检索结果-内蒙古大学图书馆

畜牧与兽医 2024年第3期56卷 62-68页

作者：张财盛陈欢司安琪赵普齐传翔钱莺娟郑龙三戴建君南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部细菌学重点实验室江苏南京210095

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原。本研究通过CCK-8、细胞ELISA、Western blot、时间过程分析、药物抑制病毒吸附和入胞试验,探究了依福地平对PEDV的抑制作用。结果表明,依福地平在2... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是猪流行性腹泻(PED)的病原。本研究通过CCK-8、细胞ELISA、Western blot、时间过程分析、药物抑制病毒吸附和入胞试验,探究了依福地平对PEDV的抑制作用。结果表明,依福地平在20μmol/L浓度范围内,对Vero-E6和Marc-145细胞毒性较低;Western blot结果表明,依福地平能够显著降低宿主细胞中PEDV-N蛋白水平,主要抑制PEDV感染的入胞阶段。研究还发现,依福地平能抑制Ⅰ型单纯疱疹病毒和猪伪狂犬病毒感染宿主细胞,是一类潜在的广谱抗病毒药物。

关键词：猪流行性腹泻病毒依福地平病毒入胞广谱抗病毒效应

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非洲猪瘟病毒蛋白pS183L的原核表达及多克隆抗体制备

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畜牧与兽医 2025年第2期57卷 112-117页

作者：余群邹艳丽陈欢刘珊苗雨润任炜杰王振忠何佳依高晓宇钱莺娟吴晓东郑龙三南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部细菌学重点实验室江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心/国家非洲猪瘟参考实验室山东青岛266000

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pS183L的多克隆抗体。根据公布的毒株ASFV China/2018/Anhui XCGQ基因序列设计引物,酶切连接法构建重组质粒pET-28a-S183L;经鉴定成功的质粒转化大肠杆菌Rosetta,诱导表达后经镍柱亲和层析纯化后... 详细信息

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)非结构蛋白pS183L的多克隆抗体。根据公布的毒株ASFV China/2018/Anhui XCGQ基因序列设计引物,酶切连接法构建重组质粒pET-28a-S183L;经鉴定成功的质粒转化大肠杆菌Rosetta,诱导表达后经镍柱亲和层析纯化后获得重组蛋白pS183L,免疫小鼠并制备抗pS183L的多克隆抗体。通过ELISA鉴定多克隆抗体效价大于1∶128000;Western blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明,该多克隆抗体能识别293T和PK15细胞外源表达蛋白及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)内源表达蛋白。综上,本研究成功制备抗pS183L多克隆抗体,为深入研究ASFV pS183L的功能提供了关键生物材料。

关键词：非洲猪瘟病毒 pS183L 多克隆抗体

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非洲猪瘟病毒CP312R蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

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畜牧与兽医 2025年第4期57卷 101-106页

作者：司安琪王淑娟张永强王筱真任炜杰郑龙三包静月王志亮南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部细菌学重点实验室江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心/国家非洲猪瘟参考实验室山东青岛266032

为了深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV)CP312R蛋白的生物学特性,为血清学诊断技术研究和疫苗研发提供材料,制备了CP312R蛋白的单克隆抗体。将原核表达质粒pGEX-6p-CP312R转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)细胞中,用IPTG诱导CP312R蛋白表达并纯化... 详细信息

为了深入研究非洲猪瘟病毒(ASFV)CP312R蛋白的生物学特性,为血清学诊断技术研究和疫苗研发提供材料,制备了CP312R蛋白的单克隆抗体。将原核表达质粒pGEX-6p-CP312R转化至大肠杆菌感受态BL21(DE3)细胞中,用IPTG诱导CP312R蛋白表达并纯化,利用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定重组蛋白表达产物的抗原性,用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,在进行4次免疫后,取加强免疫后的小鼠脾脏进行细胞融合,经阳性克隆筛选后,获得了2株能够稳定分泌抗CP312R蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞。通过Western blot和间接免疫荧光(IFA)等试验对所获得的单克隆抗体的特异性进行鉴定,Western blot结果显示,制备的2株单克隆抗体均能与CP312R蛋白发生特异性反应;IFA结果显示,2株单克隆抗体均能与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞(PAM)产生特异性绿色荧光。综上,本研究制备的2株单克隆抗体,为非洲猪瘟血清学诊断方法及疫苗的研究奠定了基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 CP312R蛋白单克隆抗体原核表达

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两性霉素B对猪流行性腹泻病毒入胞的抑制作用研究

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畜牧与兽医 2023年第2期55卷 73-79页

作者：赵普陈欢张财盛明鑫钱莺娟戴建君郑龙三南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业部细菌学重点实验室/江苏省外国专家工作室江苏南京210095

通过测定两性霉素B(amphotericin B,AmpB)的细胞毒性、半数抑制浓度以及利用Western blot、间接免疫荧光、空斑形成、内吞等试验方法探究AmpB对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的抑制作用及其分子机制。结果显示:20μmol/L浓度范围内,AmpB对... 详细信息

通过测定两性霉素B(amphotericin B,AmpB)的细胞毒性、半数抑制浓度以及利用Western blot、间接免疫荧光、空斑形成、内吞等试验方法探究AmpB对猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染的抑制作用及其分子机制。结果显示:20μmol/L浓度范围内,AmpB对Vero-E6和Marc145细胞毒性极低;在Vero-E6细胞,AmpB对PEDV HLJBY和CV777毒株的半数抑制浓度(IC_(50))分别为0.5和0.3μmol/L,在Marc145细胞,AmpB对HLJBY和CV777的IC_(50)均为0.3μmol/L;AmpB处理几乎能阻断病毒感染细胞;AmpB主要抑制PEDV入胞和细胞巨胞饮作用。本研究为研制抑制PEDV或广谱抑制冠状病毒药物提供了新线索。

关键词： PEDV 两性霉素B 病毒入胞巨胞饮

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波形蛋白对H9N2亚型AIV复制的影响研究

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畜牧与兽医 2022年第4期54卷 93-101页

作者：卢安然殷贵虎黄翔宇黄静雯胡嘉宁蔡怡秦冯秀丽南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室江苏南京210095

为研究波形蛋白(vimentin)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,构建了真核表达载体FLAG-vimentin,并采用Western blot技术验证FLAG-vimentin重组载体和病毒NP蛋白的表达情况,用荧光定量PCR技术检测病毒HA基因水平。同时,设计合成siRNA... 详细信息

为研究波形蛋白(vimentin)对H9N2亚型禽流感病毒(AIV)复制的影响,构建了真核表达载体FLAG-vimentin,并采用Western blot技术验证FLAG-vimentin重组载体和病毒NP蛋白的表达情况,用荧光定量PCR技术检测病毒HA基因水平。同时,设计合成siRNA,敲低内源性vimentin,检测其对病毒HA基因表达水平的影响。构建原核表达载pCold I-vimentin,蛋白纯化后孵育细胞,采用Western blot、荧光定量PCR技术检测病毒的蛋白表达和基因水平的变化。结果证实,H9N2亚型AIV感染FLAG-vimentin重组载体转染的Hela细胞12 h时,病毒NP蛋白表达减少;而在感染24和36 h时,病毒NP蛋白表达上升。荧光定量PCR结果亦显示,在AIV感染后12 h时,HA基因表达水平明显降低。siRNA敲低Hela细胞内源性vimentin后,H9N2亚型AIV的HA基因表达水平在病毒感染12 h时明显升高,24 h时差异较小,36 h时有所升高。纯化后的vimentin重组蛋白孵育细胞,在病毒感染36 h时,H9N2亚型AIV的NP蛋白表达显著被抑制。荧光定量PCR结果亦证实病毒HA基因在AIV感染后36 h时表达水平明显降低。上述结果表明,H9N2亚型AIV在人源Hela细胞上的早期复制中,vimentin能起到一定程度上的抑制作用,且其重组表达蛋白孵育细胞能够阻断H9N2亚型AIV对细胞的感染,为深入研究vimentin抗病毒复制的机制提供了重要的试验依据,同时为开展抗H9N2亚型AIV的药物研发提供了参考。

关键词：波形蛋白 H9N2亚型AIV 重组蛋白表达病毒基因表达小干扰RNA

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非洲猪瘟病毒p54蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析

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中国动物传染病学报 2023年第4期31卷 164-169页

作者：敖清莹钟秋萍史馨瑾魏常青刘英楠廖欣欣谢振华钱莺娟郑龙三陈鸿军南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业农村部细菌学重点实验室南京210095 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白由晚期基因E183L编码,是主要的结构蛋白之一。为了获得免疫原性强的p54蛋白,本研究将E183L基因克隆至pFastBac1载体中,取1μg重组质粒转座DH10Bac感受态细菌,经三轮蓝白斑筛选后,获得重组Bacmid-p54。将提取的... 详细信息

非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白由晚期基因E183L编码,是主要的结构蛋白之一。为了获得免疫原性强的p54蛋白,本研究将E183L基因克隆至pFastBac1载体中,取1μg重组质粒转座DH10Bac感受态细菌,经三轮蓝白斑筛选后,获得重组Bacmid-p54。将提取的Bacmid-p54质粒DNA转染Sf9细胞,出现明显病变后,收获细胞培养上清,在正常Sf9细胞中传三代,获得的杆状病毒命名为rBac-P54。利用SDS-PAGE检测rBac-P54感染后昆虫细胞的蛋白表达情况,并通过间接免疫荧光(IFA)和Western-blot鉴定p54蛋白的免疫原性。结果显示,在感染的Sf9细胞中,p54蛋白能获得高效表达,并可被ASFV阳性血清特异性识别。这表明杆状病毒系统表达的p54蛋白具有良好的免疫原性,为后续开展非洲猪瘟血清学诊断和p54功能研究奠定基础。

关键词：非洲猪瘟病毒 p54蛋白昆虫细胞表达系统免疫原性

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BTV和PPRV双重荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2022年第3期52卷 285-291页

作者：勾倩倩杜吉革李启红李倩琳赵洋钱莺娟印春生郑龙三南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095 中国兽医药品监察所北京100081

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的快速检测方法,本研究选取蓝舌病病毒的NS3基因和小反刍兽疫病毒的N基因作为靶基因,参照GenBank上公布的两种基因序列,通过序列比对后选取一段保守性较高的区域,利用Beaco... 详细信息

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)的快速检测方法,本研究选取蓝舌病病毒的NS3基因和小反刍兽疫病毒的N基因作为靶基因,参照GenBank上公布的两种基因序列,通过序列比对后选取一段保守性较高的区域,利用Beacon designer 8设计引物和探针并优化反应体系及反应条件,建立了双重荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,该方法检测BTV和PPRV阳性质粒标准品的最低检出量分别为1.7 copies/μL和1.2 copeis/μL;与山羊痘病毒、羊口疮病毒、口蹄疫病毒、羊腐败性梭菌、布氏杆菌及弓形虫无交叉反应,具有良好的特异性;其组间重复性和组内重复性的变异系数均小于2%,表明该方法具有较好的重复性。结果表明,建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法适用于BTV和PPRV的快速检测。

关键词：蓝舌病病毒小反刍兽疫病毒双重荧光定量RT-PCR

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蓝舌病病毒小反刍兽疫病毒羊口疮病毒和山羊痘病毒多重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

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中国兽医科学 2022年第12期52卷 1510-1517页

作者：勾倩倩杜吉革朱真陈小云赵辉赵洋钱莺娟印春生中国兽医药品监察所北京100081 南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(CaPV)的方法,基于TaqMan探针技术,分别以NS3、N、F1L和P32为靶基因设计特异性探针和引物。以特异性引物扩增目的基因并构建重组质粒标准... 详细信息

为建立一种能够同时检测蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)和山羊痘病毒(CaPV)的方法,基于TaqMan探针技术,分别以NS3、N、F1L和P32为靶基因设计特异性探针和引物。以特异性引物扩增目的基因并构建重组质粒标准品。通过优化反应体系建立多重荧光定量PCR检测方法,并用此方法检测临床样品。结果显示,该多重荧光定量PCR标准曲线呈线性关系,对BTV、PPRV、ORFV和CaPV的扩增效率分别为100%、91%、91%、95%;该方法具有较高的灵敏性和特异性,对BTV、PPRV、ORFV和CaPV阳性质粒的最低检出量分别为17、12、8和9 copies/μL,与口蹄疫病毒、腐败梭菌、布鲁菌及弓形虫无交叉反应;其重复性较好,组间变异系数和组内变异系数均小于5%。对232份样品进行检测,用该多重荧光定量PCR分别检出9份BTV、3份PPRV、3份CaPV和24份ORFV阳性样品,而用常规PCR分别检出7份BTV、3份PPRV、0份CaPV、12份ORFV阳性样品。综上,该方法能够同时检测BTV、PPRV、ORFV和CaPV,可用于羊病的鉴别诊断、流行病学调查和疫病防控。

关键词：蓝舌病病毒小反刍兽疫病毒羊口疮病毒山羊痘病毒多重荧光定量PCR

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兔出血症病毒1、2型双重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立和应用

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江苏农业科学 2023年第18期51卷 40-44页

作者：王冠萱陈萌萌仇汝龙范志宇胡波宋艳华魏后军葛雷徐为中王芳钱莺娟江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程重点实验室江苏南京210014 南京农业大学动物医学院/教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室/农业农村部动物细菌学重点实验室江苏南京210095

兔出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是由兔出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的欧洲兔(Oryctolagus cuniculus)的急性致死性传染性疾病。RHDV属于杯状病毒科(Calicivirus)兔病毒属(Lagovirus)。目前兔出血症病毒1型(GI.1)和兔出血症病毒2型(GI.2)2种基因型均有在我国流行。为了更好地进行流行病学调查、实时监测兔出血症发展趋势和临床诊断,建立了一种检测RHDV1型和RHDV2型病原的快速、简单、特异且敏感的Taq Man实时PCR。结果显示,稀释度为1×10^(8)~1×10^(4) copies/μL标准品建立的标准曲线有良好的线性关系,决定系数r^(2)为0.999;该方法对RHDV1型和RHDV2型具有高度特异性,与兔多杀性巴氏杆菌、兔支气管败血波氏菌等其他病原没有任何交叉反应;检测灵敏度为100~1000 copies/μL;组内和组间变异系数在0.01%~1.61%之间。用该方法对60份临床肝脏样品和52份鼻肛拭子样本进行检测,结果显示,RHDV检出率为70.5%,敏感性显著高于普通RT-PCR方法(51%)。因此,该方法能够同时检测RHDV1型和RHDV2型,可用于鉴别诊断兔出血症病毒。

关键词：兔出血症病毒1型兔出血症病毒2型双重TaqMan qPCR

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非洲猪瘟病毒p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法的建立

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中国兽医科学 2024年第11期54卷 1443-1450页

作者：何佳依邹艳丽王燕刘珊苗雨润任炜杰王振忠白昀陈欢贾红郑龙三吴晓东冯志新钱莺娟南京农业大学动物医学院教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室农业部动物细菌学重点实验室江苏南京210095 中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室山东青岛266032 江苏省农业科学院兽医研究所江苏南京210014 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

为建立一种可靠、快速的血清学检测方法,以非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原,建立了一种双抗原间接ELISA方法,用于检测ASFV抗体。结果表明,该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪... 详细信息

为建立一种可靠、快速的血清学检测方法,以非洲猪瘟病毒(ASFV)结构蛋白p30和非结构蛋白pK205R作为包被抗原,建立了一种双抗原间接ELISA方法,用于检测ASFV抗体。结果表明,该方法与伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒和猪瘟病毒等常见猪源病原阳性血清无交叉反应;对ASFV阳性血清的敏感性能达到1∶12800;批内变异系数为7.95%,批间变异系数为9.18%,均小于10%。利用该方法与***商品化ELISA试剂盒分别检测130份临床猪血清,其阳性符合率为92.19%,阴性符合率为86.36%,总符合率为89.23%。综上所述,成功建立了ASFV p30和pK205R双抗原间接ELISA检测方法,为检测猪血清中ASFV特异性抗体提供了新的技术支持。

关键词：非洲猪瘟病毒 p30蛋白 pK205R蛋白间接ELISA

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