检索结果-内蒙古大学图书馆

中国兽医科学 2025年第2期55卷 188-196页

作者：刘聪钱炳旭温渊汤芳戴建君薛峰南京农业大学动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏南京210095 中国药科大学江苏南京211198 南京农业大学三亚研究院海南三亚572000

为实现抗牛结节性皮肤病病毒(LSDV)药物的高内涵筛选(HCS),选取LSDV复制非必需基因TK作为增强绿色荧光蛋白(EGFP)的插入区域,构建了表达EGFP的重组LSDV,该重组病毒rLSDV-ΔTKEGFP与野生型LSDV的生长特性无明显差异。基于rLSDV-ΔTK-EGFP... 详细信息

为实现抗牛结节性皮肤病病毒(LSDV)药物的高内涵筛选(HCS),选取LSDV复制非必需基因TK作为增强绿色荧光蛋白(EGFP)的插入区域,构建了表达EGFP的重组LSDV,该重组病毒rLSDV-ΔTKEGFP与野生型LSDV的生长特性无明显差异。基于rLSDV-ΔTK-EGFP,建立了抗LSDV药物的高内涵快速筛选方法,使用该方法对天然产物库中的1036个化合物进行了筛选。结果显示,该方法筛选到5个具有抗LSDV活性的化合物。进一步检测LSDV117蛋白表达水平和LSDV043基因拷贝数,结果表明,在MDBK细胞上经过5种化合物处理后可以显著抑制LSDV,且化合物浓度为10μmol/L时,均无明显细胞毒性。上述结果表明,构建的表达EGFP的重组LSDV可以用于抗LSDV药物的高内涵筛选,具有较高的筛选效率,对于提高动物个体抗病毒能力,缓解牛结节性皮肤病症状,减少经济损失等方面具有重要意义。

关键词：牛结节性皮肤病病毒 EGFP 抗病毒药物高内涵筛选

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副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统vscH基因生物学功能分析

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畜牧与兽医 2025年第1期57卷 57-65页

作者：田珅李婉君曹钰莹许立慧任建鸾汤芳戴建君薛峰南京农业大学动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏南京210095 中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京210009

副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌。Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)作为该菌的主要毒力因子之一,在致病过程中发挥重要作用。vscH位于T3SS1基因座中,功能未知。为探究vscH基因的生物学功能,通过同源重组的方法在副溶... 详细信息

副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌。Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)作为该菌的主要毒力因子之一,在致病过程中发挥重要作用。vscH位于T3SS1基因座中,功能未知。为探究vscH基因的生物学功能,通过同源重组的方法在副溶血弧菌POR-1菌株的基础上构建vscH缺失株ΔvscH及回补株CΔvscH,比较各菌株在生物被膜形成、细胞毒性等生物学特性上的差异;应用Western blot检测T3SS1效应蛋白的分泌量及其在HeLa细胞中易位量;通过GST-Pull Down试验鉴定与VscH相互作用的T3SS1相关蛋白。结果:与POR-1菌株相比,缺失株ΔvscH在生长性能上无明显差异,但生物被膜形成能力下降,同时对HeLa细胞和CaCo-2细胞的毒性作用明显下降;vscH基因的缺失使效应蛋白VopR、VopS和胞外针结构蛋白VscI的分泌显著减少,同时使VopR和VopS在HeLa细胞内易位量显著下降;GST-Pull Down试验发现VscH与一种位于T3SS1的ATP酶VscN存在相互作用。本研究表明,vscH基因影响副溶血弧菌生物被膜形成,参与T3SS1介导的毒性作用,同时对T3SS1效应蛋白的分泌和易位发挥重要功能。

关键词：副溶血弧菌 Ⅲ型分泌系统 vscH 分泌易位

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非洲猪瘟病毒蛋白pS183L的原核表达及多克隆抗体制备

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畜牧与兽医 2025年第2期57卷 112-117页

作者：余群邹艳丽陈欢刘珊苗雨润任炜杰王振忠何佳依高晓宇钱莺娟吴晓东郑龙三南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部细菌学重点实验室江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心/国家非洲猪瘟参考实验室山东青岛266000

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pS183L的多克隆抗体。根据公布的毒株ASFV China/2018/Anhui XCGQ基因序列设计引物,酶切连接法构建重组质粒pET-28a-S183L;经鉴定成功的质粒转化大肠杆菌Rosetta,诱导表达后经镍柱亲和层析纯化后... 详细信息

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pS183L的多克隆抗体。根据公布的毒株ASFV China/2018/Anhui XCGQ基因序列设计引物,酶切连接法构建重组质粒pET-28a-S183L;经鉴定成功的质粒转化大肠杆菌Rosetta,诱导表达后经镍柱亲和层析纯化后获得重组蛋白pS183L,免疫小鼠并制备抗pS183L的多克隆抗体。通过ELISA鉴定多克隆抗体效价大于1∶128000;Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明,该多克隆抗体能识别293T和PK15细胞外源表达蛋白及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)内源表达蛋白。综上,本研究成功制备抗pS183L多克隆抗体,为深入研究ASFV pS183L的功能提供了关键生物材料。

关键词：非洲猪瘟病毒 pS183L 多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒CP312R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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畜牧与兽医 2025年第4期57卷 101-106页

作者：司安琪王淑娟张永强王筱真任炜杰郑龙三包静月王志亮南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部细菌学重点实验室江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心/国家非洲猪瘟参考实验室山东青岛266032

为了深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV)CP312R蛋白的生物学特性,为血清学诊断技术研究和疫苗研发提供材料,制备了CP312R蛋白的单克隆抗体。将原核表达质粒pGEX-6p-CP312R转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)细胞中,用IPTG诱导CP312R蛋白表达并纯化... 详细信息

为了深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV)CP312R蛋白的生物学特性,为血清学诊断技术研究和疫苗研发提供材料,制备了CP312R蛋白的单克隆抗体。将原核表达质粒pGEX-6p-CP312R转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)细胞中,用IPTG诱导CP312R蛋白表达并纯化,利用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定重组蛋白表达产物的抗原性,用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,在进行4次免疫后,取加强免疫后的小鼠脾脏进行细胞融合,经阳性克隆筛选后,获得了2株能够稳定分泌抗CP312R蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过Western blot和间接免疫荧光(IFA)等试验对所获得的单克隆抗体的特异性进行鉴定,Western blot结果显示,制备的2株单克隆抗体均能与CP312R蛋白发生特异性反应;IFA结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)产生特异性绿色荧光。综上,本研究制备的2株单克隆抗体,为非洲猪瘟血清学诊断方法及疫苗的研究奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 CP312R蛋白单克隆抗体原核表达

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牛结节性皮肤病病毒ORF140依赖JUP激活Wnt信号通路影响病毒复制的研究

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畜牧与兽医 2025年第3期57卷 103-110页

作者：王敏温渊曹钰莹刘聪李超汤芳戴建君薛峰南京农业大学动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心/农业农村部动物生物安全风险预警及防控重点实验室(南方)/青岛市动物生物安全重点实验室山东青岛266032 中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京211199

旨在探索牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)ORF140在病毒感染宿主细胞中的作用。利用前期构建的LSDV ORF140缺失株,荧光定量分析缺失ORF140基因在LSDV感染宿主细胞后细胞因子转录水平的变化,同时选取LSDV保守基因ORF... 详细信息

旨在探索牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus, LSDV)ORF140在病毒感染宿主细胞中的作用。利用前期构建的LSDV ORF140缺失株,荧光定量分析缺失ORF140基因在LSDV感染宿主细胞后细胞因子转录水平的变化,同时选取LSDV保守基因ORF077建立检测LSDV ORF077的标准曲线,检测LSDV ORF140缺失株与野毒株在不同时间点的拷贝数变化,然后通过蛋白质谱技术和免疫共沉淀技术分析140蛋白与宿主细胞内存在相互作用的蛋白,最后敲低此蛋白的基因转录水平检测宿主细胞内细胞因子转录水平的变化。结果:LSDV ORF140缺失株会引起宿主细胞β-catenin基因转录水平显著下调(P<0.000 1)且缺失株拷贝数始终比野毒株高,推测LSDV ORF140基因的存在能激活宿主细胞的Wnt/β-catenin(Wnt/β-连环蛋白信号通路)信号通路,并且该通路的激活会影响LSDV的复制,宿主细胞中的连接斑珠蛋白(JUP)与LSDV 140蛋白存在相互作用,敲低宿主细胞JUP基因转录水平,发现β-catenin基因转录水平下调(P<0.05),感染LSDV后,β-catenin基因转录水平仍处于下调状态,并且检测到此时病毒拷贝数比野毒株高(P<0.05),以此推测LSDV ORF140是通过与JUP结合激活Wnt/β-catenin信号通路,从而影响LSDV的复制。综上,本研究证实LSDV 140蛋白能够与宿主细胞中的JUP蛋白结合,激活Wnt/β-catenin信号通路,从而抑制LSDV的复制,为揭示LSDV与宿主之间的相互作用及LSDV的致病机制提供参考。

关键词：牛结节性皮肤病病毒连接斑珠蛋白 Wnt/β-catenin信号通路病毒复制

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非洲猪瘟病毒pK205R蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立

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畜牧与兽医 2025年第2期57卷 105-111页

作者：王燕邹艳丽何佳依刘珊苗雨润任炜杰王振忠白昀陈欢钱莺娟贾红吴晓东冯志新郑龙三南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部细菌学重点实验室江苏南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 中国动物卫生与流行病学中心/国家非洲猪瘟参考实验室山东青岛266000 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

旨在建立可以检测非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pK205R抗体的血清学检测方法。基于杆状病毒表达系统构建重组杆粒BacmidpK205R,以纯化的pK205R蛋白为包被抗原,优化各项反应条件,建立间接ELISA抗体检测方法,验证方法的特异性、灵敏性、... 详细信息

旨在建立可以检测非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pK205R抗体的血清学检测方法。基于杆状病毒表达系统构建重组杆粒BacmidpK205R,以纯化的pK205R蛋白为包被抗原,优化各项反应条件,建立间接ELISA抗体检测方法,验证方法的特异性、灵敏性、重复性,并对临床血清样品进行检测。结果显示:pK205R蛋白可以与ASFV阳性血清发生发应,ELISA方法的抗原包被浓度为50 ng/孔,4℃过夜包被,封闭液为2%牛血清白蛋白(BSA),37℃封闭1 h,待检血清以5%脱脂乳进行1∶200稀释,37℃孵育0.5 h;二抗工作浓度为1∶5000,37℃孵育0.5 h,37℃下显色10 min;该方法的阳性临界值为0.186(≥0.186为阳性,<0.186为阴性),且具有良好的特异性、灵敏性、可重复性,与商品化试剂盒符合率为79.92%。本研究成功建立pK205R非洲猪瘟间接ELISA抗体检测方法,为进一步优化和研制非洲猪瘟抗体的快速检测试剂盒提供了参考。

关键词：非洲猪瘟病毒 pK205R蛋白间接ELISA 杆状病毒表达

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米尔贝肟抑制非洲猪瘟病毒体外复制作用的研究

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病毒学报 2025年第2期 561-570页

作者：齐传翔张永强王振忠郑龙三李金明王志亮吴晓东钱莺娟南京农业大学三亚研究院南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种急性、烈性猪传染病，感染猪死亡率可达100%，目前尚无有效的商品化疫苗或治疗药物。本研究发现，米尔贝肟（Milbemycin Oxime,MO... 详细信息

非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种急性、烈性猪传染病，感染猪死亡率可达100%，目前尚无有效的商品化疫苗或治疗药物。本研究发现，米尔贝肟（Milbemycin Oxime,MO）可在体外抑制ASFV复制，进一步通过CCK-8、细胞ELISA、Western blot和时间-添加（Time-of-addition）实验，探究了MO对ASFV的抑制作用。结果表明，MO在猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中的半数细胞毒性浓度（CC50）为9.356μM，半数病毒抑制浓度（IC50）为1.935μM;Western blot及RT-qPCR实验结果表明，MO能够显著抑制PAMs内ASFV-p72蛋白和mRNA表达；转录组测序分析发现，ASFV感染显著激活PAMs中IFIT2等免疫反应相关基因表达；MO单独处理则可显著下调PAMs内IL-1β、IL-1α等NOD样受体信号通路基因；而MO与ASFV共同处理后，PAMs内IFIT2、IFIT3等免疫反应相关基因被显著上调，而IL-1β、IL-18等NOD样受体信号通路中部分基因表达均被显著下调。进一步使用RT-qPCR实验验证发现，MO可显著下调ASFV感染PAMs中的IL-1β、Caspase-1等基因的mRNA表达水平，提示MO可能通过促进细胞免疫反应应答启动，延缓ASFV诱导炎症导致的细胞死亡，最终发挥抑制ASFV复制效果。本研究为ASF疫情防控药物提供了候选靶标和理论研究基础。

关键词：非洲猪瘟病毒米尔贝肟抗病毒转录组测序

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磷酸化修饰对山豆根多糖抗Ⅰ型鸭肝炎病毒效果的影响

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南京农业大学学报 2021年第2期44卷 322-330页

作者：何淼张宝康粟灵琳杜红旭明珂白景英刘家国王德云武毅南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏南京210095

[目的]山豆根多糖(Bush Sophora Root polysaccharide,BSRPS)具有良好的抗病毒作用,且硫酸化修饰可明显增强其抗病毒作用,但硫酸化修饰污染大,操作危险。本试验拟探究多聚磷酸盐法修饰对BSRPS抗病毒活性的影响。[方法]通过多聚磷酸盐法... 详细信息

[目的]山豆根多糖(Bush Sophora Root polysaccharide,BSRPS)具有良好的抗病毒作用,且硫酸化修饰可明显增强其抗病毒作用,但硫酸化修饰污染大,操作危险。本试验拟探究多聚磷酸盐法修饰对BSRPS抗病毒活性的影响。[方法]通过多聚磷酸盐法对BSRPS进行修饰,观察其理化性质并采用傅里叶红外光谱法分析其结构,通过MTT法和PCR法测定其体外抗Ⅰ型鸭肝炎病毒(duck hepatitis virusⅠ,DHAV-1)感染细胞的活性和对病毒增殖的影响,同时比较修饰前后山豆根多糖对DHAV-1感染雏鸭的保护作用。[结果]修饰后药物的理化性质变化及红外光谱结果表明,BSRPS经磷酸化修饰制备出pBSRPS,BSRPS和pBSRPS为500和15.63μg·mL-1时最大病毒抑制率分别达53.66%和57.87%,且pBSRPS抑制DHAV-1复制的作用也明显强于BSRPS(P<0.05)。2种药物均能显著提高DHAV-1感染雏鸭的存活率,减轻雏鸭肝脏的炎性渗出和坏死,提高受感染雏鸭肝脏的抗氧化酶(SOD、CAT)活性,减少抗氧化物质(GSH)的消耗和氧化产物(MDA)的积累,显示出良好的肝保护和抗氧化作用。[结论]山豆根多糖磷酸化修饰可以更有效提高其对鸭病毒性肝炎的治疗效果,达到磷酸化修饰的效果。

关键词：鸭肝炎病毒山豆根多糖磷酸化修饰抗病毒氧化应激

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链球菌神经氨酸酶的作用机制及酶活性的测定技术

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微生物学报 2019年第3期59卷 433-441页

作者：范玉凤刘广锦南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

神经氨酸酶不仅存在于流感病毒,在细菌中也有分布。细菌的神经氨酸酶可裂解宿主体内糖结合物末端的神经氨酸残基,有助于细菌实现在宿主体内的定殖、穿透和扩散,是细菌重要的毒力因子之一。链球菌是自然界广泛存在的人畜共患的病原菌,在... 详细信息

神经氨酸酶不仅存在于流感病毒,在细菌中也有分布。细菌的神经氨酸酶可裂解宿主体内糖结合物末端的神经氨酸残基,有助于细菌实现在宿主体内的定殖、穿透和扩散,是细菌重要的毒力因子之一。链球菌是自然界广泛存在的人畜共患的病原菌,在多种链球菌中均可检测出神经氨酸酶。肺炎链球菌的神经氨酸酶研究最为透彻,该菌可产生3种神经氨酸酶(NanA,NanB,NanC),NanA不但可以发挥酶的催化作用,分解唾液酸残基,暴露细菌的黏附受体,还能不依赖酶活基团,辅助细菌感染宿主细胞;NanB催化后产物可作为细菌的碳源;NanC可辅助细菌入侵脑部。在无乳链球菌和猪链球菌中,神经氨酸酶的活性一直未得到确切的验证,可能是由于它们的荚膜均含有神经氨酸,所以其神经氨酸酶的活性逐渐在进化中丧失。另外一些链球菌,例如化脓链球菌和C、G、L群链球菌,其神经氨酸酶的底物偏好相近,均对唾液类黏蛋白的催化活性较强,利于链球菌在含唾液类黏蛋白的组织中扩散。在口腔链球菌和血链球菌中,神经氨酸酶破坏血液成分中的神经氨酸链。由此可见,神经氨酸酶的特异性催化作用与链球菌在宿主体内的定植部位密切相关。此外,随着科技的发展,对神经氨酸酶的活性检测,也由早期的硫代巴比妥法,转为现在的荧光值和吸光度的测定,更为便捷和敏感。本文旨在对链球菌的神经氨酸酶的作用机制、与毒力关系及酶活测定方法等研究进展作一综述,为从事相关研究的科学工作者提供参考。

关键词：链球菌神经氨酸酶致病性酶活性

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新型氯霉素化学发光芯片免疫检测方法的建立及应用

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分析化学 2018年第10期46卷 1581-1587页

作者：任帅丁乔棋李丽邵漫雨宋素泉闫丽萍南京农业大学动物医学院南京农业大学教育部动物健康和食品安全国际联合实验室南京农业大学江苏省动物免疫工程实验室江苏省陆生野生动物疫源疫病检测中心

采用氯霉素（CAP）全抗原CAP-HS-BSA免疫新西兰兔,获得抗CAP多克隆抗体,测得效价为2×10～5,此抗体与CAP结构类似物的交叉反应率均小于0.01%,特异性良好。在此基础上,分别建立了特异性检测氯霉素残留的间接竞争酶联免疫吸附法（ic-E... 详细信息

采用氯霉素（CAP）全抗原CAP-HS-BSA免疫新西兰兔,获得抗CAP多克隆抗体,测得效价为2×10～5,此抗体与CAP结构类似物的交叉反应率均小于0.01%,特异性良好。在此基础上,分别建立了特异性检测氯霉素残留的间接竞争酶联免疫吸附法（ic-ELISA）和基于iPDMS膜的化学发光芯片免疫检测法,并用于实际牛奶样品中CAP的检测。建立的ic-ELISA法的半数抑制浓度(IC50)为12.9 ng/mL,线性检测范围(IC20IC80)为0.8～250.0 ng/mL,检出限(IC10)为0.1 ng/mL,回归方程B/B0=-0.2028lg CCAP+0.7281（R2=0.9926）。牛奶样品中加标回收率为81.8%97.9%,相对标准偏差（RSD）小于10%。建立的化学发光芯片免疫检测方法的半数抑制浓度为263.0 ng/mL,线性范围(IC20IC80)为1～5000 ng/mL之间,检出限(IC10)为1 ng/mL,回归方程B/B0=0.1781 lg CCAP+0.9318（R2=0.9891）,牛奶中CAP的加标回收率为77.0%100.5%,RSD<15%。

关键词：氯霉素多克隆抗体间接竞争酶联免疫分析化学发光芯片免疫

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