase)在植物木质素代谢中起重要的作用,能够将羟基肉桂酸还原生成肉桂醛。本文目的是研究不同芹菜中肉桂酰辅酶A还原酶基因AgCCR在芹菜中组织表达和非生物胁迫过程中的响应情况。[方法]以2个芹菜品种‘六合黄心芹’和‘文图拉’为材料,分别克隆出编码肉桂酰辅酶A还原酶的基因AgCCR。利用荧光定量PCR分析不同芹菜组织和2种芹菜在高温、低温、干旱和盐胁迫下AgCCR的表达情况。[结果]序列分析表明,‘六合黄心芹’和‘文图拉’中AgCCR基因均含有1个长度为1 014 bp的开放阅读框,编码337个氨基酸,二者的核苷酸位点有3个位点的差异,编码的氨基酸有1个位点的差异。对2个芹菜中的AgCCR基因进行多重比对并绘制进化树,发现其编码的氨基酸序列与其他15种植物的CCR蛋白同源性较高,氨基酸高度保守。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,芹菜AgCCR基因在‘六合黄心芹’和‘文图拉’叶中的表达水平较高,AgCCR基因在高温和低温下表达上调,在干旱处理下表达下调。[结论]芹菜AgCCR基因对多种非生物胁迫均有响应。特别是低温下该基因响应明显,表明AgCCR基因或许与芹菜抗寒机制相关。

关键词：芹菜肉桂酰辅酶A还原酶基因序列分析非生物胁迫基因表达

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洋葱不同组织RNA提取方法比较分析

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江苏农业科学 2016年第10期44卷 95-95,96,97页

作者：张仕林许玉超帅强邓鹏王建军南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室江苏南京210095 上海蔬菜研究所上海201899 南京新农科创投资有限责任公司江苏南京211134

探讨洋葱不同组织总RNA提取的最优方法,以期为今后开展洋葱的分子生物学研究奠定基础。以洋葱品种W470发育旺盛时期的叶片、根、鳞茎为材料,比较Ta KaRa试剂盒法、TIANGEN试剂盒法、TRIzol法、p BIOZOL法等4种RNA提取方法提取洋葱RNA的... 详细信息

探讨洋葱不同组织总RNA提取的最优方法,以期为今后开展洋葱的分子生物学研究奠定基础。以洋葱品种W470发育旺盛时期的叶片、根、鳞茎为材料,比较Ta KaRa试剂盒法、TIANGEN试剂盒法、TRIzol法、p BIOZOL法等4种RNA提取方法提取洋葱RNA的效果。凝胶电泳结果显示,除了TIANGEN试剂盒法不能提取洋葱根的总RNA,其他方法在洋葱不同组织中均可提取到不同质量的RNA。对不同方法提取洋葱RNA浓度、纯度进行检测发现,Ta KaRa试剂盒法提取洋葱叶片的总RNA浓度为342.31μg/g,p Biozol法提取洋葱鳞茎、根的总RNA浓度分别为1 119.39、171.85μg/m L。经RT-PCR验证,Ta KaRa试剂盒法提取的洋葱叶片总RNA、p BIozol法提取洋葱鳞茎、根的总RNA均成功扩出洋葱β-actin基因片段。由结果可知,Ta KaRa试剂盒适合提取洋葱叶片的总RNA,p BIOZOL法适合提取洋葱鳞茎、根的总RNA且质量能够满足后续试验要求。

关键词：洋葱总RNA RNA提取 RT-PCR

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不结球白菜雄蕊瓣化相关AP3基因的克隆和表达分析

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南京农业大学学报 2015年第5期38卷 748-756页

作者：黄和喜王岩许玉超徐玮玮刘世拓侯喜林胡春梅南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室江苏南京210095

[目的]APETALA3(AP3)转录因子是特异性作用于花瓣和雄蕊的MIKCc-型植物MADS转录因子。通过分离和检测不结球白菜雄蕊变异系的Bc AP3基因,探究不结球白菜稳定雄性不育系的机制。[方法]利用同源克隆基因的方法,以不结球白菜突变系和保持... 详细信息

[目的]APETALA3(AP3)转录因子是特异性作用于花瓣和雄蕊的MIKCc-型植物MADS转录因子。通过分离和检测不结球白菜雄蕊变异系的Bc AP3基因,探究不结球白菜稳定雄性不育系的机制。[方法]利用同源克隆基因的方法,以不结球白菜突变系和保持系的早期花蕾总RNA为研究对象,克隆出2个AP3同源基因Bc AP3-1和Bc AP3-2,然后利用生物信息学方法对这2个基因的核苷酸和蛋白氨基酸序列结构和组成进行信息学分析。采用半定量PCR技术,对不结球白菜中2个AP3家族基因在不同发育时期及不同组织部位的表达进行了研究。[结果]Bc AP3-1基因的c DNA全长为698 bp,编码231个氨基酸,且在突变系和保持系中序列一致。Bc AP3-2基因在突变系中克隆到的c DNA全长为698 bp,编码231个氨基酸;而在保持系中克隆到的c DNA全长为674 bp,编码223个氨基酸。生物信息学分析结果表明:Bc AP3基因属于典型的MADS-box基因家族的Ⅱ类MIKCc-型基因,属于eu AP3家系。不同花器官RT-PCR结果表明:Bc AP3-1基因在2种材料的花瓣和雄蕊中均有表达,而Bc AP3-2只在突变系的雄蕊中表达,在保持系雄蕊中无表达。花发育不同时期RT-PCR结果表明:在突变系中,Bc AP3-2基因的表达量变化与雄蕊退化现象相一致。[结论]Bc AP3-2基因可能与不结球白菜雄蕊瓣化性状密切相关。

关键词：不结球白菜雄蕊瓣化 AP3基因基因表达

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洋葱转录组SSR信息分析及其多态性研究

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园艺学报 2015年第6期42卷 1103-1111页

作者：李满堂张仕林邓鹏侯喜林王建军南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室南京210095

采用生物信息学方法分析洋葱(Allium cepa L.)转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列(SSR)引物,以期为洋葱分子标记辅助育种提供有力工具。利用MISA工具筛选了洋葱转录组测序获得的106 932条unigenes(84.04 Mb),并对其SSR位点信息... 详细信息

采用生物信息学方法分析洋葱(Allium cepa L.)转录组中的SSR位点信息,并设计简单重复序列(SSR)引物,以期为洋葱分子标记辅助育种提供有力工具。利用MISA工具筛选了洋葱转录组测序获得的106 932条unigenes(84.04 Mb),并对其SSR位点信息进行了分析,共筛选得到5 959个SSR位点(占总unigenes的5.10%),其发生频率为1/14.1 kb。SSRs位点中主导类型是以AAG/CTT(占总SSRs的10.20%)为主的三核苷酸重复,占总SSRs的37.27%;其次是单、二核苷酸重复,其出现频率分别为30.91%和24.75%。利用Primer5共设计出5 258对SSR引物。随机选择20对引物进行PCR扩增,其中12对扩增出清晰可重复的条带,9对在24个不同类型洋葱材料中表现出多态性。利用UPGMA作图,将24个洋葱材料分为4类。

关键词：洋葱转录组 SSR 引物多态性

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灰霉菌侵染大白菜后ADF7和ADF10基因表达分析

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南京农业大学学报 2015年第5期38卷 742-747页

作者：马清华陈晓峰牟晋华侯喜林南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室江苏南京210095 中国农业大学烟台研究院山东烟台264670

[目的]本文旨在研究大白菜ADF7和ADF10基因对真菌侵染的响应。[方法]从拟南芥基因组数据库中找到全部的At ADF7和At ADF10基因,通过与大白菜基因组数据库序列比对分析,得到对应的基因序列。利用生物信息学分析其特性,通过半定量和定量分... 详细信息

[目的]本文旨在研究大白菜ADF7和ADF10基因对真菌侵染的响应。[方法]从拟南芥基因组数据库中找到全部的At ADF7和At ADF10基因,通过与大白菜基因组数据库序列比对分析,得到对应的基因序列。利用生物信息学分析其特性,通过半定量和定量分析2个基因在受到真菌侵染的大白菜中的表达情况。[结果]系统进化树分析表明,大白菜ADF7基因与其他近似植物的ADF7基因有较高的同源性。对大白菜ADF7和ADF10编码的蛋白进行二级结构分析,它们具有相近的相对分子质量和等电点,都没有信号肽。采用半定量检测大白菜受灰霉菌侵染前后ADF基因表达特点,结果显示:ADF7和ADF10在未受侵染的根、茎、叶中几乎不表达,在灰霉菌侵染的叶中表达量最高,茎次之,根中表达不明显。实时荧光定量PCR(qRTPCR)分析进一步验证了基因的组织特异性表达,病原菌侵染大白菜后,ADF7和ADF10在根、茎、叶中均呈现双波表达特点且表达趋势一致,在侵染12和48 h后均出现表达高峰值且在‘新烟杂3号’的表达量明显高于‘包头莲’。[结论]ADF7和ADF10在根、茎、叶中具有组织差异表达特性,并且在抗病品种中的表达较高。这为进一步研究生物胁迫情况下肌动蛋白的聚合和解聚机制奠定了理论基础。

关键词：大白菜肌动蛋白解聚因子灰霉菌实时定量PCR

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萝卜硝酸还原酶基因的克隆与表达分析

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南京农业大学学报 2015年第2期38卷 205-211页

作者：武悦徐良王娟娟龚义勤谢洋柳李旺南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺学院江苏南京210095 全国农业技术推广服务中心北京100125

[目的]为揭示萝卜（Raphanus sativus L.）硝酸还原酶基因（RsNR）的分子特征,降低硝酸盐含量,对萝卜RsNR基因进行分离与表达特性研究。[方法]基于本实验室转录组测序所得unigene序列分离RsNR基因cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析,... 详细信息

[目的]为揭示萝卜（Raphanus sativus L.）硝酸还原酶基因（RsNR）的分子特征,降低硝酸盐含量,对萝卜RsNR基因进行分离与表达特性研究。[方法]基于本实验室转录组测序所得unigene序列分离RsNR基因cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析,采用RT-qPCR方法对不同浓度KNO3（0、5、20、30和50mmol·L^-1）和不同时间（0、4、8、12和24h）处理的萝卜中RsNR基因表达进行检测,并测定硝酸盐含量和硝酸还原酶活性（NRA）。[结果]获得萝卜RsNR基因cDNA序列（GenBank登录号：KM272859）,开放阅读框为2742bp,编码913个氨基酸,RsNR与油菜NR基因（D38219）氨基酸序列相似性为95%。在30mmol·L^-1NO3^--N诱导下,萝卜叶片和根中RsNR基因表达量最高。在30mmol·L^-1NO3^--N诱导初期,叶片和根中RsNR表达量4h达到最大值,随后呈下降趋势;随着硝酸盐处理浓度升高,NRA、硝酸盐含量和RsNR基因表达量均呈先升后降趋势,0～4h内叶片和根中三者均上升,4～24h内NRA和RsNR基因表达下降,而硝酸盐含量呈上升趋势。[结论]NO3^--N可能在转录水平上调控萝卜RsNR基因表达,进而影响其硝酸盐含量和NRA。

关键词：萝卜基因表达硝酸还原酶基因(NR) NO3^--N处理

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不结球白菜响应ABA和低温基因WRKY18的克隆及表达分析

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南京农业大学学报 2015年第2期38卷 189-196页

作者：黄菲艺唐君侯喜林马静王枫南京农业大学园艺学院/作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室江苏南京210095 江苏省中国科学院植物研究所江苏南京210014

[目的]WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物的生长发育、生物及非生物胁迫响应。克隆和鉴定不结球白菜共同响应ABA和低温的WRKY基因,对研究不结球白菜抗逆分子机制和改良其抗逆性具有重要意义。[方法]采用电子克隆的方法... 详细信息

[目的]WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,广泛参与植物的生长发育、生物及非生物胁迫响应。克隆和鉴定不结球白菜共同响应ABA和低温的WRKY基因,对研究不结球白菜抗逆分子机制和改良其抗逆性具有重要意义。[方法]采用电子克隆的方法在NCBI数据库中进行不结球白菜WRKY18基因全长拼接,然后在不结球白菜‘苏州青’中,克隆到1个与低温及ABA响应相关的WRKY基因,通过生物信息学手段和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)技术分析了该基因的序列结构特征及其在低温和ABA处理下的表达变化。[结果]该基因全长为1080bp,含有978bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与油菜及拟南芥的WRKY18直系同源,氨基酸序列相似性分别为87%和73%,命名为BcWRKY18。序列分析表明,该编码蛋白为核蛋白,不含跨膜区,无信号钛,具有WRKYGQK基序(motif)约60个氨基酸残基的WRKY保守结构域,为WRKY转录因子家族成员。系统聚类分析指出了BcWRKY18蛋白的保守性及其在开花植物中的进化关系;序列结构和同源建模分析指出了BcWRKY18蛋白的保守结构域、蛋白质的二级及三级结构分布模型;qRT-PCR检测了BcWRKY18基因在ABA和低温胁迫下的表达,表明低温和ABA都能诱导BcWRKY18基因表达,其表达模式都存在相似的过程,且BcWRKY18基因对ABA的响应比对低温的响应更快、更明显。[结论]从不结球白菜中克隆获得1个新的WRKY类转录因子基因BcWRKY18,基因表达分析发现BcWRKY18可能存在对ABA和低温的共响应及自身反馈调控。

关键词：不结球白菜 WRKY18 低温 ABA 非生物胁迫序列分析实时定量RT-PCR

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番茄中受TYLCV诱导上调表达基因tetraspanin3的功能分析

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南京农业大学学报 2015年第6期38卷 896-900页

作者：裴延飞刘廷利连梓伊杨郁文陈天子王金彦张保龙柳李旺南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室/园艺学院江苏南京210095 江苏省农业科学院江苏省农业生物学重点实验室江苏南京210014

[目的]本文旨在研究tetraspanin3基因在抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)病中的作用及对番茄生长发育的影响。[方法]通过MEG 5.0软件构建进化树,分析tetraspanin3基因的进化;采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测tetraspanin3在番茄各个器官中... 详细信息

[目的]本文旨在研究tetraspanin3基因在抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)病中的作用及对番茄生长发育的影响。[方法]通过MEG 5.0软件构建进化树,分析tetraspanin3基因的进化;采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测tetraspanin3在番茄各个器官中的表达量及对TYLCV诱导的响应;通过病毒诱导基因沉默技术(VIGS)将番茄中的tetraspanin3沉默,测定基因沉默后番茄的抗病性并观测沉默植株表型。[结果]构建的进化树显示:番茄的tetraspanin3基因与葡萄同源基因在一个独立的进化分支上。tetraspanin3基因在各器官中均有表达,在茎、老叶、花中表达量较高,在根、果实中表达量较低,在新叶中的表达量处于中间水平。tetraspanin3受TYLCV诱导后上调表达。沉默tetraspanin3后的植株出现了叶片扭曲,并且在接种TYLCV后,TYLCV病毒量降低50%以上。[结论]tetraspanin3与番茄叶片的生长发育有关,并且对TYLCV侵染番茄植株起正调控作用。

关键词：番茄黄化曲叶病毒跨膜蛋白病毒诱导的转基因沉默功能分析

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不结球白菜乙烯响应因子基因的克隆与表达分析

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西北植物学报 2014年第12期34卷 2399-2404页

作者：王岩李树燕沈露露黄和喜侯喜林胡春梅南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室、农业部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室南京210095

采用cDNA-AFLP技术,以不结球白菜雄蕊突变系‘苏白2号’及其保持系花蕾为实验材料,分离出1条编码乙烯响应转录因子的基因,命名为NhccERF1。结果显示:(1)序列分析表明,NhccERF1基因长807bp,编码268个氨基酸。(2)RT-PCR分析发现,花期NhccE... 详细信息

采用cDNA-AFLP技术,以不结球白菜雄蕊突变系‘苏白2号’及其保持系花蕾为实验材料,分离出1条编码乙烯响应转录因子的基因,命名为NhccERF1。结果显示:(1)序列分析表明,NhccERF1基因长807bp,编码268个氨基酸。(2)RT-PCR分析发现,花期NhccERF1基因在花瓣、雄蕊及花柱中表达量均显著高于保持系。(3)实时定量荧光PCR(qPCR)发现,蕾期喷施乙烯(ET)能促进NhccERF1基因的表达,外施AgNO3抑制该基因表达。研究推测NhccERF1基因可能在雄蕊变异中发挥重要作用。

关键词：不结球白菜雄蕊突变乙烯响应因子(ERF) 基因表达

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芹菜NHL-like蛋白基因克隆与表达分析

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植物遗传资源学报 2014年第4期15卷 788-794页

作者：李岩王枫谭国飞贾晓玲蒋倩熊爱生南京农业大学园艺学院作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室南京210095

植物生长发育过程中会遭遇各种病原物的攻击,植物为了应对这些危害并适应外界的生存竞争,逐渐演化出了复杂的防御机制.NHL基因家族庞大,部分NHL基因受病原物诱导后会过量表达,增强植物对多种病原菌的抗性,是与植物防御机制密切相关的蛋... 详细信息

植物生长发育过程中会遭遇各种病原物的攻击,植物为了应对这些危害并适应外界的生存竞争,逐渐演化出了复杂的防御机制.NHL基因家族庞大,部分NHL基因受病原物诱导后会过量表达,增强植物对多种病原菌的抗性,是与植物防御机制密切相关的蛋白.本研究以津南实芹和美国西芹2个芹菜品种为试验材料,分别克隆出NHL-like蛋白基因AgNHL.序列分析表明,上述2种芹菜的AgNHL基因序列均含636 bp的开放阅读框,编码211个氨基酸.2种芹菜碱基序列,只有第36位不同,津南实芹为T,美国西芹为C,2种碱基序列相似性高达99.84％,编码的氨基酸序列相同.进化分析显示,2种芹菜的NHL-like蛋白与葡萄、大豆等植物的相似度较高,在第80～185氨基酸间含一个LEA_2蛋白保守结构域.荧光定量PCR结果表明,AgNHL基因主要在芹菜茎中表达,根中表达量最低,有明显组织特异性,品种差异也很显著.对2种芹菜分别进行4℃低温、38℃高温、20％ PEG处理、0.2 mol/L NaCl处理2h表达分析显示,低温、盐处理下该基因表达量明显上升.

关键词：芹菜 NHL-like蛋白基因克隆荧光定量PCR 表达分析

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