检索结果-内蒙古大学图书馆

中国预防兽医学报 2018年第4期40卷 275-278页

作者：李旭勇李玉保刘文强马树杰崔鹏飞孙香雪潘玉迪陈化兰郭晶聊城大学农学院山东聊城252000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为研究2016年在活禽交易市场鸭体内分离的2株H6亚型禽流感病毒(AIV)[分别是A/duck/Jiangxi/88/2016(H6N6)(简称DK/88/16)和A/duck/Jiangxi/219/2016(H6N2)(简称DK/219/16)]分子特征及遗传进化规律,本实验对其进行了全基因组扩增和测序,并进行了遗传进化分析。结果显示,2株病毒间HA基因同源性较低,仅为94.5%,但与我国近年分离的H6亚型病毒株保持较高同源性。DK/88/16和DK/219/16的NA基因分别与我国近年流行的流感病毒N6和N2基因保持较高同源性。对2株病毒的内部基因分析显示,其内部基因的来源较为复杂,其中DK/88/16的内部基因PA来源于我国最近流行的H5N2或H5N6病毒,显示该株病毒为新的重组病毒。对2株病毒的分子特征分析显示,除M1蛋白的30和215位点及NS1蛋白的42位点具有增强病毒对小鼠致病力的分子特征外,其余均保持低致病力分子特征。以上结果表明,H6N2和H6N6亚型AIV在我国鸭群中持续存在,并不断的遗传重组,需要进行持续的流行病学监测。

关键词：禽流感病毒 H6亚型基因遗传分析

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鸡传染性贫血病毒VP3基因的原核表达及抗血清制备

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黑龙江畜牧兽医 2019年第13期 7-10,172页

作者：孙芬芬高玉龙潘伟王笑梅徐州医科大学形态学实验教学中心江苏徐州221004 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽免疫抑制病科技创新团队哈尔滨150001 徐州医科大学病原生物学与免疫学教研室/江苏省免疫与代谢重点实验室江苏徐州221004

为了研究鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)VP3蛋白与病毒自身蛋白之间的相互作用,需对该蛋白进行原核表达制备相应兔源抗血清,试验通过提取CIAV M9905株基因组DNA,PCR扩增出VP3基因,构建重组质粒pET30a(+)-VP3,然后转化入... 详细信息

为了研究鸡传染性贫血病毒(Chicken anemia virus,CIAV)VP3蛋白与病毒自身蛋白之间的相互作用,需对该蛋白进行原核表达制备相应兔源抗血清,试验通过提取CIAV M9905株基因组DNA,PCR扩增出VP3基因,构建重组质粒pET30a(+)-VP3,然后转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,进一步通过IPTG诱导表达后用Ni-NTA亲和柱纯化获得融合蛋白,经SDS-PAGE分析后对融合蛋白进行乳化,免疫新西兰兔制备抗血清,并对其进行ELISA效价测定、Western-blot及IFA检测。结果表明:SDS-PAGE分析证实获得高纯度的重组蛋白VP3,大小约为22 ku,且其在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在;ELISA法检测制备的兔源抗VP3血清效价在1∶6 400以上;经Western-blot及IFA检测证实,VP3兔源血清可特异性结合Vero细胞表达的VP3蛋白。说明试验成功表达出CIAV VP3蛋白,制备的兔抗血清具有较好的特异性。

关键词：鸡传染性贫血病毒(CIAV) VP3蛋白蛋白相互作用原核表达纯化抗血清

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CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

CRISPR/Cpf1介导DDX21基因敲除载体活性检测

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第九届北京实验动物科学国际论坛

作者：鲁国涛张子博田璐李昂陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋... 详细信息

目的：旨在建立一种简单、快捷、高效、稳定的家鸡基因组编辑系统,为研究基因功能及模型建立奠定基础.方法：根据鸡DDX21基因序列设计选择4个gRNA,构建Cpf1/gRNA敲除表达载体并转染状态良好的DF-1细胞,经流式细胞仪收集表达红色荧光蛋白的阳性细胞,T7E1酶切法选择高效的敲除载体,TA克隆测序法评估其介导DDX21基因敲除的效率.结果：结果表明4个gRNA序列正确插入表达载体中;T7E1酶切结果显示Cpf1/gRNA1基因靶向敲除活性最高,TA测序分析发现其敲除活性为33.3％.结论：本研究初步建立了CRISPR/Cpf1系统介导的基因编辑技术,结果表明CRISPR/Cpf1能够稳定介导鸡DF-1细胞上的基因组编辑,这为进一步揭示DDX21基因功能、建立DDX21基因敲除的细胞系和鸡体模型提供了理论基础和科学依据.

关键词： CRISPR/Cpf1 基因敲除 DF-1细胞 DDX21

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鸡传染性支气管炎病毒ck/CH/LHB/121042毒株的分离鉴定及分子特征研究

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东北农业大学学报 2018年第2期49卷 55-63页

作者：马得莹姜磊许丽文刘亮亮韩宗玺东北农业大学动物科学技术学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室哈尔滨150001

鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV),严重威胁养禽业健康发展。近年来,我国不断出现新型IBV毒株及变异株,给传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)防控造成困难。监测研究报告显示,IBV感染与多种类型毒株有关,... 详细信息

鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV),严重威胁养禽业健康发展。近年来,我国不断出现新型IBV毒株及变异株,给传染性支气管炎(infectious bronchitis,IB)防控造成困难。监测研究报告显示,IBV感染与多种类型毒株有关,主要以LX4型为主。我国部分地区近期出现LX4型与TW型重组毒株,但鲜有TWⅡ毒株报道,其分子特征和抗原特性目前尚不清楚。通过分离河北省某鸡场疑似IB病鸡肾脏,获得传染性支气管炎病毒ck/CH/LHB/121042,基因组全长27 675 bp,共10个开放阅读框,基因组特征为5'UTR-1a-1b-S-3a-3b-3c-M-5a-5b-N-3'UTR,Spike protein裂解酶识别位点为"Arg-Arg-Phe-Arg-Arg"。病毒基因型鉴定为TWⅡ型,基因组遗传进化分析表明,该毒株与2010年河北分离株ck/CH/LHB/100801亲缘关系最近,推测具有相同进化来源。研究结果对于阐明病毒起源、预测未来产生新型毒株和重组毒株等具有重要意义。

关键词：鸡传染性支气管炎病毒分离全基因组序列

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肝脏特异性Pten基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

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兽医导刊 2019年第4期 210-212,242页

作者：刘宏扬黄丽张昆丽翁长江杨玉莹长江大学动物科学学院湖北荆州434025 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所基础免疫创新团队/兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

目的为研究抑癌基因Pten在肝脏中的生物学功能,利用Cre/Loxp基因敲除技术建立肝脏特异性Pten基因敲除小鼠模型。方法将Ptenflox/flox小鼠与肝脏特异性表达Alb-Cre重组酶的小鼠进行交配,对F1代小鼠进行鉴定,筛选出基因型为Ptenflox/+/Alb... 详细信息

目的为研究抑癌基因Pten在肝脏中的生物学功能,利用Cre/Loxp基因敲除技术建立肝脏特异性Pten基因敲除小鼠模型。方法将Ptenflox/flox小鼠与肝脏特异性表达Alb-Cre重组酶的小鼠进行交配,对F1代小鼠进行鉴定,筛选出基因型为Ptenflox/+/Alb-Cre的子代小鼠,将其与Ptenflox/flox小鼠进行交配,筛选出基因型为Ptenflox/flox/Alb-Cre的F2代小鼠,将Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠与Ptenflox/flox小鼠进行交配,获得F3代基因敲除小鼠,Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠为本实验所构建的肝脏特异性Pten基因敲除小鼠,Ptenflox/flox小鼠为对照小鼠。提取小鼠基因组DNA,通过PCR方法鉴定不同子代小鼠的基因型;提取小鼠肝脏、肺以及肾脏组织的总RNA和蛋白,利用Real-TimePCR和WesternBlot技术检测Pten基因在小鼠不同脏器中的mRNA和蛋白质表达水平。结果获得敲除小鼠基因型为Ptenflox/flox/Alb-Cre,和对照小鼠相比,Ptenflox/flox/Alb-Cre小鼠在肺和肾脏中Pten基因的mRNA水平及蛋白水平无明显变化,仅在肝脏中Pten水平显著低于Ptenflox/flox型小鼠。结论本研究利用Cre/Loxp技术成功构建了肝脏特异性Pten基因敲除小鼠,为在体内进一步研究Pten基因的功能提供了重要动物模型。

关键词： Pten Cre/Loxp 基因敲除肝脏特异

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利用重组慢病毒载体共表达Cas9-sgRNA构建TLR4基因敲除DF1细胞系

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中国兽医科学 2018年第8期48卷 958-964页

作者：庞中兵王伟刘赛宝王辉陈洪岩孟庆文中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR... 详细信息

Toll样受体4（TLR4）是TLRs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源TLR4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染禽DF1细胞。流式细胞仪分选、测序验证了在家禽DF1细胞系成功敲除了TLR4基因。然后利用GV393慢病毒表达载体,构建了CAG启动子启动Cas9的共表达载体Lv-CAG-Cas9-U6-sg RNA。通过转染、流式分选、培养单细胞克隆、靶基因组测序以及Western-blot检测,筛选获得1株TLR4基因敲除的DF1细胞系。结果表明,TLR4基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。本研究验证了共表达Cas9和sg RNA可以在禽源细胞系实现基因编辑,为利用重组慢病毒共表达Cas9和sg RNA策略探索构建敲除鸡模型研究奠定了理论基础和科学依据,也为研究禽TLR4基因功能、家禽天然免疫应答机制提供了细胞模型。

关键词： CRISPR/Cas9 DF1细胞系 TLR4 慢病毒表达载体基因敲除

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鸡OV启动子表达HA对禽流感病毒攻击提供完全保护

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中国生物工程杂志 2018年第7期38卷 67-74页

作者：李亚芳赵颖慧刘赛宝王伟曾为俊王金泉陈洪岩孟庆文新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室哈尔滨150069

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽... 详细信息

鸡卵清蛋白（ovalbumin,OV）基因5＇调控序列是构建鸡输卵管生物反应器的首选调控元件。以EGFP为报告基因,构建OV启动子真核表达载体,转染原代输卵管上皮细胞和CHO细胞,筛选得到1.1kb的高效OV启动子。构建1.1kb OV启动子表达H5N1亚型禽流感病毒HA蛋白真核表达载体pOV_（1.1k）-HA,转染CHO细胞。PCR、RT-PCR鉴定结果证明HA基因整合至CHO细胞基因组,并进行转录;SDS-PAGE、Western blot及HA试验结果证明HA蛋白在CHO细胞内的表达,并具有免疫反应性和血凝活性。以纯化的HA蛋白免疫4周龄SPF鸡,2周后加强免疫一次,加强免疫3周HI抗体水平为6.3log2;以10~6EID_（50）H5N1（A/Goose/Guangdong/1/96）亚型禽流感病毒鼻腔接种SPF鸡,免疫组100%存活,无排毒现象,对照组100%死亡。结果表明,筛选的1.1kb OV启动子可有效驱动HA蛋白表达,表达的HA蛋白免疫SPF鸡对禽流感病毒攻击提供完全保护;为鸡输卵管生物反应器表达保护性抗原和珍贵药物蛋白奠定了基础。

关键词：鸡卵清蛋白启动子 HA 禽流感病毒免疫保护输卵管生物反应器

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高致病性PRRSV感染对仔猪骨髓细胞影响的初步鉴定

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中国预防兽医学报 2018年第4期40卷 321-324页

作者：郑琳琳赵识非刘永刚张冲涂亚斌王刚蔡雪辉东北农业大学动物医学院黑龙江哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069

为了研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染对仔猪骨髓细胞的影响,本研究体外培养仔猪骨髓细胞后感染HP-PRRSV,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测骨髓细胞生长情况,并通过流式细胞分析技术检测病毒感染骨髓内细胞的类... 详细信息

为了研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染对仔猪骨髓细胞的影响,本研究体外培养仔猪骨髓细胞后感染HP-PRRSV,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测骨髓细胞生长情况,并通过流式细胞分析技术检测病毒感染骨髓内细胞的类型。实验结果显示:HP-PRRSV HuN4感染骨髓细胞72h后病毒感染率达到峰值,骨髓细胞存活率显著下降;流式细胞分析结果显示,HP-PRRSV感染的骨髓细胞为髓系前体细胞(SWC3~LSWC8^-)与巨噬细胞(SWC3~HSWC8^-)。本实验结果表明:HP-PRRSV在骨髓内除能够感染巨噬细胞外,还能感染髓系前体细胞,引起仔猪骨髓损伤并影响机体的正常免疫反应。本研究为进一步探究HP-PRRSV感染机体免疫抑制机制奠定了前期基础。

关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒骨髓细胞 SWC3 SWC8

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兼顾H5亚型高致病性禽流感病毒不同分支HA蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国预防兽医学报 2018年第7期40卷 639-642页

作者：徐海峰张莹刘琳曾显营谷琳琳熊晓宇王秀荣陈化兰中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069 东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030

为建立针对我国主要流行的H5亚型Clade7.2、Clade 2.3.2和Clade2.3.4.4分支高致病性禽流感病毒(HPAIV)不同流行株的免疫学快速检测方法,本研究将Clade7.2分支禽流感疫苗株CK/LN/S4092/2011(H5N1)(Re-7)、Clade2.3.4.4分支疫苗株DK/GZ/4/2013(H5N1)(Re-8)和Clade2.3.2.1e分支疫苗株DK/AH/S1246/14(H5N1)(Re-10)混合作为免疫原免疫4周龄BALB/c雌鼠,4次免疫后无菌取其脾细胞和骨髓瘤细胞(SP2/0)在聚乙二醇促融剂的作用下融合,通过间接ELISA方法及HI试验筛选获得6株能稳定分泌抗血凝素蛋白(HA)的单克隆抗体(MAb)杂交瘤细胞,分别命名为1B10、2A10、2C8、3E6、4G9和H2B1。经检测1B10、2A10、2C8和H2B1能够与当前AIV流行的分支反应,具有较好的广谱性。本研究为H5亚型AIV快速诊断技术的研发提供基础材料。

关键词： H5亚型禽流感病毒基因型分支单克隆抗体

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稳定表达犬SLAM受体的Vero细胞系的建立与应用

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内蒙古农业大学学报（自然科学版） 2018年第6期39卷 7-12页

作者：朱璐宇彭丽艳周雨霞王喜军步志高内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010018 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室哈尔滨150069

信号淋巴细胞活化分子是(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)和麻疹病毒(Measles virus,MV)等麻疹病毒属病毒的主要细胞受体,在病毒入侵细胞的过程中具有重要作用。为了构建稳定表... 详细信息

信号淋巴细胞活化分子是(Signaling lymphocyte activation molecule,SLAM)犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)和麻疹病毒(Measles virus,MV)等麻疹病毒属病毒的主要细胞受体,在病毒入侵细胞的过程中具有重要作用。为了构建稳定表达犬SLAM(d SLAM)受体的Vero细胞系,本研究将d SLAM基因克隆至真核表达质粒p CAGG-TK-neo中,在d SLAM基因3’端引入Flag标签序列作为分子标记,并在其下游引入9 nt的Linker序列、猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV) 2A基因以及红色荧光蛋白m Cherry基因,构建了重组质粒p CAGG-dSLAMFlag-mCherry。用该重组质粒转染Vero细胞,经G418压力筛选、红色荧光蛋白表达及表达绿色荧光蛋白的重组CDV(r20/8-EGFP)感染鉴定后,筛选到稳定表达d SLAM的细胞系。CDV野生型分离株JL17感染试验结果显示,JL17株在第15代次的Vero-dSLAM细胞上可良好生长,而在Vero细胞上不能形成细胞病变。结果表明,Vero-dSLAM细胞可稳定表达d SLAM,为CDV野生型毒株的分离和致病机制研究奠定了基础。

关键词：信号淋巴细胞活化分子 Vero细胞犬瘟热病毒病毒分离

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